探究亚硝基铁硫簇合物和过氧化氢反应的影响因素
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种探究亚硝基铁硫簇合物和过氧化氢反应的影响因素。
背景技术
亚硝基铁硫簇合物中一个经典的簇合物陆森黑盐(Roussin's black salt，简称RBS)因具有良好的水溶性和丰富的NO供体被广泛研究。根据已经有的理论基础我们知道，NO是一种半衰期短的多效分子，参与机体内的多种生理和病理反应。NO对缺氧酸性的肿瘤微环境(TME)有免疫抑制的影响。在多种TME调节方式中，已提出使用一氧化氮(NO)(一种具有钟形药理特性的内源性气体递质)作为一种有效且独特的方法。尽管低浓度NO可能会促进肿瘤生长，但在高浓度下会通过TME的调制杀死肿瘤。NO具有促瘤或抗瘤的作用，这种双重作用取决于NO生成的浓度、时间和效应部位，一定浓度的NO可产生细胞毒性进而达到杀死癌细胞的效果。此外，NO也被认为是通过校正的免疫功能障碍以及在实体瘤中增加T细胞浸润的免疫调节分子。NO通过下调肿瘤相关巨噬细胞因子(通过anti-F4/80标记)，上调抗肿瘤活性(通过anti-CD8标记)以及下调调节性T细胞(通过anti-Foxp3标记)达到治疗肿瘤的效果。这是NO在癌症免疫疗法方面通过激活T细胞功能发挥作用。除此以外已有报道发现NO可诱导高过氧化氢表达的细胞株AGS胃癌细胞中的c-jun和c-fos表达降低，抑制癌细胞生长。因此，NO输送系统的发展，以释放NO肿瘤内已吸引近几年极大的兴趣。
RBS作为水溶性的簇合物克服了非水溶材料改善水溶性的困扰；除此以外，它还具有耐高温稳定的性质。目前对RBS研究最多的领域是其作为NO供体，在1个RBS分子中就有7个NO供体，RBS也会在光促发或是氧化作用下释放出NO，其中光促释放NO已经有了比较完整的原理，但光照RBS产生NO时受组织穿透性的限制，对于氧化释放NO，尤其是在肿瘤微环境中通过化学动力学促进RBS中NO释放还有待研究。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种探究亚硝基铁硫簇合物和过氧化氢反应的影响因素。即研究了经典亚硝基铁硫簇合物陆森黑盐(Roussin's black salt，简称RBS)在肿瘤微环境中发生的变化。发现肿瘤微环境较低pH条件下促进了RBS的分解，同时能与高表达的H2O2发生氧化反应并促进ROS(·OH)和NO的释放并伴随碱式硫酸铁产生。其中NO对缺氧酸性的肿瘤微环境(TME)有免疫抑制的影响，可以研究其调控制肿瘤相关巨噬细胞因子等方面。除此以外NO对抗肿瘤活性的影响也可继续深入研究。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种探究亚硝基铁硫簇合物和过氧化氢反应的影响因素，在化学动力学条件下，反应方程式为：
RBS+H2O2→·OH+碱式硫酸铁+NO。
其中，化学动力学条件为：pH＝5.2，反应时间为50min，反应温度为37℃。
优选地，过氧化氢H2O2的浓度为0.05-0.1mmol/L。
实际上，RBS在模拟的肿瘤微环境中，在较低pH条件促进下，与H2O2能够发生氧化反应并促进ROS(·OH)和NO释放并伴随碱式硫酸铁产生。除了与肿瘤免疫相关的信号分子NO，在RBS与H2O2反应过程中伴随的其他的ROS也同样贡献到杀死癌细胞的作用。RBS与H2O2产生的碱式硫酸铁也可能为后续研究者提供靶向肿瘤治疗的研究方向。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明利用偏酸肿瘤微环境中内源性固有存在过表达的H2O2和RBS产生对肿瘤部位具有杀伤作用的ROS及NO，也克服了传统外源性光照RBS产生NO时，因组织对光的吸收，在光通过组织体时部分光能转换成热运动或者是在吸收组织体中分子的某种振动导致的能量衰弱，与近红外波段受组织穿透深度限制，从而研究了模拟肿瘤微环境中RBS对体外肿瘤微环境影响原理，为后续研究RBS如何对提高抗肿瘤免疫活性、如何抗肿瘤血管生成等方面提供了深入研究基础。故本发明为利用NO作为抗癌药物的研究者提供更多选择方法。
附图说明
图1为本发明的实施例1中RBS和H2O2反应过程示意图。
图2为本发明的实施例1中RBS和沉淀物中离子检测示意图。
图3为本发明的实施例1中沉淀物的EDS谱图。
图4为本发明的实施例1中沉淀物的对比红外谱图。
图5为本发明的实施例1中沉淀物的XRD示意图。
图6为本发明的实施例1中RBS和H2O2反应体系的pH变化对比示意图。
图7为本发明的实施例2中不同pH条件下，RBS的稳定性示意图。
图8为本发明的实施例2中不同pH条件下，RBS和H2O2反应示意图。
图9为本发明的实施例2中pH为5.2时，RBS和H2O2反应示意图。
图10为本发明的实施例2中不同时间下，RBS和H2O2响应的·OH释放图。
图11为本发明的实施例2中不同过氧化氢浓度下，RBS和H2O2响应的·OH释放图。
图12为本发明的实施例2中不同时间下，RBS和H2O2响应的NO释放图。
图13为本发明的实施例2中不同过氧化氢浓度下，RBS和H2O2响应的NO释放图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
探究RBS在模拟肿瘤微环境中反应机理如下：
沉淀物是RBS在模拟的高表达H2O2偏酸肿瘤微环境中的产物，产物的检测即为机理过程。
如图1所示，RBS+H2O2→ROS(·OH)+碱式硫酸铁+NO。
(1)产物中的离子检测
取适量沉淀物上清液于PE管中，加入少量二次水，然后依次加入适量KSCN溶液(检验Fe3+)，K4Fe(CN)6溶液(检验Fe3+)；BaCl2溶液(检验SO42-)。
实验结果与讨论：
图2中a、b为RBS溶液中分别加入KSCN溶液(检验Fe3+)，K4Fe(CN)6溶液(检验Fe3+)，均无变化，说明没有Fe3+释放。
图2中c、d、e为沉淀物上清夜(近无色)中分别加入KSCN溶液(变红，说明存在Fe3+)；加入K4Fe(CN)6溶液(变蓝，说明存在Fe3+)；加入BaCl2溶液(有白色沉淀产生，说明存在SO42-)。故说明RBS和H2O2反应后结构发生了分解，产生了Fe3+和SO42-。
(2)沉淀物的测试
(a)EDS(TEM)
实验条件：
取适量RBS于玻璃瓶中，加入1mL二次水，然后不断滴加30％的H2O2(过量)，直到反应停止，滤纸过滤得到橙色沉淀，沉淀超声分散在无水乙醇中(沉淀不溶于水及乙醇)，制样测试EDS。
实验结果与讨论：
如图3所示，从沉淀的EDS数据来看，反应后N元素含量明显降低，几乎不存在N元素，也可以进一步说明RBS和H2O2反应NO几乎释放完全。沉淀中确定含有Fe元素和S元素。O元素不确定沉淀中是否存在，影响因素较多。
(b)FT-IR
实验条件：
RBS与H2O2在二次水及pH＝5.2的NaAc-HAc缓冲溶液反应产物沉淀、RBS、Fe2(SO4)3与KBr以1:100比例研磨，烘干测试FT-IR。
实验结果与讨论：
如图4所示，沉淀和标准Fe2(SO4)3在3600-3200cm-1处的宽峰为—OH的缔合状态。1630cm-1处为—OH伸缩振动吸收峰。1414cm-1处为SO42-中O＝S＝O、S＝O特征伸缩振动，1135cm-1处为SO42-特征吸收峰。1069cm-1处为Fe-O-Fe特征吸收峰。609cm-1处为Fe-O拉伸振动峰。
(c)XRD
实验条件：
取适量RBS于玻璃瓶中，加入1mL二次水，然后不断滴加30％的H2O2(过量)，直到反应停止，静置，收集反应产物沉淀并取适量沉淀测XRD并与原料RBS的XRD进行对比。
实验结果与讨论：
如图5所示，XRD数据显示RBS及其与H2O2响应产物沉淀均为无定形。
(3)RBS与H2O2反应体系pH变化探究
实验条件：
RBS和H2O2分别在二次水和pH＝5.2溶剂体系反应，测试反应前后pH，以及反应后沉淀物的FT-IR。
实验结果与讨论：
如图6所示，pH试纸从左往右依次为单独的H2O2的pH，pH为5.2的NaAc-HAc中RBS和H2O2反应后pH，pH为5.2的NaAc-HAc的pH，二次水中RBS和H2O2反应后pH，二次水的pH。由此可以看出无论在二次水还是pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液中，RBS和H2O2反应后体系的pH在1-2的范围内。
另外，在反应过程中发现，二次水中反应速率大于缓冲溶液体系，可能是缓冲液中的醋酸根产生干扰，阻碍了反应的进行。
对比二次水、pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液体系产生沉淀的FT-IR，几乎无差别，为相同的反应产物。
对比反应产物沉淀、纯Fe2(SO4)3及标准碱式硫酸铁Fe4(OH)2(SO4)5的FT-IR谱图，在3400cm-1、1630cm-1、1100cm-1、1070cm-1、600cm-1和490cm-1处的吸收峰，与标准Fe2(SO4)3测定的FT-IR吻合。根据反应后体系pH显示，判断RBS和H2O2响应后的沉淀物为碱式硫酸铁。
实施例2：
(1)pH对RBS{NH4[(NO)7Fe4S3]}稳定性影响
实验条件：
配制以下待测溶液体系，通过UV-vis监测吸收，监测时间点为：0min、2min、4min、6min、8min、10min、20min、30min、40min、50min、60min和180min。最后用归一化吸收值对比避光下pH＝5.2及pH＝7.4的HAc-NaAc缓冲溶液中RBS稳定性。H2O为背景。
实验结果与讨论：
如图7所示，避光条件下，pH为5.2组的RBS在180min时候已经有20％分解。但在pH为7.4的条件下，RBS几乎没有分解，相同避光条件下比在H2O更稳定。这也初步解释了RBS和H2O2在pH为5.2条件比pH为7.4下更容易产生·OH。
(2)RBS对H2O2的响应探究
2.1避光下，不同pH条件下响应对比
实验条件：
以下3mL体系中，cTMB＝0.6mM，cRBS＝0.02436mM，c过氧化氢＝0.1mM；反应温度：37℃；反应时间：50min(避光)。
配制如下溶液，通过UV-vis监测吸收，H2O为背景。
实验结果与讨论：
如图8所示，选择在650nm特征吸收峰处(TMB和oxTMB显色特征峰)观察实验数据并分析。RBS对H2O2的响应在pH为5.2的条件下相对pH为7.4条件下更容易发生，在肿瘤偏酸微环境中更有利于此反应的发生。
2.2避光下，pH为5.2条件下响应对照
实验条件：
以下3mL体系中，cTMB＝0.6mM，cRBS＝0.02436mM，c过氧化氢＝0.1mM。
反应温度：37℃；反应时间：50min(避光)。
配制如下溶液，通过UV-vis监测吸收，H2O为背景。
实验结果与讨论：
如图9所示，在pH为5.2体系内，对照TMB+H2O2组，RBS+TMB组，RBS+TMB+H2O2组可以看出·OH产生排除了其他因素干扰，产生的原因归结于RBS对H2O2的响应。
2.3 H2O2与RBS响应的·OH释放
2.3.1随时间变化的·OH释放
实验条件：
以下3mL体系中，cRBS＝24μM，cTMB＝0.6mM，c过氧化氢＝0.1mM；反应温度37℃。
实验结果与讨论：
如图10所示，在RBS和H2O2响应时间变化过程中，伴随有·OH的不断释放增加。
2.3.2随H2O2浓度变化的·OH释放
实验条件：
H2O2浓度(0.05mM、0.10mM、0.15mM、0.40mM、0.80mM和1.00mM)；cTMB＝0.6mM，cRBS＝0.02436mM(每组总体积为3mL)；pH＝5.2，37℃；反应时间：50min。
实验结果与讨论：
通过UV-vis测定不同过氧化氢含量吸光度变化如图11：
随着H2O2浓度的增大，二者·OH的释放差距越来越明显。
2.4H2O2与RBS响应的NO的释放
2.4.1随时间变化的NO释放
实验条件：
以下3mL体系中，cRBS＝0.02436mM，c过氧化氢＝0.1mM。
反应温度：37℃；监测反应时间点：0min、30min、45min、60min和120min。配制如下溶液，通过UV-vis监测随时间变化540nm处(使用试剂盒后NO特征吸收峰)的吸收，扫96孔板空白为背景。
试剂盒使用方法：
①取出Griess Reagent I和II，使回复室温。
②用待测样品所用溶液稀释标准品(1-100μM)。
标准品的浓度取0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、100μM。
③按50μL/200μL，加入室温Griess Reagent I。
④按50μL/200μL，加入室温Griess Reagent II。
⑤540nm测定吸光度。
实验结果与讨论：
如图12所示，根据Griess Reagent原理，NO在体内或水溶液中极易氧化成NO2-，在酸性条件下，NO与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，该反应生成的产物浓度与NO2-浓度具有线性关系，在540nm处有最大吸收峰。下图即为配制标准NaNO2溶液测试的NO吸收标准曲线。
随着反应时间不断进行，各组产生的NO不断增加，并且还能看出存在H2O2比不存在H2O2情况下会有更多的NO释放。
2.4.2随H2O2浓度变化的NO释放
实验条件：
H2O2浓度(0mM、0.010mM、0.025mM、0.050mM、0.075mM、0.100mM、0.200mM、1.000mM)；cRBS＝0.02436mM(每组总体积为3mL)；pH＝5.2，37℃；反应时间：120min。
实验结果与讨论：
如图13所示，在避光条件有明显的NO释放，随着H2O2浓度增加，出现了以下的规律：
在0-0.1mM H2O2体系中，随H2O2浓度增加，NO释放量也不断增加，0.1mM H2O2有最大的NO释放量。
0mM H2O2：RBS几乎无NO释放
0-0.1mM H2O2：随H2O2浓度增加，NO释放量也不断增加，0.1mM H2O2有最大的NO释放量。
＞0.1mM H2O2：H2O2浓度继续增大后，NO释放量降低。
随着H2O2浓度的增加，NO释放减少，可能的原因是RBS与H2O2产生的·OH与释放的NO反应形成了一些活性氮氧化物，如：NO2－、N2O3、ONOO－(过氧亚硝基阴离子)等。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
