一种主动靶向响应型多肽药物、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用技术领域，具体来讲，涉及一种主动靶向响应型多肽药物及其制备方法和应用。
背景技术
药物治疗目前仍是临床上用于治疗癌症的最常用方法之一，其经常配合其他方法进行共同治疗。但是目前临床所用的绝大多数小分子药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织和细胞造成伤害，造成严重的不良反应与毒副作用。同时大部分小分子药物由于自身缺少靶向性，其自身在患部富集较少，较低的富集浓度难以对肿瘤细胞造成有效杀伤且极易被肿瘤细胞排出细胞外且产生耐药性。依据病灶部位不同的生理条件，可以利用其中过表达酶的催化作用改变所用药物的化学组成，使其在患部发生形态转变，可以有效延长药物的滞留时间，达到长时间治疗的目的。因此本领域急需一种集主动靶向与原位形态转变于一体的，同时实现提高病灶部位富集和提高药物有效浓度的抗肿瘤药物，从而实现对病灶部位的主动靶向及长时间药物治疗。
神经肽Y(NPY)由36个氨基酸构成，并且在1982年首次从猪脑中分离出来。这种神经肽存在于中枢神经系统和自主神经系统。神经肽Y(NPY)受体属于G蛋白偶联受体超家族，在食物摄入、焦虑和癌症等生物学研究中具有重要作用。目前有研究表明，在乳腺癌、脑癌、卵巢癌、肾癌等疾病的临床病例中均发现了神经肽Y1受体的过表达，且正常组织器官中这种受体的表达均较低。这说明神经肽Y1是一种可用于肿瘤靶向诊疗的一种潜在靶点。
发明内容
本发明的一方面提供了一种主动靶向响应型多肽药物，所述主动靶向响应型多肽药物由主动靶向型肽段、响应型片段和小分子药物基团依次连接组成。
在优选的实施方式中，所述响应型肽段选自：PLGLAG、GPLGLAGQ、PLGVRG、PLGVRG、GKGGLVPRGSGC、GPLGIAGQ、GFLG、AACCAA、FK、-S-S-、-C＝N-中的至少一种。
在优选的实施方式中，与所述响应型肽段相对应的肿瘤微环境过表达的酶及化合物选自：MMP-2、MMP-3、MMP-5、MMP-7、MMP-9、蛋白酶B、还原性谷胱甘肽、氢离子中的至少一种。
在优选的实施方式中，所述响应型肽段与所述肿瘤微环境过表达的酶及化合物结合后，所述响应型多肽药物发生构象转变。
在优选的实施方式中，所述主动靶向型肽段，选自以下肽段中的至少一种：[Arg6,Pro34]pNPY、[Phe6,Pro34]pNPY、[Asn6,Pro34]pNPY、[Cys6,Pro34]pNPY、[Phe6,Pro34]pNPY、[D-His26,Pro34]NPY、[Phe7,Pro34]pNPY、[Pro30,Nal32,Leu34]NPY(28-36)、[Pro30,Nle31,Nal32,Leu34]NPY(28-36)、NPY(28-36)、[Pro30,Tyr32,Pro34]NPY(25-36)、[Pro30,Tyr32]NPY(25-36)、[Pro30,Trp32]NPY(25-36)、[Asn28,Pro30,Trp32]NPY(25-36)、[Tyr32,Pro34]NPY(25-36)、[Pro30,Tyr31,Trp32]NPY(25-36)和NPY(25-36)中的至少一种。
在优选的实施方式中，小分子药物基团选自阿霉素、顺铂、长春新碱、去甲长春碱、紫杉醇、丝裂霉素、长春地辛、多西他赛、异维A酸、替莫唑胺、来那度胺、卡培他滨、羟喜树碱、来曲唑人参皂苷rg3、安罗替尼、伯瑞替尼和马来酸艾维替尼中的至少一种。
本发明的另一方面提供了上述主动靶向响应型多肽药物的制备方法，所述方法至少包括以下步骤：
1)在多肽自动合成仪中依次放入主动靶向型肽段和响应型片段进行反应，得到多肽产物；
2)向所述多肽产物中加入小分子药物基团进行反应；
3)以聚氨酯树脂作为底物与步骤2)的产物进行反应，得到合成的树脂；
4)对所得树脂进行切割以去除氨基酸侧链保护，纯化后即得所述主动靶向响应型多肽药物。
本发明的又一方面提供了一种成像剂，所述成像剂包括上述主动靶向响应型多肽药物或者根据上述方法制备的主动靶向响应型多肽药物。
上述主动靶向响应型多肽药物或者根据上述方法制备的主动靶向响应型多肽药物，用于治疗乳腺癌、脑癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌和尤文肉瘤中的至少一种疾病。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本发明的主动靶向响应型多肽药物是一种用于长时间药物治疗的药物，具有良好的生物相容性与低毒副作用。
2)本发明以肿瘤微环境过表达的酶及化合物响应的多肽链段为基础，提供了一种具有主动靶向患部，且在患部富集后会自发地发生形态转变的主动靶向响应型多肽药物，从而实现长时间治疗的效果。
附图说明
图1为实施例2中化合物C2靶向癌细胞结果图。
图2为实施例2中制备的化合物C2进行肿瘤小鼠治疗结果图。
具体实施方式
以下通过一些实施例对本发明做出详细表述，但本发明并不局限于这些实施例。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
所涉及细胞MCF-7、U87MG、786-O、HEC-1-B、a2780、SK-ES-1均从美国细胞典藏库购得，并依照其说明进行培养后进行试验。
实施例中的主动靶向肽段利用树脂固相合成法合成。
实施例1化合物C1[Phe6,Pro34]pNPY-GPLGLAGQ-多西他赛的合成
按照如下步骤合成化合物C1：
选用PEG-1000类聚氨酯树脂为底物，将肽段的活化原料(Boc型)按照序列顺序逐个安放在多肽自动合成仪的物料盒中，启动多肽合成仪。待原料均反应完后，取少量树脂进行切割分析，确认为所需多肽后将具有活化羧基的多西他赛放于物料罐1处进行反应。待反应结束后取少量树脂进行检测。在确认产物后用1％TFA对所合成的树脂进行切割并去除氨基酸侧链保护，随后使用制备色谱对其进行纯化至纯度为99％，纯化过程由制备色谱自行监控。将纯化后溶液旋蒸后用去离子水重溶解后过滤冻干即为化合物C1。
实施例2化合物C2[Asn28,Pro30,Trp32]NPY(25-36)-PLGLAG-阿霉素的合成
按照如下步骤合成化合物C2：
选用PEG-1000类聚氨酯树脂为底物，将肽段的活化原料(Boc型)按照序列顺序逐个安放在多肽自动合成仪的物料盒中，启动多肽合成仪。待原料均反应完后，取少量树脂进行切割分析，确认为所需多肽后将具有活化羧基的阿霉素放于物料罐1处进行反应。待反应结束后取少量树脂进行检测。在确认产物后用1％TFA对所合成的树脂进行切割并去除氨基酸侧链保护，随后使用制备色谱对其进行纯化至纯度为99％，纯化过程由制备色谱自行监控。将纯化后溶液旋蒸后用去离子水重溶解后过滤冻干即为化合物C2。
实施例3化合物C3[Pro30,Nal32,Leu34]NPY(28-36)-PLGVRG-紫杉醇的合成
按照如下步骤合成化合物C3：
选用PEG-1000类聚氨酯树脂为底物，将肽段的活化原料(Boc型)按照序列顺序逐个安放在多肽自动合成仪的物料盒中，启动多肽合成仪。待原料均反应完后，取少量树脂进行切割分析，确认为所需多肽后将具有活化羧基的紫杉醇放于物料罐1处进行反应。待反应结束后取少量树脂进行检测。在确认产物后用1％TFA对所合成的树脂进行切割并去除氨基酸侧链保护，随后使用制备色谱对其进行纯化至纯度为99％，纯化过程由制备色谱自行监控。将纯化后溶液旋蒸后用去离子水重溶解后过滤冻干即为化合物C3。
实施例4合成化合物C4～C43
本实施例中所合成化合物C4～C43，具体的操作与实施例1相同；其余条件参见表1。
表1
实施例5细胞内药物吞噬量实验
将实施例1至4中的样品C1～C45进行人乳腺癌细胞的吞噬实验。实施例2中的样品C2的测试，具体如下。
105个MCF-7人乳腺癌细胞接种于6孔板中，37摄氏度，5％CO2孵育过夜。随后在其中加入等摩尔浓度的阿霉素的自由阿霉素及C2。共同孵育8小时后收集细胞，PBS漂洗三遍后重悬细胞，流式细胞仪(厂家为美国BD，型号为FACSCalibur)分别检查10000个各自MCF-7细胞的平均荧光强度，550nm激发，610nm收集信号，结果如图1所示。从图中可以看出所合成的化合物C2具有主动靶向人乳腺癌肿瘤细胞的特性。
其他样品的测试方法与C2的测试过程相同，不同在于样品分别与C2～C39的组分对应，其相对应所用的检测仪器不一样。测试结果与上述类似，均得到了所合成的化合物具有主动靶向人乳腺癌肿瘤细胞的结论。
实施例6细胞毒性试验
将实施例1至4中的样品C1～C45进行细胞的毒性实验。具体操作如下。
以每孔5*104浓度在96孔板中种植，在孵育24小时后加入以药物浓度计5微克/毫升浓度加入培养液中，共孵育24小时后加入10微升CCK-8溶液，再孵育4小时后在490nm紫光读书器下读数，计算细胞存活率，结果见表2。
表2
注：当药物浓度为5微克/毫升时，++++表示存活率小于30％；+++表示存活率30～50％；++表示存活率50％～70％；+表示存活率大于70％。
实施例7荷乳腺瘤小鼠体内治疗实验
将实施例1至4中的样品C1～C45进行人乳腺肿瘤小鼠的治疗实验。实施例2中的样品C2的测试，具体如下。
将获得的化合物C2用PBS水配制成药物浓度为5毫克/毫升，通过尾静脉注射100微升至小鼠体内。每隔两天注射一次，总共注射4次，观察小鼠背部肿瘤相对体积变化。其结果如图2所示，说明相对于小分子药物，化合物C2对人乳腺癌瘤具有较好的抑制作用。
实施例8荷瘤小鼠体内治疗实验
将实施例1至4中的样品C1～C45进行荷瘤小鼠治疗实验，实验条件与实施例6相同。其治疗效果如表3所示。抑制率计算取样品组与对照组第十四天瘤子体积比值。
表3
注：++++表示抑制率大于85％；+++表示抑制率60％～85％；++表示抑制率40％～60％；+表示抑制率40％以下。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
