欢迎光临小豌豆知识网!
当前位置:首页 > 化学技术 > 肥料制造> 一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂及其制备方法独创技术17791字

一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂及其制备方法

2023-07-14 11:40:17

一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂及其制备方法

  技术领域

  本发明属于微生物菌剂技术领域,具体涉及一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂及其制备方法。

  背景技术

  秸秆中富含有机质以及农作物生长所需的多种营养元素,是发酵制成有机肥料的重要原材料。秸秆发酵的原理是在发酵过程中秸秆中的有机质会在微生物的作用下进行复杂的转化过程,首先是把复杂的有机质分解为简单物质,最后生成二氧化碳、水和矿质养分等;紧接着是有机质的再合成,生成更为复杂的特殊有机质腐殖质,更有利于作物的吸收利用。秸秆发酵制成有机肥,一方面可停止焚烧秸秆,实现了秸秆处理的绿色无公害化;另一方面将废弃的秸秆进行再利用,减少成本,秸秆的再利用是发展绿色农业的重要手段。

  小麦作为主要的粮食作物,每年的秸秆产量巨大,在有机肥制备领域具有很大的开发潜力。但是,小麦赤霉病是一种麦田常见土传病害,由一种或多种真菌引起,禾谷镰刀菌是其主要病原菌,其浸染阶段主要发生在更适宜病原菌生长的小麦扬花期,经过大风或雨水传播,侵染菌从植物根部传到穗部,最终造成穗部腐烂。同时,致病菌在侵染小麦穗部并生长的同时,还会产生多种有害次生代谢产物,典型的如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)等真菌毒素,这些毒素会在麦粒上长期残留,进而严重危害到食品及饲料安全,其中DON毒素危害尤为严重。据有关学者研究,DON毒素能在小麦贮藏四年后依然残留在小麦病粒上。同时,DON毒素对细胞的毒性是巨大的,它能对核糖体的翻译起一定的抑制作用。人体摄入后会出现呕吐、腹泻、恶心等症状。若摄入过量,则会引起大出血、免疫力下降。牲畜食用含毒饲料后主要表现为食欲不振、呕吐、体型瘦削等症状,严重时会导致死亡。另外,其肉、蛋、奶产品中均会有一定的毒素残留,从而对食用者造成扩散性的危害。

  更为严重的是,被禾谷镰刀菌浸染的小麦,在小麦成熟收割后,病原菌仍大量留在小麦的秸秆中,在进行堆肥发酵的过程中病原菌往往难以得到彻底地清除,从而限制了小麦秸秆制成有机肥的施用。

  在秸秆发酵过程中,为了加快秸秆腐熟的速度,通常会在发酵料中添加发酵菌剂,但是目前市场上使用较广的秸秆发酵菌剂普遍无法抑制染病小麦秸秆中禾谷镰刀菌的活性,且加入常规发酵菌剂后的秸秆的发酵时间仍需15-30天,还是相对较长,影响有机肥的整体生产效率。

  因此,本研究期望能够获得一种新型的微生物发酵菌剂作为小麦染病秸秆的发酵菌剂,在能进一步缩短秸秆腐熟时间的同时能够抑制秸秆中病原菌的生长,保证生产出的有机肥料的使用安全。

  发明内容

  本发明的目的在于解决现有技术中的不足,提供一种作用于小麦秸秆发酵过程、可以有效防治小麦赤霉病的微生物发酵菌剂,该菌剂是对分离出的具有小麦赤霉病防治效果的微生物菌群进行扩大培养后所得,对小麦赤霉病和赤霉毒素均有很高的防效,既能在有机肥原料的发酵过程中抑制病原菌的生长,又能加快秸秆发酵腐熟的速度,效果显著,普适性强。

  本发明的具体技术方案如下所述:

  本发明提出一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂的制备方法,具体的制备步骤为:

  S1秸秆原料预处理:取被小麦赤霉病侵染的秸秆,粉碎至粉末状,自然风干,备用;

  S2微生物菌群的分离:将100mL无菌的无机盐培养基装至规格为250mL的三角瓶中,将秸秆按液体体积5%的量加入三角瓶中,于30℃摇床中进行初代培养,将菌群悬液按液体体积10%的量转移至新鲜的100mL无菌的无机盐培养基中,继续培养48h,按上述方法传代培养5次获得微生物菌群;

  S3制备发酵液:在500L的发酵罐中装入400L的无机盐培养基,121℃,0.1MPa灭菌30min,冷却至室温;

  S4菌群的扩大培养:将处理后的秸秆按液体体积5%的量加入发酵罐中,将上述传代培养5代的微生物菌群种子液按液体体积10%的量加入发酵罐中,在设定的发酵条件下培养60-72h,获得微生物菌剂菌悬液。

  进一步地,步骤S2中初代培养时摇床的转速为160-180rpm,培养时间为45-55h。

  进一步地,步骤S4中的发酵条件是培养温度为30-35℃,搅拌速率为200-220rpm,通气量为1:0.4。

  进一步地,步骤S4中获得的菌悬液中的有效活菌数为5×108个/mL。

  进一步地,步骤S2中获得的微生物菌群中主要包含细菌和放线菌两大类组分,已鉴定到属的细菌组分中又包含芽孢杆菌,假单胞菌,泛菌,双歧杆菌,醋酸杆菌,乳酸杆菌,寡养单胞菌,克雷白氏杆菌,柠檬酸杆菌和黄杆菌。

  一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂,该微生物菌剂由从染病秸秆中分离得到的微生物菌群经扩大培养后得到,所述微生物菌群中主要包含细菌和放线菌两大类组分,已鉴定到属的细菌组分中又包含芽孢杆菌,假单胞菌,泛菌,双歧杆菌,醋酸杆菌,乳酸杆菌,寡养单胞菌,克雷白氏杆菌,柠檬酸杆菌和黄杆菌。

  与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

  1.利用本发明公开的微生物发酵菌剂处理小麦发酵秸秆,堆肥中的营养成分和酶活性均有所提高,并可加速秸秆的发酵腐熟、缩短有机肥的生产周期,实施产业化可加快生产效率,提升企业经济利益;

  2.本发明公开的微生物发酵菌剂中含有对小麦赤霉病有较好防效的微生物菌群,在染病秸秆的处理上具有独特的优势;

  3.本发明公开的微生物菌群是在染病秸秆中分离得到,对田间复杂修复环境的适应能力更强,菌剂的田间施用效果更好;

  4.本发明公开的制备工艺流程简单,原料来源广泛、分离获取和发酵成本低,对环境无污染,易于大规模推广;

  5.本发明公开的微生物菌剂具有加快秸秆腐熟的效果,可适用于除小麦秸秆外的其他秸秆的发酵过程,同样具有发酵提速的效果,普适性强。

  附图说明

  图1为本发明实施例一中获得的不同微生物在菌群中的比例分配圆饼图;

  图2为本发明实施例二中获得三个处理组的发酵堆肥中的营养成分及酶活性对比数据统计图;

  图3为本发明实施例二中获得的禾谷镰刀菌检测引物的特异性验证图谱;

  图4为本发明实施例二中获得的三个处理中的禾谷镰刀菌数量及DON毒素含量对比数据统计图;

  图5A为本发明实施例二中获得的对照组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱;

  图5B为本发明实施例二中获得的添加贝佳有机肥发酵菌剂的实验组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱;

  图5C为本发明实施例二中获得的添加本发明制备的微生物发酵菌剂的实验组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱。

  具体实施方式

  以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。

  本发明所需培养基和缓冲液:

  基础盐培养基(g/L):NH4NO3 1.0,KH2PO4 0.5,K2HPO4·3H2O 1.5,NaCl 1.0,MgSO4·7H2O 0.2,调节pH至7.0,121℃,灭菌30min;

  PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基):将200g土豆洗净并去皮,切成1cm小块,沸水煮30min,四层纱布过滤后,向滤液中加入10g葡萄糖(固体另添加15g琼脂),充分溶解后,补充蒸馏水至1L,115℃,灭菌25min;

  绿豆培养基:绿豆30g,绿豆洗净后加水煮至开花,用纱布过滤,自然pH,蒸馏水将滤液补充至1L,121℃,灭菌15min。

  磷酸缓冲液:称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸,用水溶解并定容至1L,调节pH至6.0。

  实施例一:微生物菌群的扩大培养

  1.秸秆原料预处理:染病秸秆采自江苏省南京市小麦田,粉碎至粉末状,自然风干,备用;

  2.微生物菌群的分离:将100mL无菌的无机盐培养基装至规格为250mL的三角瓶中,将秸秆按液体体积5%的量加入三角瓶中,30℃摇床,180rpm培养48h,将菌群悬液按液体体积10%的量转移至新鲜的100mL无菌的无机盐培养基中,继续培养48h,按上述方法传代培养5次;

  3.制备发酵液:在500L的发酵罐中装入400L的无机盐培养基,121℃,0.1MPa灭菌30min,冷却至室温;

  4.菌群的扩大培养:将处理后的秸秆按液体体积5%的量加入发酵罐中,将上述传代培养5代的微生物菌群种子液按液体体积10%的量加入发酵罐中,于30℃、220rpm的搅拌速率,通气量为1:0.4的条件下,培养65h,获得微生物发酵菌剂菌悬液。

  用强力水体DNA提取试剂盒(DNA Isolation Kit,MOBIO)提取步骤2获得的菌群悬液的水样总DNA,测定样品中菌群的组成结构(委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成),检测结果如图1所示。从图1中可以看出本发明中获得的微生物菌群的主要组分为细菌和放线菌,在鉴定到属的细菌组分中,主要包括芽孢杆菌,假单胞菌,泛菌,双歧杆菌,醋酸杆菌,乳酸杆菌,寡养单胞菌,克雷白氏杆菌,柠檬酸杆菌和黄杆菌。

  实施例二、染病秸秆发酵堆肥中相关参数的测定

  1.禾谷镰刀菌孢子液的制备

  将活化的禾谷镰刀菌转接至PDA平板,25℃,培养5天,挑取菌丝接入绿豆培养基中,25℃,180rpm,摇床培养5天,纱布过滤,滤液7000rpm离心10min,沉淀用无菌水重悬,浓度为105个/mL,置于冰箱中备用。

  2.小麦染病秸秆发酵

  1)实验设置:共设置三组处理,包含一个对照组(秸秆自然发酵)和两个实验组(分别用本发明制备的微生物发酵菌剂与贝佳有机肥发酵菌剂处理染病秸秆),对比相同发酵时间内秸秆发酵腐熟的程度,发酵后堆肥中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、钙含量、磷含量、α-淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶活力,发酵结束后堆肥中的禾谷镰刀菌的数量、DON毒素的含量等指标,确定微生物发酵菌剂在发酵染病秸秆过程中的作用。

  2)具体实验操作如下:

  贝佳有机肥发酵菌剂的活化:将1kg菌种,1kg红糖加入18kg井水中,搅拌均匀,无需密封容器,放置72h,有酸甜味即可,得到菌悬液的有效活菌数为5×108个/mL。

  i.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径为5毫米左右的碎渣,并添加尿素调节碳氮比为25:1;

  ii.将活化好的发酵菌剂或者扩大培养后的微生物发酵菌剂的菌悬液均匀、逐层喷洒至秸秆中,对照组用自来水喷施,控制湿度在50-60%范围内(手一攥成一团,轻轻扔到地上能散开),堆成边长为1.5米的方堆,覆盖塑料膜,不可密封,保持透气性良好;

  iii.当温度升高到50℃,感觉轻微烫手时翻堆一次,当温度再升高到50℃时再翻堆一次;

  iv.后期发酵温度控制在60℃,发酵3天,熟化10天。

  3)腐熟程度的比较:不同处理组经过3天发酵以及10天的熟化,对照组(自然发酵)的秸秆手感较硬,无明显变化,添加贝佳有机肥发酵菌剂的实验组的发酵物料颜色变深,手感略微松软,可闻到轻微的酸味,而添加本发明中的微生物发酵菌剂处理后,在相同的时间内,秸秆颜色变成黑褐色,手感松软有弹性,手握易成粉末状,有曲香而不臭,说明该实验组的秸秆发酵充分,这也说明本发明制备的微生物发酵菌剂在同等条件下可加快秸秆的发酵。

  由于不同禾本科农作物秸秆中的成分较为接近,之后本研究尝试将该微生物菌剂作用于其他秸秆如玉米秸秆和水稻秸秆的发酵过程,在同等发酵条件下对腐熟程度进行比较,发现不同秸秆的发酵腐熟程度均有一定程度的加快。

  3.堆肥中营养成分及酶活性的测定

  1)营养成分的测定方法:

  粗蛋白的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白的测定方法进行。

  粗纤维的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6434-2006饲料中粗纤维的测定方法进行。

  粗脂肪的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6433-2006饲料中粗脂肪的测定方法进行。

  粗灰分的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6438-2007饲料中粗灰分的测定方法进行。

  钙含量的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6436-2002饲料中钙含量的测定方法进行。

  磷含量的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中磷含量的测定方法进行。

  2)酶活性的测定方法:

  从每个处理组中称取堆肥5.0g,设置3个平行,加入50mL磷酸缓冲液,5000rpm离心30min,上清液为待测液。

  α-淀粉酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中α-淀粉酶活性的测定方法进行。

  蛋白酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中蛋白酶活性的测定方法进行。

  纤维素酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中纤维素酶活性的测定方法进行。

  图2为三个处理组的发酵堆肥中的营养成分及酶活性对比数据统计图,从图中可以看出不同处理下其营养成分差别较大。添加微生物发酵菌剂的处理相较于对照组和添加市场常规秸秆发酵菌剂的处理而言,添加微生物发酵菌剂的处理中的粗蛋白、粗脂肪、钙和磷含量都显著升高,粗纤维以及粗灰分显著降低。对于酶活性而言,与秸秆发酵相关的α-淀粉酶、蛋白酶以及纤维素酶的活性菌显著提高,这与2中观察到的三个处理组的腐熟程度的对比结果相符,说明本发明公开的微生物发酵菌剂确可加快秸秆的发酵速度。

  4.堆肥中禾谷镰刀菌的定量测定及DON毒素的检测

  1)禾谷镰刀菌的定量测定

  禾谷镰刀菌检测特异引物:Fg16F:CTCCGGATATGTTGCGTCAA;Fg16R:GGTAGGTATCCGACATGGCAA。利用荧光定量PCR制备标准曲线,即禾谷镰刀菌标准品拷贝数的lg数与达到阈值时的循环数Ct之间的关系。随即用强力植物DNA提取试剂盒(DNA Isolation Kit,MOBIO)提取发酵腐熟后的秸秆样品DNA,通过与标准曲线中Ct值的比较,定量检测禾谷镰刀菌:

  反应体系(20μL)如下所示:

  

  荧光定量PCR的程序设置如下:

  

  图3为禾谷镰刀菌检测引物的特异性验证图谱即荧光定量PCR溶解曲线,从图中可以看出多次获得的溶解曲线均只有一个特征峰,说明该引物的特异性良好,可通过荧光定量PCR技术定量检测禾谷镰刀菌,结果可靠。

  2)DON毒素的检测方法

  称取25g样品于搅拌杯中,加入5g聚乙二醇(PEG 8000)和100mL纯水,盖上杯盖,高速搅拌2min。取下盖子,将提取物倒入槽纹滤纸上,用100mL烧杯收集滤液,滤液再经Whatman微纤维滤纸过滤。取5mL提取液,控制压力使样液体以1滴/s的流速全部通过Don-test免疫亲和柱。用10mL纯水以2滴/s的流速淋洗亲和柱,弃去全部流出液。准确加入1.0mL甲醇,以1滴/s的流速洗脱,收集全部洗脱液于玻璃管中。取20μL净化液进行HPLC分析。根据峰保留时间定性,根据峰面积外标法定量。

  高效液相色谱检测条件:色谱柱Symmetry C18柱,4.6mm×150mm,粒度5μm;柱温40℃,流动相:乙腈:水(16:84,v/v),流速0.8mL/min,进样量20μL,紫外检测器波长218nm。

  三个处理组中的禾谷镰刀菌数量及DON毒素含量对比结果如图4所示,三个处理组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱如图5A、图5B和图5C所示,从图4、图5A、图5B和图5C中可以看出添加本发明制备的微生物发酵菌剂处理的秸秆中的禾谷镰刀菌的数量以及DON毒素的含量显著低于其他两个处理组,说明本发明制备的微生物发酵菌剂对禾谷镰刀菌具有较强的防控效果,在染病秸秆的处理问题上具有独特的优势。

  以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例,本发明的技术特征并不局限于此,任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

《一种加速小麦秸秆发酵的微生物发酵菌剂及其制备方法.doc》
将本文的Word文档下载到电脑,方便收藏和打印
推荐度:
点击下载文档

文档为doc格式(或pdf格式)