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抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合

2021-02-14 15:58:15

抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合

  技术领域

  本公开涉及抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合。

  背景技术

  这里的陈述仅是提供与本发明有关的背景信息,而不必然地构成现有技术。

  近年来,针对免疫细胞共抑制受体的免疫检查点治疗在肿瘤免疫治疗中取得了巨大进展,发现和验证新的共抑制性受体成为一个全球竞争性的热点。T细胞是免疫反应的关键介导者,T细胞的活化依赖TCR信号和共刺激信号。共刺激信号则是T细胞活化的限制信号,其功能失调参与自身免疫疾病的发生(Immunol Rev,2012,248:122-139;AutoimmunRev,2013,12:1171-1176)。TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)是新发现的位于NK细胞和T细胞表面的共抑制信号分子,与T细胞、NK细胞及树突状细胞DC等的功能调节密切相关。

  TIGIT基因位于人类第16号染色体,编码由244个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞膜外区长141个氨基酸,有1个免疫球蛋白V样结构域;跨膜区23个氨基酸;胞质区较短,有80个氨基酸,具有1个PDZ结合结构域和1个ITIM模体。TIGIT分子属于免疫球蛋白超家族IgSF的一员,其结构较为保守,多种哺乳动物中都发现了其同源分子,人类TIGIT分子与猴、狗和小鼠的TIGIT分子分别具有88%、67%和58%的同源性(Nat Immunol,2009,10(1):48-57)。

  TIGIT分子主要表达于T细胞和NK细胞表面(Nat Immunol,2009,10:48-57)。T细胞和静息记忆T细胞均低表达TIGIT,体外活化后表达上调(J Immunol,2012,188:3869-3875)。NK细胞表面TIGIT则有较高水平的表达(Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(42):17858-17863)。TIGIT是极具潜力的免疫治疗新靶点。已有研究表明特异性地阻断TIGIT的单克隆抗体,在动物模型中显示了显著的抗肿瘤效果(Martinet and Smyth2015)。目前,已有WO2009126688、WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2017053748、WO2017030823、WO2016106302、US20160176963、US20130251720等专利报道了TIGIT抗体。

  PD-l(程序性死亡分子1,programmed death-l)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体,参与到细胞的凋亡过程之中。PD-l属于CD28家族,与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23%的氨基酸同源性,但其表达却与CTLA不同,主要表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上。PD-1有两个配体,分别为PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)上,在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限,主要表达在抗原呈递细胞上,如活化的巨噬细胞和树突状细胞。

  PD-L1通过和PD-1及B7-1的结合抑制免疫系统,很多肿瘤细胞及肿瘤组织微环境的免疫细胞表达PD-L1。新的研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人类肿瘤组织中检测到高PD-L1蛋白的表达,且PD-L1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。

  抗PD-L1/PD-1单克隆抗体,它可通过阻断PD-L1/PD-1之间结合,最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫反应,从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。目前,国际上已有多种PD-1抑制剂获准上市,包括抗PD-1抗体,例如:Nivolumab(商品名Opdivo)、Pembrolizumab(商品名Keytruda);抗PD-L1抗体,例如:Atezolizumab(商品名Tecentriq)、Avelumab(商品名Bavencio)、Durvalumab(商品名Imfinzi),用于治疗黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤患者、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈部鳞癌、胃癌、肝癌、默克尔皮肤癌、以及所有微卫星不稳定的实体瘤等肿瘤。国内的抗PD-1抗体:特瑞普利单抗(君实生物)、信迪利单抗(信达生物)也已获准在中国上市,另外,卡瑞利珠单抗(SHR1210,恒瑞医药)、替雷利珠单抗(百济神州)也已递交药品上市申请。另外,WO2017084495A1公开了抗PDL-1抗体:HRP00052和HRP00049,其它专利文献WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2、WO2010089411A2、WO2015085847、EP3378871A1等也公开了多种抗PD-L1/PD-1单克隆抗体。

  另外,WO2015009856中公开PD-1轴结合拮抗剂和降低TIGIT表达或活性的药剂组合治疗癌症。但Chew等研究发现TIGIT抗体和PD-1抗体联用,能够促进CD8T细胞对HIV和黑色素瘤的杀伤功能,但这一效应随着对CD226的阻断而消失(Chew,Fujita et al.2016)。

  发明内容

  本公开提供抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病。

  一方面,本公开提供一种治疗与人TIGIT相关的疾病的方法,所述方法包括向受试者施用药物有效量的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及药物有效量的PD-1抑制剂,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:5所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:7所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:8所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:9所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:11所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:12所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:13所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:14所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂同时施用,或先后施用。

  一方面,本公开提供特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段联合PD-1抑制剂在制备治疗与人TIGIT相关的疾病中的用途,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含与如SEQ ID NO:5所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:7所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:9所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含与如SEQ ID NO:11所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含与如SEQ ID NO:13所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂同时施用,或先后施用治疗。

  另一方面,本公开提供作为药物的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:5所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:7所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:8所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:9所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:11所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:12所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:13所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:14所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,所述药物用于治疗与人TIGIT相关的疾病。在一些实施方式中,所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂同时施用或先后施用治疗。

  在一些实施方式中,其中前面任一所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  vi)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:15、16和17氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:18、19和20氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  vii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:21、22和23氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:24、25和26氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  viii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:27、28和29氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:30、31和32氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ix)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:33、34和35氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:36、37和38氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  x)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:39、40和41氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包分别含如SEQ ID NO:42、43和44氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

  在一些实施方式中,其中前面任一所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含:

  a)如SEQ ID NO:45或50所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的轻链可变区;

  b)如SEQ ID NO:51、54或55所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:52或53所示的轻链可变区;

  c)如SEQ ID NO:56、61、62或63所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:57、58、59或60所示的轻链可变区;

  d)如SEQ ID NO:64、67、68、69或70所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:65或66所示的轻链可变区;或

  e)如SEQ ID NO:71、75、76或77所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:72、73或74所示的轻链可变区。

  优选地,所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO:53所示的轻链可变区;或如SEQ ID NO:64所示的重链可变区和如SEQ ID NO:65所示的轻链可变区。

  在一些实施方式中,其中前面任一所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体为全长抗体,其包括人抗体恒定区;在一些实施方式中,所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体包含如SEQ ID NO:78所示的人抗体重链恒定区和/或如SEQ ID NO:79所示的人抗体轻链恒定区。

  在一些实施方式中,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体包含:

  f)如SEQ ID NO:83所示的重链,和如SEQ ID NO:82所示的轻链;

  g)如SEQ ID NO:85所示的重链,和如SEQ ID NO:84所示的轻链;

  h)如SEQ ID NO:87所示的重链,和如SEQ ID NO:86所示的轻链;

  i)如SEQ ID NO:89所示的重链,和如SEQ ID NO:88所示的轻链;或

  j)如SEQ ID NO:91所示的重链,和如SEQ ID NO:90所示的轻链。

  在一些实施方式中,其中所述PD-1抑制剂选自:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体。

  在一些实施方式中,其中所述PD-1抑制剂选自:Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗、HRP00052和HRP00049。

  在一些实施方式中,其中所述PD-1抑制剂选自卡瑞利珠单抗,所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体选自:h1707-02(重链如SEQ ID NO:83所示,轻链如SEQ ID NO:82所示)、h1711-04(重链如SEQ ID NO:91所示,轻链如SEQ ID NO:90所示)、h1709-10(重链如SEQ ID NO:87所示,轻链如SEQ ID NO:86所示)、h1708-04(重链如SEQ ID NO:85所示,轻链如SEQ ID NO:84所示)和h1710-01(重链如SEQ ID NO:89所示,轻链如SEQ ID NO:88所示)。

  在一些实施方式中,前面任一项所述的疾病,其中所述疾病为T细胞功能障碍性病症;在一些实施方式中,其中所述疾病为:肿瘤、免疫性疾病或感染性病症;在一些实施方式中,其中所述疾病为CD155阳性或PVR阳性的肿瘤、免疫性疾病或感染性病症;在一些实施方式中,其中所述肿瘤选自:头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌;在一些实施方式中,所述淋巴瘤选自:何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤,所述肺癌选自:非小细胞肺癌和小细胞肺癌,所述白血病选自:慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。

  另一些实施方式中,本公开提供一种药物组合物,其包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及PD-1抑制剂,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含与如SEQ ID NO:5所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:7所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:9所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含与如SEQ ID NO:11所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含与如SEQ ID NO:13所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,其中所述的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂直接混合、使用前混合或施用时在受试者体内混合。在一些实施方式中,所述药物组合物用于治疗肿瘤。另一些实施方式中,本公开提供一种药物组合,其包含包装插页,还包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂,所述包装插页包含关于将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段与PD-1抑制剂组合使用治疗肿瘤的说明书,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:5所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:6所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:7所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:8所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:9所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:10所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:11所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:12所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:13所示的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3具有相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别与序列SEQ ID NO:14所示的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3具有相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,所述药物组合物用于治疗肿瘤。

  另一些实施方式中,本公开提供一种试剂盒,其包含包装插页,还包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂,所述包装插页包含关于将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段与PD-1抑制剂组合使用治疗肿瘤的说明书,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  i)重链可变区包含与如SEQ ID NO:5所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  ii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:7所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iii)重链可变区包含与如SEQ ID NO:9所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  iv)重链可变区包含与如SEQ ID NO:11所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:12所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  v)重链可变区包含与如SEQ ID NO:13所示的重链可变区相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含与如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方式中,所述试剂盒用于治疗肿瘤。

  在一些实施方式中,前面任一项所述药物组合物或试剂盒单位剂量中可含有0.01至99重量%的特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段以及PD-1抑制剂;在一些实施方式中,药物组合物单位剂量中含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂的量为0.1-2000mg;在另外一些实施方式中,药物组合物单位剂量中含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂的量为1-1000mg。

  在一些实施方式中,前面任一所述药物组合物或试剂盒,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:

  k)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:15、16和17氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:18、19和20氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  l)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:21、22和23氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:24、25和26氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  m)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:27、28和29氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:30、31和32氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;

  n)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:33、34和35氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:36、37和38氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或

  o)重链可变区包含分别如SEQ ID NO:39、40和41氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:42、43和44氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

  在一些实施方式中,前面任一所述药物组合物或试剂盒,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段包含:

  p)如SEQ ID NO:45或50所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:46、47、48或49所示的轻链可变区;

  q)如SEQ ID NO:51、54或55所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:52或53所示的轻链可变区;

  r)如SEQ ID NO:56、61、62或63所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:57、58、59或60所示的轻链可变区;

  s)如SEQ ID NO:64、67、68、69或70所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:65或66所示的轻链可变区;或

  t)如SEQ ID NO:71、75、76或77所示的重链可变区,和如SEQ ID NO:72、73或74所示的轻链可变区。

  在一些实施方式中,前面任一所述药物组合物或试剂盒,其中所述特异性结合人TIGIT的单克隆抗体包含:

  u)如SEQ ID NO:83所示的重链,和如SEQ ID NO:82所示的轻链;

  v)如SEQ ID NO:85所示的重链,和如SEQ ID NO:84所示的轻链;

  w)如SEQ ID NO:87所示的重链,和如SEQ ID NO:86所示的轻链;

  x)如SEQ ID NO:89所示的重链,和如SEQ ID NO:88所示的轻链;或

  y)如SEQ ID NO:91所示的重链,和如SEQ ID NO:90所示的轻链。

  在一些实施方式中,前面任一所述药物组合物或试剂盒,其中所述PD-1抑制剂选自:抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体;优选的,所述PD-1抑制剂选自:Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗、HRP00052和HRP00049。

  在一些实施方式中,前面任一所述药物组合物或试剂盒,其中所述肿瘤选自:头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌;在一些实施方式中,所述淋巴瘤选自:何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤,所述肺癌选自:非小细胞肺癌和小细胞肺癌,所述白血病选自:慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。在一些实施方式中,所述肿瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤。在一些实施方式中,所述肿瘤选自CD155阳性或PVR阳性的肿瘤,在一些实施方式中,所述肿瘤与人TIGIT相关。

  附图说明

  图1:抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体对人T淋巴细胞白血病细胞系激活的影响实验结果。

  图2:抗TIGIT抗体与抗PD-1抗体联用对MC38荷瘤小鼠移植瘤的的影响;图2中,vsIgG(D22)列表示第22天时,各组相对于空白对照IgG组的P值,其中:*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001;;vs抗鼠PD-1抗体(D22)列表示第22天时,各组相对于抗鼠PD-1抗体组的P值,其中:#表示p<0.05;##表示p<0.01;###表示p<0.001)。

  发明详述

  术语

  为了更容易理解本公开,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

  本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

  本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白,完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将免疫球蛋白分为五类,或称为免疫球蛋白的同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别,又可分为不同的亚类,如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

  在本公开中,本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区,所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

  在本公开中,本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区,所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

  抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大,为可变区(Fv区);靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性,又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR或VL)和重链可变区(HCVR或VH)由3个CDR区和4个FR区组成,从氨基端到羧基端依次排列的顺序为:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3;重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些示范例中,所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3,HCDR1-3)。

  “单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体,即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变,这些变体通常以少量存在)之外,构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物(制剂)的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此,修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性,且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。例如,本公开的单克隆抗体可通过各种技术制备,所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。

  本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体。

  术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对抗原(例如人TIGIT)的单克隆抗体。制备时用TIGIT抗原注射试验对象,然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中,所述的鼠源TIGIT抗体或其抗原结合片段,可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。

  术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”,是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体,要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤,然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因,再根据需要克隆人抗体的恒定区基因,将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中,最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中,所述的TIGIT嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的TIGIT嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区,优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变、S228P)的IgG1、IgG2或IgG4变体。

  术语“人源化抗体(humanized antibody)”,包括CDR移植抗体(CDR-graftedantibody),是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架,即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分,从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得),以及在Kabat,E.A.等人,1991Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变,以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本公开一个优选的实施方案中,所述的TIGIT人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ IDNO:15-44;人的抗体可变区框架经过设计选择,其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列,人种系重链选自:(IGHV3-7*01和hjh2),(IGHV1-46*01和hjh4.1)和(IGHV1-69*02和hjh4.1)的组合序列,和人种系轻链选自:(IGKV1-39*02和hjk2.1),(IGKV1-39*01和hjk4.1)和(IGKV4-1*01和hjk4.1)的组合序列。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变(回复突变,即将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基),以保持活性。在本公开的其中一个实施方式中,其中,TIGIT人源化抗体的轻/重链可变区进行了回复突变设计,获得了优化的h1707、h1708、h1709、h17010、h17011人源化抗体的轻/重链可变区组合,具体见下表1-5,

  表1:h1707人源化抗体轻/重链可变区组合表:

  

  注:表中“h1707-02 V”表示h1707-H2重链可变区(如SEQ ID NO:50所示)和与h1707-L1轻链可变区(如SEQ ID NO:46所示)组成的轻/重链可变区对,其它依此类推。

  表2:h1708人源化抗体轻/重链可变区组合表:

  

  注:表中“h1708-04V”表示h1708-H1重链可变区(如SEQ ID NO:51所示)和h1708-L2轻链可变区(如SEQ ID NO:53所示)组成的轻/重链可变区对,其它依此类推。

  表3:h1709人源化抗体轻/重链可变区组合表:

  

  

  注:表中“h1709-10V”表示h1709-H2重链可变区(如SEQ ID NO:61所示)和h1709-L3轻链可变区(如SEQ ID NO:59所示)组成的轻/重链可变区对,其它依此类推。

  表4:h1710人源化抗体轻/重链可变区组合表:

  

  注:表中“h1710-01V”表示h1710-H1重链可变区(如SEQ ID NO:64所示)和h1710-L1轻链可变区(如SEQ ID NO:65所示)组成的轻/重链可变区对,其它依此类推。

  表5:h1711人源化抗体轻/重链可变区组合表:

  

  

  注:表中“h1711-04V”表示h1711-H4重链可变区(如SEQ ID NO:77所示)和h1711-L1轻链可变区(如SEQ ID NO:72所示)组成的轻/重链可变区对,其它依此类推。

  前述表1-5的人源化抗体的轻/重链可变区组合,其重链可变区可以与人抗体的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区(例如,包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变、S228P突变、F234A突变和L235A突变中的一个或更多个突变)的IgG1、IgG2或IgG4的变体)的氨基端连接成全长抗体重链,其轻链可变区可以与人抗体的κ、λ链或其变体的轻链恒定区的氨基端连接成全长抗体轻链。例如,轻/重链可变区组合h1707-02 V,其重链可变区h1707-H2(SEQ ID NO:50)与人抗体的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体(例如YTE突变或回复突变、S228P突变、F234A突变和L235A突变中的一个或更多个突变)的氨基端连接形成抗体的重链,轻链可变区h1707-L1(SEQ ID NO:46)与人抗体的κ、λ链恒定区或其变体氨基端连接形成抗体轻链,然后重链与轻链连接形成全长人源化抗体;在其中一个实施方式中,其中轻/重链可变区组合h1707-02 V,其重链可变区h1707-H2(SEQ ID NO:50)与如SEQ ID NO:78所示的IgG4变体恒定区的氨基端连接形成抗体的重链(如SEQ ID NO:83所示),其轻链可变区h1707-L1(SEQ ID NO:46)与人抗体的κ轻链恒定区的氨基端连接形成抗体轻链(如SEQ ID NO:82所示)。

  CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的TIGIT抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此,可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人TIGIT抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系,那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果,从而在结合中起着重要作用。

  在类似“具有3,2或1个氨基酸差异的变体”中“氨基酸差异”是指相较于原蛋白质或多肽,变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变,包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个或数个氨基酸的插入、缺失或替换。

  术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如,TIGIT)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段,(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段;(v)单结构域或dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码,但可使用重组方法,通过合成的接头连接它们,从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv);参见,例如,Bird等人(1988)Science242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段,并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体,例如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。

  本公开的抗原结合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。

  Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段,其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

  本公开的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外,可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。

  F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

  本公开的F(ab')2可以通过用胃蛋白酶处理本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外,可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab'来生产所述F(ab')2。

  Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab')2来生产。

  此外,可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。

  术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域;VH)和抗体轻链可变结构域(或区域;VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成,例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immuno l.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。

  本公开的scFv可以通过以下步骤来生产:获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA,构建编码scFv的DNA,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。

  双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段,是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中,两个抗原可以是相同或不同的。

  本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产:获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA,构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。

  dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering,7,697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

  本公开的dsFv可以通过以下步骤来生产:获得本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA,构建编码dsFv的DNA,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。

  包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。

  本公开的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产:构建本公开的特异性识别人TIGIT并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。

  本文中使用的术语“抗体框架”,是指可变结构域VL或VH的一部分,其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲,其是不具有CDR的可变结构域。

  术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常,每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3),每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界,包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991),“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273:927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.,Immunologist,7,132-136(1999);Lefranc,M.P.等,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)等。例如,对于经典格式,遵循Kabat规则,所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3);轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则,VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3);并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义,CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则,VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3),VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则,抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。

  术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如,TIGIT分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15个连续或非连续的氨基酸。参见,例如,Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。

  术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体以大约小于10-8M,例如大约小于10-9M、10-10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。

  术语"KD"或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常,本公开的抗体以小于大约10-7M,例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合TIGIT,例如,如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

  术语“PD-1抑制剂”是指一种降低、阻断、抑制、消除或干扰PD-1与其配体(如PD-L1、PD-L2)的相互作用的信号转导的分子。例如,在一些实施方式中,PD-1抑制剂包括降低、阻断、抑制、消除或干扰PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体或其抗原结合片段、或其免疫粘附素、或其融合蛋白,或其寡肽和其它分子;在一些实施方式中,PD-1抑制剂包括降低、阻断、抑制、消除或干扰PD-1与PD-L1相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、或其免疫粘附素、或其融合蛋白,或其寡肽和其它分子;在一些实施方式中,PD-1抑制剂包括降低、阻断、抑制、消除或干扰PD-1与PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体或其抗原结合片段、或其免疫粘附素、或其融合蛋白,或其寡肽和其它分子。在一些实施方式中,PD-1抑制剂选自已知的抗PD-1和/或PD-L1抗体:例如,Nivolumab(商品名Opdivo)、Pembrolizumab(商品名Keytruda)、Atezolizumab(商品名Tecentriq)、Avelumab(商品名Bavencio)、Durvalumab(商品名Imfinzi)、特瑞普利单抗(君实生物)、信迪利单抗(信达生物)、卡瑞利珠单抗(SHR1210,恒瑞医药)、替雷利珠单抗(百济神州)、HRP00052(参见WO2017084495A1)和HRP00049(参见WO2017084495A1),以及其它专利文献WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2、WO2010089411A2、WO2015085847、EP3378871A1等等中公开的抗PD-1和/或PD-L1抗体。

  本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“有效连接的”。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

  术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中,载体是“质粒”,其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中,载体是病毒载体,其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组,从而随宿主基因组一起复制(例如,非附加型哺乳动物载体)。

  现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法,如冷泉港的抗体实验技术指南,5-8章和15章。例如,鼠可以用人TIGIT或其片段免疫,所得到的抗体能被复性、纯化,并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件,从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到,或者从免疫球蛋白杂志,2001ISBN012441351上获得。

  术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员,例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

  本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如,编码重链和轻链的cDNA序列,可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术,哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化,特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人TIGIT特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如,用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体,用SDS-PAGE检测抗体片段,收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体,也可以用常规方法去除,比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻,如-70℃,或者冻干。

  “给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时,是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触,以及试剂与流体的接触,其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时,是指治疗处理、预防或预防性措施,研究和诊断应用。

  “治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂,例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物,所述患者具有一种或多种疾病症状,而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常,在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂,以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化,例如患者的疾病状态、年龄和体重,以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法,可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效,但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定,其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

  “保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸,使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓,一般而言,多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页,(第4版))。另外,结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

  “有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化:例如,待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

  “外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。

  “同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源;如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源,那么两个序列为95%同源。一般而言,当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

  本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。因此,单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物,而不考虑转移数目。还应当理解的是,由于故意或非有意的突变,所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下,其由上下文清楚可见。

  本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说,需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息,使得可以设计寡核苷酸引物;这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51:263;Erlich编辑,(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例,但不是唯一的实例,所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶,以扩增或产生核酸的特定部分。

  “任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

  试剂盒是包含药剂(例如特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂)的容器。合适的容器包括,例如:瓶、管形瓶(例如双室管形瓶),注射器(例如单或双室注射器)和试管。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)制成。试剂盒可以包含标签或包装插页。标签或包装插页可以指示试剂盒内的药剂的使用说明。试剂盒可以进一步包含其它材料,例如其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针和注射器等。本公开的药物或药物组合物可以放置在试剂盒中。

  “药物组合物”、“药物组合”表示含有一种或多种化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物,所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。在一些实施方式中,本公开的一种药物组合,其包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段,以及PD-1抑制剂;另一些实施方式中,本公开的一种药物组合,其包含包装插页,还包含特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或PD-1抑制剂,所述包装插页包含关于将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段与PD-1抑制剂组合使用治疗肿瘤的说明书。在一些实施方式中,本公开的药物组合,特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂直接混合形成药物组合物,所述组合物可进一步包括生理学/可药用的载体和赋形剂,施用时,将药物组合物施用给受试者;在一些实施方式中,本公开的药物组合,所述PD-1抑制剂和特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段是使用前混合的,也即PD-1抑制剂和特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段是分别保存的,直到即将使用前才将两者进行混合,然后将混合物施用给受试者;在另一些实施方式中,本公开的药物组合,所述PD-1抑制剂和特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段是在受试者体内混合,也即PD-1抑制剂和特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段被分别施用给受试者,PD-1抑制剂和特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段在受试者体内混合。

  本公开“联合”是一种给药方式,可包括“同时施用”或“先后施用”。“同时施用”是指将1种或多种药物同时施用给受试者;“先后施用”是指将1种或多种药物分别施用给受试者,给药顺序不做特别限制。例如,本公开的一些实施方式中,是将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂同时施用给受试者,以治疗疾病。在另一些实施方式中,将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段和PD-1抑制剂先后施用给受试者,以治疗疾病,例如:先将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段施用给受试者,然后将PD-1抑制剂施用给受试者;或者先将PD-1抑制剂施用给受试者,然后将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段施用给受试者;还可以是按任意顺序进行的PD-1抑制剂或特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段的连续施用,例如,先将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段施用给受试者,接着再次将特异性结合人TIGIT的单克隆抗体或其抗原结合片段施用给受试者,然后将PD-1抑制剂施用给受试者,以治疗疾病。

  与TIGIT相关的疾病没有限制,只要它是与TIGIT相关的疾病即可,例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类TIGIT然后阻遏或抑制T细胞功能障碍性病症,在一些实施方式中,所述疾病是恶性肿瘤、癌症或感染性病症,在一些实施方式中,所述疾病是在靶向免疫治疗检查点的免疫治疗药物的临床试验中观察到的有临床应答的肿瘤或癌症类型,例如CD155阳性、或PVR阳性的肿瘤、免疫性疾病或感染性病症。在一些实施方式中,其中所述肿瘤选自:头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌;在一些实施方式中,所述淋巴瘤选自:何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤,所述肺癌选自:非小细胞肺癌和小细胞肺癌,所述白血病选自:慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。

  上述与TIGIT相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达TIGIT的细胞来诊断。

  在本公开中,用于检测或测定TIGIT的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫检测或测定方法。

  免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。

  为了检测表达多肽的细胞,可以使用已知的免疫检测方法,并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外,可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。

  在本公开中,对用于检测或测定TIGIT的活体样品没有特别限制,只要它具有包含表达TIGIT的细胞的可能性即可,例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

  根据所需的诊断方法,含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂,例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。

  本公开实施例提供的TIGIT单克隆抗体或抗原结合片段对TIGIT具有很高的特异性、以及与TIGIT的高亲和力,其中人源化抗体的免疫原性大大降低,同时完全保留了鼠源抗体的特异性,较高的亲和力和优异的体内外活性。在一些实施中,本公开的特异性结合人TIGIT的抗体或抗原结合片段为国际专利申请PCT/CN2018/108246(WO2019062832A1)所描述的特异性结合人TIGIT的抗体或抗原结合片段,本公开通过引用将PCT/CN2018/108246专利申请全文完整收入本文。

  具体实施方式

  以下结合实施例和测试例进一步描述本公开,但这些实施例和测试例并非限制着本公开的范围。本公开实施例和测试例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如冷泉港的抗体技术实验手册,分子克隆手册;或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。

  实施例1、TIGIT抗原抗体的制备

  1.1蛋白设计及表达

  以人TIGIT蛋白(Uniprot号:Q495A1)作为本公开TIGIT的模板,设计本公开的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列,可选的在TIGIT蛋白基础上融合不同的标签,分别克隆到pHr载体上(自产)或pXC-17.4载体上(LONZA)上,在293细胞瞬转表达或CHO细胞稳定表达纯化,获得编码本公开抗原及检测用蛋白。以下TIGIT抗原未特殊说明的均指人TIGIT。

  TIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白:TIGIT-mFc,用于免疫和检测

  MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

  SEQ ID NO:1

  注释:划横线部分为信号肽,斜体部分为mFc。

  TIGIT胞外区与人IgG1 Fc段的融合蛋白:TIGIT-Fc,用于检测

  MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

  SEQ ID NO:2

  注释:划横线部分为信号肽,斜体部分为Fc。

  全长TIGIT:用于构建TIGIT过表达细胞株,用于检测

  

  SEQ ID NO:3信号肽(单下划线)+胞外区++胞内区(斜体部分)

  cynoTIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白:cynoTIGIT-mFc,用于检测

  MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWEQHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYRGRIFLEVLESSVAEHSARFQIPEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

  SEQ ID NO:4

  注释:划横线部分为信号肽,斜体部分为mFc。

  1.2TIGIT相关重组蛋白的纯化,以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化

  (1)杂交瘤上清分离纯化/ProteinG亲和层析:

  对于小鼠杂交瘤上清纯化首选ProteinG进行亲和层析,将培养所得杂交瘤细胞离心取上清,根据上清体积加入10-15%体积的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)调节上清pH。ProteinG柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积,然后利用纯水清洗3-5倍柱体积;利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积;细胞上清利用低流速上样结合,控制流速使保留时间约1min或更长时间;利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线;利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0)缓冲液进行样品洗脱,根据紫外检测收集洗脱峰,洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换,如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系,或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系,或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。

  (2)Protein A亲和层析提取带Fc标签的融合蛋白或者抗体:

  首先将表达Fc融合蛋白或者抗体的细胞培养上清进行高速离心收取上清。ProteinA亲和柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积,然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合,控制流速使保留时间约1min或更长时间,结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱,根据紫外检测收集洗脱峰,洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换,如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系,或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系,或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。

  实施例2、抗人TIGIT杂交瘤单克隆抗体的制备

  2.1免疫

  抗人TIGIT单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠,雌性,6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001)。饲养环境:SPF级。小鼠购进后,实验室环境饲养1周,12/12小时光/暗周期调节,温度20-25℃;湿度40-60%。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带mFc的人TIGIT胞外区(SEQ IDNO:1)。

  免疫方案:用Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)与ThermoAlum(Thermo Cat No.77161)佐剂交叉免疫。抗原与佐剂(Gold Adjuvant)比例为1:1,抗原与佐剂(ThermoAlum)比例为3:1,50μg/只/次(首次免疫),25μg/只/次(加强免疫)。抗原乳化后进行接种,时间为第0、14、28、42、56天。第0天腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6-8点)注射25μg/只。第28,42天根据背部结块和腹部肿胀情况,选择背部或腹膜内注射抗原。于第21,35,49,63天取血,用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在第4-5次免疫以后,选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫,腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。

  2.2脾细胞融合

  采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×10^6/ml的密度用完全培养基(含20%FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培养基)重悬,100μl/孔种于96孔板中,37℃,5%CO2孵育3-4天后,补充HAT完全培养基100μl/孔,继续培养3-4天至形成针尖般克隆。去除上清,加入200μl/well的HT完全培养基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基),37℃,5%CO2培养3天后进行ELISA检测。

  2.3杂交瘤细胞筛选

  根据杂交瘤细胞生长密度,用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行细胞结合实验和细胞阻断实验。结合和阻断均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。

  每次亚克隆细胞也均需进行TIGIT结合ELISA、HTRF阻断实验、细胞结合实验和细胞阻断实验检测。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆,用无血清细胞培养法进一步制备抗体,按纯化实例纯化抗体,供在检测例中使用。

  2.4杂交瘤阳性克隆序列测定

  从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞,用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA,用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara,Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序。从得到的DNA序列获得所筛选到的阳性克隆m1707、m1708、m1709、m1710、m1711对应的抗体可变区氨基酸序列如下所示:

  m1707-HCVR

  EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFIFSDYHMYWVRQTPEKRLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKHTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARQSSYDFAMDYWGRGTSVTVSS

  SEQ ID NO:5

  m1707-LCVR

  DIVMTQSHKFMSTSVGVRVSITCKASQDVGTSVAWYQQKPGQSPKLLIYWASARHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK

  SEQ ID NO:6

  m1708-HCVR

  QVQLQQPGAELVKPGSSVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQGPGRGLEWIGRIDPDSTGSKYNEKFKTKASLTVDTVSGTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREGAYGYYFDYWGQGTTLTVSS

  SEQ ID NO:7

  m1708-LCVR

  DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNARTLAESVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQYHSGSPLPFGAGTKLALK

  SEQ ID NO:8

  m1709-HCVR

  EVQLQQSGPVLVKPGPSVKISCKASGFTFTDYYMHWVKQSLGKSLEWIGLVYPYNDNTGYNRKFKGKATLTVDTSSSTAYIELNSLTSEDSAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTTLTVSS

  SEQ ID NO:9

  m1709-LCVR

  DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVVTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNVQSEDLADYFCQQYTLYPLTFGAGTKLELK

  SEQ ID NO:10

  m1710-HCVR

  QVQLQQPGAELVKFGASVKLSCKASGYTFTNYYMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPTSGATKYNDNFKGKATLTVDKPSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTLTVSS

  SEQ ID NO:11

  m1710-LCVR

  DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRTSENIFTYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKISSLQPEDFGIYYCQHHYGIPLPFGAGTKLELK

  SEQ ID NO:12

  m1711-HCVR

  QVQLQQSGTELVRPGTSVKMSCKASGYTFTNYWIGWAKQRPGHGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDKATLTADKSSSTAYMQFSSLTSEDSAIYYCTRGDYYDSSGRAMDYWGQGTSVTVSS

  SEQ ID NO:13

  m1711-LCVR

  DIVMSQSPSSLAVSVGEKVSMSCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKLEIK

  SEQ ID NO:14

  其中各抗体轻重链中CDR序列如表6所示(CDR序列由Kabat编号系统确定并注释)。

  表6:抗体重链及轻链CDR区序列

  

  

  实施例3、鼠源抗人TIGIT抗体的人源化

  通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件,分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板,将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中,形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要,对FR区氨基酸进行回复突变,得到人源化抗TIGIT单克隆抗体。以下示范性的具体实施例中,其中CDR区氨基酸残基的确定由Kabat编号系统确定并注释。

  上述鼠源抗体的轻重链可变区与人源抗体的轻重链恒定区连接后形成嵌合抗体,m1707抗体对应的嵌合抗体命名为ch1707,其他抗体类推。

  3.1杂交瘤克隆m1707的人源化

  (1)m1707人源化构架选择

  鼠源抗体m1707的人源化轻链模板为IGKV1-39*02和hjk2.1,人源化重链模板为IGHV3-7*01和hjh2,经人源化后得到人源化抗体h1707,人源化可变区序列如下:

  h1707 VH-CDR graft

  EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYHMYWVRQAPGKGLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSSYDFAMDYWGRGTLVTVSS

  SEQ ID NO:45

  h1707VL-CDR graft

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWASARHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:46

  注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。

  (2)h1707回复突变设计如下表:

  表7:h1707回复突变设计

  

  

  注:如S60D表示依照氨基酸序列自然顺序编号,将60位S突变回D。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

  回复突变设计后的h1707人源化抗体轻/重链可变区序列如下:

  >h1707-L1(同h1707 VL-CDR graft)

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWASARHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:46

  >h1707-L2

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWASARHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:47

  >h1707-L3

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKSPKLLIYWASARHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:48

  >h1707-L4

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKSPKLLIYWASARHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:49

  >h1707-H1(同h1707 VH-CDR graft)

  EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYHMYWVRQAPGKGLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSSYDFAMDYWGRGTLVTVSS

  SEQ ID NO:45

  >h1707-H2

  EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYHMYWVRQAPGKGLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSRLRAEDTAVYYCARQSSYDFAMDYWGRGTLVTVSS

  SEQ ID NO:50

  3.2杂交瘤克隆m1708的人源化

  (1)m1708人源化构架选择

  鼠源抗体m1708的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1,人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1,经人源化后得到人源化抗体h1708,人源化可变区序列如下:

  h1708VH-CDR graft

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:51

  h1708VL-CDR graft

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:52

  注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。

  (2)h1708回复突变设计如下表:

  表8:h1708回复突变设计

  

  注:如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号,将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

  回复突变设计后的h1708人源化抗体轻/重链可变区序列如下:

  >h1708-L1(同h1708 VL-CDR graft)

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:52

  >h1708-L2

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:53

  >h1708-H1(同h1708 VH-CDR graft)

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:51

  >h1708-H2

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:54

  >h1708-H3

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:55

  3.3杂交瘤克隆m1709的人源化

  (1)m1709人源化构架选择

  鼠源抗体m1709的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1,人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1,经人源化后得到人源化抗体h1709,人源化可变区序列如下:

  h1709VH-CDR graft

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:56

  h1709VL-CDR graftDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTLYPLTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:57

  注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。

  (2)h1709回复突变设计如下表:

  表9:h1709回复突变设计

  

  注:如S60D表示依照氨基酸序列自然顺序编号,将60位S突变回A。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

  回复突变设计后的h1709人源化抗体轻/重链可变区序列如下:

  >h1709-L1(同h1709 VL-CDR graft)

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTLYPLTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:57

  >h1709-L2

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTLYPLTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:58

  >h1709L3

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYTLYPLTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:59

  >h1709-L4

  DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYTLYPLTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:60

  >h1709-H1(同h1709 VH-CDR graft)

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:56

  >h1709-H2

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTVDTSTSTVYMELNSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:61

  >h1709-H3

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:62

  >h1709-H4

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWIGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTVDTSTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:63

  3.4杂交瘤克隆m1710的人源化

  (1)m1710人源化构架选择

  鼠源抗体m1710的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1,人源化重链模板为IGHV1-46*01和hjh4.1,经人源化后得到人源化抗体h1710,人源化可变区序列如下:

  h1710VH-CDR graft

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPTSGATKYNDNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:64

  h1710VL-CDR graft

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIFTYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGIPLPFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:65

  注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。

  (2)h1710回复突变设计如下表:

  表10:h1710回复突变设计

  

  

  注:如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号,将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

  回复突变设计后的h1710人源化抗体轻/重链可变区序列如下:

  >h1710-L1(同h1710 VL-CDR graft)

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIFTYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGIPLPFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:65

  >h1710-L2

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIFTYLAWYQQKPGKSPKLLVYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGIPLPFGQGTKLEIK

  SEQ ID NO:66

  >h1710-H1(同h1710 VH-CDR graft)

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPTSGATKYNDNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:64

  >h1710-H2

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPTSGATKYNDNFKGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:67

  >h1710-H3

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPTSGATKYNDNFKGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:68

  >h1710-H4

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPTSGATKYNDNFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:69

  >h1710-H5

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVKQAPGQGLEWIGRIDPTSGATKYNDNFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:70

  3.5杂交瘤克隆m1711的人源化

  (1)m1711人源化构架选择

  鼠源抗体m1711的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和hjk4.1,人源化重链模板为IGHV1-69*02和hjh4.1,经人源化后得到人源化抗体h1711,人源化可变区序列如下:

  h1711VH-CDR graft

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTV

  SEQ ID NO:71

  h1711VL-CDR graft

  DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:72

  注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。

  (2)h1711回复突变设计如下表:

  表11:h1711回复突变设计

  

  注:如P49S表示依照氨基酸序列自然顺序编号,将49位P突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

  回复突变设计后的h1711人源化抗体轻/重链可变区序列如下:

  >h1711-L1(同h1711 VL-CDR graft)

  DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:72

  >h1711-L2

  DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:73

  >h1711-L3

  DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKVEIK

  SEQ ID NO:74

  >h1711-H1(同h1711 VH-CDR graft)

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTV

  SS

  SEQ ID NO:71

  >h1711-H2

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:75

  >h1711-H3

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:76

  >h1711-H4

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTRGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTVSS

  SEQ ID NO:77

  3.6构建和表达人源化抗体

  将前述回复突变后获得的人源化抗体重链可变区与人抗体重链恒定区的氨基端连接形成抗体重链,轻链可变区与人抗体轻链恒定区的氨基端连接形成抗体轻链;设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段,再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-Fc/CL)片段)进行同源重组,构建抗体全长表达载体VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr,进行人源化抗体的表达。示例性的,抗体重链可变区与带S228P(对应于序列SEQ ID NO:78的第108位)突变的IgG4重链恒定区的氨基端连接,轻链可变区与kappa轻链恒定区的氨基端连接,最终获得h1707、h1708、h1709、h1710、h1711人源化抗体,具体见下表12-16:

  表12:h1707人源化抗体

  

  注:表中“h1707-02”表示由h1707-H2重链可变区(如SEQ ID NO:50所示)和如SEQID NO:78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链,与由h1707-L1轻链可变区(如SEQ IDNO:46所示)和如SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体,其它依此类推。

  表13:h1708人源化抗体

  

  注:表中“h1708-04”表示由h1708-H1重链可变区(如SEQ ID NO:51所示)和如SEQID NO:78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链,与由h1708-L2轻链可变区(如SEQ IDNO:53所示)和如SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体,其它依此类推。

  表14:h1709人源化抗体

  

  注:表中“h1709-10”表示由h1709-H2重链可变区(如SEQ ID NO:61所示)和如SEQID NO:78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链,与由h1709-L3轻链可变区(如SEQ IDNO:59所示)和如SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体,其它依此类推。

  表15:h1710人源化抗体

  

  注:表中“h1710-01”表示由h1710-H1重链可变区(如SEQ ID NO:64所示)和如SEQID NO:78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链,与由h1710-L1轻链可变区(如SEQ IDNO:65所示)和如SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体,其它依此类推。

  表16:h1711人源化抗体

  

  

  注:表中“h1711-04”表示由h1711-H4重链可变区(如SEQ ID NO:77所示)和如SEQID NO:78所示重链恒定区的氨基端连接而成的重链,与由h1711-L1轻链可变区(如SEQ IDNO:72所示)和如SEQ ID NO:79所示的轻链恒定区的氨基端连接而成的轻链形成的全长抗体,其它依此类推。

  示例性的抗体恒定区序列如下所示:

  带S228P突变的IgG4重链恒定区:

  ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:78

  kappa轻链恒定区:

  RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:79

  阳性对照抗体22G2-H3Q,其VH和VL序列(分别为US20160176963A1的SEQ ID NO:8和9)分别与上述SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79所示的重链恒定区和轻链恒定区连接形成完整全长抗体。22G2-H3Q的VH和VL具体序列如下:

  22G2-H3Q VH:

  QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGIYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYYVSGNYYNVDYYFFGVDVWGQGTTVTVSS

  SEQ ID NO:80

  22G2-H3Q VL:

  EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLFTFGPGTKVDIK

  SEQ ID NO:81

  示例性的抗人TIGIT抗体轻/重链全长序列如下:

  >h1707-02轻链全长序列

  DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWASARHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:82

  >h1707-02重链全长序列

  EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYHMYWVRQAPGKGLEWVAYISKGGISTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMSRLRAEDTAVYYCARQSSYDFAMDYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:83

  >h1708-04轻链全长序列

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQYHSGSPLPFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:84

  >h1708-04重链全长序列

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSTGSKYNEKFKTRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAYGYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:85

  >h1709-10轻链全长序列

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVVTAVAWYQQKPGKSPKLLIYSASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYTLYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:86

  >h1709-10重链全长序列

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGLVYPYNDNTGYNRKFKGRVTMTVDTSTSTVYMELNSLRSEDTAVYYCARGGPSNWNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:87

  >h1710-01轻链全长序列

  DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSENIFTYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTFAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGIPLPFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:88

  >h1710-01重链全长序列

  EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPTSGATKYNDNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGFGYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:89

  >h1711-04轻链全长序列

  DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQMNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

  SEQ ID NO:90

  >h1711-04重链全长序列

  EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSNYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGGAYTNYNEKFKDRVTITADKSTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCTRGDYYDSSGRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

  SEQ ID NO:91

  以下用生化测试方法验证本公开的抗体活性及药效

  测试例1:Biacore测定

  用Biacore,GE仪器测定待测抗TIGIT抗体与人、猴TIGIT的亲和力。

  用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获或按照人抗捕获试剂盒(Cat.#28-9538-28,GE)说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于生物传感芯片(Cat.#28-9538-28,GE)上,从而亲和捕获一定量的待测抗体,然后于芯片表面流经一系列浓度梯度的人、猴TIGIT抗原,人源TIGIT可选自义翘神州生物公司(Cat.10917-H08-H,Sino.Biol),猴TIGIT由实施例1及实施例2表达纯化而得,利用Biacore仪器(BiacoreT200,GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后,用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54,GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的氨基偶联试剂盒购自GE公司(Cat.#BR-1000-50,GE),缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69,GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。

  实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1,GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合,得出亲和力数值,结果见表17-19。

  表17.待测分子与人TIGIT蛋白的反应亲和力

  

  表18、待测分子与cynoTIGIT蛋白的反应亲和力

  

  表19.ch1711及其人源化抗体与人TIGIT蛋白的反应亲和力

  

  测试例2:TIGIT抗体对CD155蛋白与过表达TIGIT的CHO细胞结合的阻断实验

  抗TIGIT抗体的阻断能力通过抗体阻断CD155与TIGIT过表达CHO细胞结合的FACS实验来检测。通过电转染的方法将TIGIT全长质粒转染进CHO细胞中加压筛选两周后,检测TIGIT的表达量。将过表达细胞与不同浓度的抗TIGIT抗体、阴性对照(与TIGIT不结合的人IgG4抗体(hIgG4))预孵育后,再加入荧光标记的CD155-Fc进行孵育,通过信号的强弱用于判断抗体阻断CD155与过表达TIGIT的CHO细胞结合的能力,具体实验方法如下:

  先将CD155-Fc(Sino Biological,Cat No.10109-H02H)标记CFTM633(SigmaAldrich,Cat No.MX633S100)的荧光染料。将CD155-Fc用PBS溶解至浓度为0.5-1mg/ml,加入9倍样品体积的10×Mix-n-Stain Reaction Buffer,混匀;然后加入CFTM633荧光染料,避光室温孵育30分钟后,荧光标记完成。

  TIGIT-CHO细胞以5×106/ml密度,100μl/孔接种于96孔圆底板(Corning,CatNo.32915001)中,离心机(Beckman Coulter,Allegra X-15R Centrifuge)1500rpm离心5分钟,弃上清;用200μl PBS重悬细胞,离心,弃上清,重复一遍。加入100μl/孔已用样品稀释液(pH7.4 PBS含1%BSA)梯度稀释的待测抗体溶液重悬细胞,4℃孵育1小时。孵育结束后,1500rpm离心5分钟,弃上清,用样品稀释液洗两遍细胞后,加入100μl 2μg/ml的CFTM633荧光标记的CD155-Fc溶液重悬细胞,4℃孵育1小时。孵育结束后,1500rpm离心5分钟,弃上清,用样品稀释液洗两遍细胞,最后用200μl/孔样品稀释液重悬细胞,在流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ)上检测荧光信号强弱,用GraphPad Prism 5分析数据,计算TIGIT抗体对CD155与TIGIT-CHO细胞结合的阻断能力。结果见下表20:

  表20.TIGIT抗体对CD155蛋白与过表达TIGIT的CHO细胞结合的阻断实验结果

  

  本测试例中h1707-02、h1708-04、h1709-10、h1710-01、h1711-04抗体均能够很好的阻断CD155与TIGIT过表达的CHO细胞的结合。

  测试例3:抗TIGIT抗体与PD-1抑制剂组合对人T淋巴细胞白血病细胞系激活的影响

  为了研究抗体对T细胞功能的影响,将带有NFAT报告基因的高表达PD-1、TIGIT和CD226的Jurkat细胞系(GloResponseTM),与高表达T细胞激活分子、PD-L1和CD155的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)共培养18小时,加入萤光素酶底物检测发光信号值,用于判断抗体对T细胞的激活活性。具体实验过程如下:

  GloResponse NFAT-luc2/PD-1/TIGIT/CD226 Jurkat细胞于RPMI 1640培养基中培养,该培养基中添加10%(v/v)胎牛血清(FBS),100μg/ml Hygromycin B(潮霉素B),1mg/ml G418,2μg/ml puromycin(嘌呤霉素),37℃、5%CO2条件下培养。CHO-K1/PD-L1/CD155细胞,于F-12Nutrient Mixture(购自Ham)培养基中培养,该培养基中添加10%(v/v)FBS,200μg/ml Hygromycin B,250μg/ml G418,37℃、5%CO2条件下培养。

  实验第一天CHO-K1/PD-L1/CD155细胞以每孔40,000个细胞的密度接种于96孔板,在37℃、5%CO2条件下培养24小时。第二天,弃去细胞培养板中的培养基,利用含有2%FBS的RPMI 1640培养基洗涤,重悬GloResponse NFAT-luc2/PD-1/TIGIT/CD226 Jurkat细胞,并接种至96孔板中,细胞密度约为50,000个/孔,同时加入梯度稀释的抗体样品(稀释液为含有2%FBS的RPMI 1640,抗PD-1抗体和抗TIGIT抗体起始浓度均为30ug/ml,每次3倍释液,共稀释9次),等量的同型IgG作为空白对照。37℃,5%CO2培养箱孵育18h后,每孔加入40μL配制好的萤光素酶底物Bio-GloTM Luciferase Assay system(购自promega,G7940),室温避光放置10分钟,然后使用Victor3多功能酶标仪(购自Perkin Elmer)读取发光信号值。待测样品的IC50值使用数据处理软件Graphpad Prism5.0计算得到。

  试验结果见图1所示,TIGIT人源化抗体h1707-02、h1708-04、h1709-10、h1710-01和h1711-04能够不同程度增强Jurkat细胞激活产生的发光信号值(其中h1707-02、h1708-04和h1709-10抗体的信号值非常近似,在附图1中其3条曲线几乎重叠在一起,无法区分),并且有药物浓度剂量效应。而且抗TIGIT人源化抗体(h1707-02、h1708-04、h1709-10、h1710-01和h1711-04)与抗PD-1抗体(卡瑞利珠单抗(SHR1210,恒瑞医药))联合应用时,可大幅度增强Jurkat细胞激活产生的光信号强度,且较TIGIT抗体或PD-1抗体单用时的激活强度高。

  测试例4:抗TIGIT抗体与PD-1抑制剂联用小鼠体内药效试验

  通过TIGIT转基因C57小鼠皮下接种MC38鼠结肠癌细胞,给予TIGIT抗体h1708-04、h1710-01和抗鼠PD-1抗体,以及TIGIT抗体与抗鼠PD-1抗体(克隆号J43,市售)联用,检测小鼠肿瘤体积大小的变化,评价受试抗体对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。

  TIGIT转基因C57小鼠,100只,雄性,购自上海南方模式生物科技股份有限公司,6周龄,小鼠体重20-28g,5只/笼饲养于SPF级环境,温度20-25℃;湿度40-60%,许可证号SCXK(沪)2014-0002。适应环境约12天左右。

  将MC38细胞(购自南京银河生物医药有限公司)(5×105个)100μl接种于100只TIGIT转基因C57小鼠右肋部皮下,待成瘤后(~130mm3)后去除肿瘤过大和过小的,按肿瘤体积将小鼠随机分为8组,每组7-9只。当天开始通过腹腔注射抗体,每周注射2次,共3周。每周测2次瘤体积,称体重,记录数据。分组及给药情况见表21。

  表21.试验分组及给药情况

  

  实验结束时取小鼠肿瘤组织,肿瘤组织在-80℃保存。使用Excel统计软件:平均值以avg计算;SD值以STDEV计算;SEM值以STDEV/SQRT(每组动物数)计算;使用GraphPadPrism软件作图,组间差异P值以Two-way Anova分析。

  肿瘤体积(V)计算公式为:V=1/2×L长×L短2

  相对体积(RTV)=VT/V0

  抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)

  其中V0、VT分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。CRTV、TRTV分别为实验结束时的Vehicle(空白对照组)及实验组的相对肿瘤体积。

  试验结果见附图2,与空白对照(IgG)组相比,抗鼠PD-1抗体单用组抑瘤率为6%;h1708-04-10mg/kg单用组抑瘤率为4%,h1708-04-10mg/kg与抗鼠PD-1抗体0.125mg/kg联用组的抑瘤率为40%(p<0.001),联用组能够显著抑制MC38肿瘤的生长,联用组药效明显优于单用组(p<0.001);h1708-04 25mg/kg单用组抑瘤率为23%(p<0.001),h1708-0425mg/kg与抗鼠PD-1抗体0.125mg/kg联用组的抑瘤率为31%(p<0.001),能够显著抑制MC38肿瘤的生长,联用组的抑瘤率高于单用组;h1710-01 25mg/kg单用组抑瘤率为8%,h1710-01 25mg/kg与抗鼠PD-1抗体0.125mg/kg联用的抑瘤率为34%(p<0.001),能够显著抑制MC38肿瘤的生长(p<0.001),联用组药效明显优于单用组(p<0.01)。

  虽然为了清楚的理解,已经借助于附图和实例详细描述了上述发明,但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

  序列表

  <110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司

  <120> 抗TIGIT抗体联合PD-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合

  <130> 2019

  <150> 201910247537.0

  <151> 2019-03-29

  <160> 91

  <170> SIPOSequenceListing 1.0

  <210> 1

  <211> 372

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> TIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白:TIGIT-mFc

  <400> 1

  Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

  1 5 1015

  Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser

  202530

  Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr

  354045

  Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu

  505560

  Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys

  65707580

  Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu

  859095

  Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro

  100 105 110

  Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser

  115 120 125

  Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Arg Gly Pro

  130 135 140

  Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu

  145 150 155 160

  Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu

  165 170 175

  Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

  180 185 190

  Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu

  195 200 205

  Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

  210 215 220

  Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser

  225 230 235 240

  Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro

  245 250 255

  Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln

  260 265 270

  Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val

  275 280 285

  Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val

  290 295 300

  Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu

  305 310 315 320

  Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg

  325 330 335

  Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val

  340 345 350

  Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg

  355 360 365

  Thr Pro Gly Lys

  370

  <210> 2

  <211> 371

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> TIGIT胞外区与人IgG1 Fc段的融合蛋白:TIGIT-Fc

  <400> 2

  Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

  1 5 1015

  Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser

  202530

  Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr

  354045

  Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu

  505560

  Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys

  65707580

  Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu

  859095

  Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro

  100 105 110

  Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser

  115 120 125

  Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Lys Ser Ser

  130 135 140

  Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

  145 150 155 160

  Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

  165 170 175

  Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

  180 185 190

  Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

  195 200 205

  His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

  210 215 220

  Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

  225 230 235 240

  Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

  245 250 255

  Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

  260 265 270

  Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

  275 280 285

  Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

  290 295 300

  Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

  305 310 315 320

  Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

  325 330 335

  Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

  340 345 350

  His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

  355 360 365

  Pro Gly Lys

  370

  <210> 3

  <211> 244

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 全长TIGIT

  <400> 3

  Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

  1 5 1015

  Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

  202530

  Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

  354045

  Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

  505560

  Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

  65707580

  Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

  859095

  Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

  100 105 110

  Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

  115 120 125

  Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

  130 135 140

  Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

  145 150 155 160

  Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

  165 170 175

  Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

  180 185 190

  Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

  195 200 205

  Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

  210 215 220

  Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

  225 230 235 240

  Thr Glu Thr Gly

  <210> 4

  <211> 373

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> cynoTIGIT胞外区与小鼠IgG2aFc段的融合蛋白:cynoTIGIT-mFc

  <400> 4

  Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

  1 5 1015

  Val Gln Cys Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser

  202530

  Ala Lys Lys Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr

  354045

  Met Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln His Asp His Ser Leu

  505560

  Leu Ala Ile Arg Asn Ala Glu Leu Gly Trp His Ile Tyr Pro Ala Phe

  65707580

  Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser

  859095

  Leu Thr Met Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr

  100 105 110

  Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser

  115 120 125

  Ser Val Ala Glu His Ser Ala Arg Phe Gln Ile Pro Glu Pro Arg Gly

  130 135 140

  Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu

  145 150 155 160

  Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val

  165 170 175

  Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

  180 185 190

  Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val

  195 200 205

  Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser

  210 215 220

  Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met

  225 230 235 240

  Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala

  245 250 255

  Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro

  260 265 270

  Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln

  275 280 285

  Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr

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  Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu

  325 330 335

  Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser

  340 345 350

  Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser

  355 360 365

  Arg Thr Pro Gly Lys

  370

  <210> 5

  <211> 119

  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1707-HCVR 序列

  <400> 5

  Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

  1 5 1015

  Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr

  202530

  His Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

  354045

  Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

  505560

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  Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly

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  Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

  115

  <210> 6

  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1707-LCVR序列

  <400> 6

  Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

  1 5 1015

  Val Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

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  Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

  65707580

  Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

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  <210> 7

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1708-HCVR序列

  <400> 7

  Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser

  1 5 1015

  Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

  202530

  Trp Met His Trp Val Lys Gln Gly Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

  354045

  Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

  505560

  Lys Thr Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Thr Val Ser Gly Thr Ala Tyr

  65707580

  Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

  859095

  Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

  100 105 110

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  115

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1708-LCVR

  <400> 8

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  1 5 1015

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  202530

  Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1709-HCVR序列

  <400> 9

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  1 5 1015

  Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

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  Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Leu Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

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  505560

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  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1709-LCVR序列

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  1 5 1015

  Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1710-HCVR序列

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  Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

  202530

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  505560

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  Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

  859095

  Ala Arg Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

  100 105 110

  Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

  115

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  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1710-LCVR序列

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  Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr

  202530

  Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

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  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu

  859095

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  100 105

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1711-HCVR序列

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  Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

  1 5 1015

  Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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  505560

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  <212> PRT

  <213> 小鼠(Mus musculus)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> m1711-LCVR序列

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  1 5 1015

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  202530

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  Lys

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  <221> DOMAIN

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  Gly

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <400> 22

  Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

  1 5 1015

  Thr

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  <212> PRT

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

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  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1708 LCDR1序列

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

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  <220>

  <221> DOMAIN

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1709 HCDR2序列

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1709 HCDR3序列

  <400> 29

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1709 LCDR1序列

  <400> 30

  Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala Val Ala

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1709-LCDR3序列

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  Asn Tyr Tyr Met His

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1710-HCDR2序列

  <400> 34

  Arg Ile Asp Pro Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe Lys

  1 5 1015

  Gly

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1710-HCDR3序列

  <400> 35

  Glu Gly Gly Phe Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

  1 5 10

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1710-LCDR1序列

  <400> 36

  Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr Leu Ala

  1 5 10

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1710-LCDR2序列

  <400> 37

  Asn Ala Lys Thr Phe Ala Glu

  1 5

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1710-LCDR3序列

  <400> 38

  Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu Pro

  1 5

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  <211> 5

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-HCDR1序列

  <400> 39

  Asn Tyr Trp Ile Gly

  1 5

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-HCDR2序列

  <400> 40

  Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

  1 5 1015

  Asp

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  <211> 13

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-HCDR3序列

  <400> 41

  Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Ala Met Asp Tyr

  1 5 10

  <210> 42

  <211> 17

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-LCDR1序列

  <400> 42

  Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Met Asn Tyr Leu

  1 5 1015

  Ala

  <210> 43

  <211> 7

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-LCDR2序列

  <400> 43

  Trp Thr Ser Thr Arg Glu Ser

  1 5

  <210> 44

  <211> 9

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 1711-LCDR3序列

  <400> 44

  Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

  1 5

  <210> 45

  <211> 119

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707 VH-CDR graft,h1707-H1序列

  <400> 45

  Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

  1 5 1015

  Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

  202530

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  Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

  505560

  Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

  65707580

  Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

  859095

  Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly

  100 105 110

  Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

  115

  <210> 46

  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707 VL-CDR graft,h1707-L1序列

  <400> 46

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

  100 105

  <210> 47

  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-L2序列

  <400> 47

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

  100 105

  <210> 48

  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-L3序列

  <400> 48

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

  100 105

  <210> 49

  <211> 107

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-L4序列

  <400> 49

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Trp Ala Ser Ala Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

  100 105

  <210> 50

  <211> 119

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-H2序列

  <400> 50

  Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

  1 5 1015

  Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

  202530

  His Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

  354045

  Ala Tyr Ile Ser Lys Gly Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

  505560

  Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

  65707580

  Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

  859095

  Ala Arg Gln Ser Ser Tyr Asp Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly

  100 105 110

  Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

  115

  <210> 51

  <211> 119

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  <220>

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  <211> 113

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  <210> 77

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

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  115 120

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> 带S228P突变的人IgG4重链恒定区序列

  <400> 78

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

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  <221> DOMAIN

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  <221> DOMAIN

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  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

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  202530

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  354045

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  <211> 214

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-02轻链全长序列

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  202530

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  <210> 83

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  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1707-02重链全长序列

  <400> 83

  Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

  1 5 1015

  Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

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  180 185 190

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  <210> 84

  <211> 214

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1708-04轻链全长序列

  <400> 84

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

  202530

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  Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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  Phe Asn Arg Gly Glu Cys

  210

  <210> 85

  <211> 446

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1708-04重链全长序列

  <400> 85

  Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

  1 5 1015

  Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

  202530

  Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

  354045

  Gly Arg Ile Asp Pro Asp Ser Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

  505560

  Lys Thr Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

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  Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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  Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

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  Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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  Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

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  Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

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  Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

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  <210> 86

  <211> 214

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1709-10轻链全长序列

  <400> 86

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Thr Ala

  202530

  Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

  505560

  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Leu Tyr Pro Leu

  859095

  Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

  100 105 110

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  Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

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  Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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  <210> 87

  <211> 447

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1709-10重链全长序列

  <400> 87

  Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

  1 5 1015

  Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

  202530

  Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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  Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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  Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

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  Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

  275 280 285

  Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

  290 295 300

  Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

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  Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

  325 330 335

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  His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

  435 440 445

  <210> 88

  <211> 214

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1710-01轻链全长序列

  <400> 88

  Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1 5 1015

  Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Phe Thr Tyr

  202530

  Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

  354045

  Tyr Asn Ala Lys Thr Phe Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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  Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

  65707580

  Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Pro Leu

  859095

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  115 120 125

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  Phe Asn Arg Gly Glu Cys

  210

  <210> 89

  <211> 446

  <212> PRT

  <213> 人工序列(Artificial Sequence)

  <220>

  <221> DOMAIN

  <223> h1710-01重链全长序列

  <400> 89

  Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

  1 5 1015

  Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

  202530

  Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

  354045

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  65707580

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  Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

  180 185 190

  Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

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  Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

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  Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

  245 250 255

  Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

  260 265 270

  Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

  275 280 285

  Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

  290 295 300

  Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

  305 310 315 320

  Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

  325 330 335

  Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

  340 345 350

  Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

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  <223> h1711-04重链全长序列

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  Lys

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