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一种广宿主表达载体、基于该载体制备的重组BacMam病毒及其应用

2021-02-01 01:51:43

一种广宿主表达载体、基于该载体制备的重组BacMam病毒及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及一种广宿主表达载体，还涉及基于该载体制备的重组BacMam病毒及其应用，本发明属于生物技术领域。

　　背景技术

　　随着生物技术的不断发展，先后出现了许多外源蛋白的表达系统，如大肠杆菌原核表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和杆状病毒表达系统，但上述表达系统的建立均需要先分别构建携带目的基因的表达载体。因实验目的不同，载体及宿主细胞的选择也不相同，表达载体的选择也需根据表达系统和宿主细胞的不同进行调整，所以导致同一目的基因需要被多次克隆至不同表达载体中，多次克隆会导致目的基因突变概率增加，资源的浪费，实验周期的延长等问题出现。经济易用的广宿主表达载体的开发与应用具有实践上的迫切性。表达载体通常包括强启动子、正确的转录起始序列、起始密码子、终止密码子、起始复制位点和抗性筛选标记等基本要素，在这些要素中，启动子在表达载体中起着关键作用，控制着外源蛋白的转录起始(Difalco等，1997)。由T7启动子控制的pET大肠杆菌表达系统，由CMV启动子控制的动物(哺乳类、禽类)细胞表达系统以及由P10启动子控制的昆虫细胞-杆状病毒表达系统是目前应用较为广泛的启动子。其中由P10启动子控制的杆状病毒表达系统具有强大的载体容量、生物安全性等优势，无论是作为表达载体还是制备疫苗都有广阔的应用前景(Zuidema等，1989)。

　　杆状病毒开始被认为只能感染昆虫细胞并在昆虫体内表达蛋白，对哺乳动物细胞不具有感染力。直到1983年Volkman等人发现，杆状病毒可以进入到哺乳动物细胞中，之后在1995年Hofmann等以AcMNPV为载体，利用CMV启动子，将BacMam病毒导入人肝细胞并表达了报告基因，1996年Boyce等还证实由RSV LTR启动子控制的BacMam病毒可以成功的在人和小鼠的细胞中表达外源基因。Wang等人2007年证实利用BacMam病毒转导哺乳动物细胞，在肝细胞中实现了高转导效率并表达乙肝表面抗原基因。这些研究结果证明，在杆状病毒引入哺乳动物细胞启动子时，可以将外源基因转导入哺乳动物细胞进行表达且此种方式已经被广泛应用(Philipps等，2005)。BacMam病毒表达系统属于杆状病毒表达系统，其特点是病毒直接感染各种细胞，就能实现基因在多种细胞中的转移与表达(许辰煜等，2004)，具有安全性好、能同时表达多个外源基因、能进行翻译后的加工与修饰(Chamorro等，2016)、转导效率高且可抵御补体的灭活(Tani等，2003)等优点。由于BacMam病毒操作简单，实验周期短，且能够生产具有活性的重组蛋白，因此，BacMam病毒可以在哺乳动物细胞中大量生产重组蛋白，用于蛋白质功能和结构的研究。BacMam病毒是一种重组杆状病毒，通过直接接种病毒就可以在哺乳动物细胞中表达外源基因，但其在昆虫细胞中只能复制，不能表达外源蛋白，外源蛋白的表达只能在转导哺乳动物细胞或哺乳动物中进行(Bieniossek等，2012)。

　　广宿主表达载体与BacMam病毒都具有广阔的应用前景，在本发明中，我们将其整合为一套更为灵活方便的表达投递系统。

　　报告基因是外源基因在真核细胞和原核细胞表达中应用的重要标签，在蛋白质转运和外源基因表达产物的细胞定位中用途非常广泛。红色荧光蛋白是Matzetal等人在1999年从海葵中分离出的一种新荧光蛋白基因，它可以在紫外线的激发下发出红色荧光，其激发波长和发射波长覆盖范围广，背景干扰小，更适于进行生物科学的研究。mCherry是经过一系列突变得到的激发和发射波长更长，荧光亮度更亮，成熟时间更短的荧光蛋白。因其颜色和单体分子的光稳定性更强，比其它荧光蛋白标签更优异，细胞毒性低，是作为报告蛋白的好选择，可用于证明载体的通用性与有效性，同时也可示踪蛋白的表达。体内和体外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响(Shaner等，2004)。

　　BVDV(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)是牛病毒性腹泻/黏膜病的病原,广泛分布于世界各地，BVDV感染在中国西部、北部、东北部等地也均有发生和持续上升的趋势(Ezanno等，2008)。根据BVDV基因组的5’非翻译区序列的不同，将BVDV分为两种基因型，BVDV 1型和BVDV 2型(Ridpath等，1994)。有效的BVDV的控制需要疫苗的免疫。20世纪，BVDV的弱毒苗和灭活苗均有商品化产品，弱毒苗免疫后能快速产生抗体激活细胞免疫，但在免疫怀孕母牛时是受限制的(Walz等，2015)。相比于弱毒苗，灭活的BVDV疫苗对胎儿既不具有免疫抑制也不致病，但需要进行多次免疫才能达到保护效果，但安全性更佳。BVDV-1b和BVDV-2型是我国主要流行的毒株(Deng等，2012)。E2蛋白位于BVD病毒粒子囊膜表面，是BVDV的免疫优势糖蛋白，能诱导感染动物产生病毒中和抗体并刺激机体发生免疫应答(Fetzer等，2005)，参与细胞识别和吸附，有参与抗原抗体反应和介导体液免疫的作用(Paton等，1992)，其作为诊断抗原和亚单位疫苗在疾病的防制上具有重要意义。近年来，有关E2疫苗的研究成为BVDV研究的热点。1996年，Bolin等把修饰后的E2基因利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达并研制成亚单位疫苗，免疫牛群后发现疫苗能够引起机体产生中和抗体，为BVDV疫苗研究开辟了新的方向。

　　发明内容

　　本发明的目的之一是提供一种广宿主表达载体及其构建方法。

　　本发明的目的之二是提供一种带有荧光蛋白报告基因的广宿主表达载体及其构建方法。

　　本发明的目的之三是提供一种能在昆虫细胞和哺乳细胞表达的重组BacMam病毒及其构建方法。

　　为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

　　本发明的一种广宿主表达载体，所述的广宿主表达载体是以pACEMam1杆状病毒转移载体为基础骨架，对其启动子、融合标签与多克隆位点进行改造，使其可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞以及昆虫细胞中均能表达目的蛋白，所述的广宿主表达载体携带CMV、T7、P10串联排列的启动子，用于增强真核基因的翻译效率的kozak序列，方便鉴定与纯化蛋白用的6his标签以及便于克隆目的基因的多克隆位点。

　　其中，优选的，所述的广宿主表达载体是通过以下方法构建得到：首先以pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒为模板，使用CMV-P10-T7-F和6his-R为特异性引物克隆得到CMV-T7-P10-6His片段，然后将扩增的片段胶回收后与pACEMam1载体经I-Ceu I、BamH I双酶切回收后的片段用T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取质粒，经PCR和单双酶切鉴定正确后进行测序，测序正确的重组质粒命名为pMulEX-ACEMam1，即为所述的广宿主表达载体，其中引物序列为：

　　CMV-P10-T7-F：5’-AGTCTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAI-Ceu IGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTC-3’

　　6his-R：5’-AGCTGGATCCBamH IGTGATGGTGGTGATGG-3’。

　　其中，优选的，所述的广宿主表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

　　进一步的，本发明还提供了一种带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体，其是在前述广宿主表达载体的基础上进一步携带了红色荧光蛋白(mcherry)报告基因。

　　其中，优选的，所述的带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体是通过以下方法构建得到：以pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒为模板，使用CMV-P10-T7-F和mCherry-R为特异性引物克隆得到CMV-T7-P10-6His-mCherry片段，将扩增的片段胶回收后与pACEMam1载体经I-Ceu I、BamH I双酶切回收后的片段用T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取质粒，经PCR和单双酶切鉴定正确后进行测序，测序正确的重组质粒命名为pMulEX-ACEMam1-mCherry，即为带有红色荧光蛋白(mcherry)报告基因的广宿主表达载体，其中引物序列为：

　　CMV-P10-T7-F：5’-AGTCTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAI-Ceu IGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTC-3’

　　mCherry-R：5’-CCAAGGATCCBamH ICTTGTACAGCTCGT-3’。

　　其中，优选的，所述的带有红色荧光蛋白(mcherry)报告基因的广宿主表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

　　进一步的，本发明还提供了所述的广宿主表达载体在宿主细胞表达外源蛋白中的应用，其中，所述的宿主细胞包括原核细胞、动物细胞以及昆虫细胞，优选的，所述的原核细胞包括但不限于大肠杆菌，所述的昆虫细胞包括蛾、蝇来源的细胞，所述的动物细胞包括哺乳动物细胞，禽类细胞。以及所述的广宿主表达载体在作为转移载体制备携带外源基因的BacMam病毒中的应用。

　　更进一步的，本发明还提供了一种表达牛病毒性腹泻病毒基因2型E2蛋白(BVDV2-E2)的重组BacMam病毒，其是通过以下方法构建得到：

　　(1)BVDV2-E2基因的克隆

　　提取BVDV2病毒RNA，并使用M-MLV将RNA反转录成cDNA，设计特异性引物BVDV2-E2-F和BVDV2-E2-R进行BVDV2-E2目的基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对目的片段进行胶回收，回收产物与pMD18-T克隆载体连接，重组质粒经单双酶切鉴定正确后测序，测序正确的重组阳性质粒命名为pMD18-T-BVDV2-E2；引物序列为：

　　BVDV2-E2-F:5’-CCTGAATGCAAAGAGGGCTTCCAAT-3’

　　BVDV2-E2-R:5’-AGCCATCTGCTCAGACAGTATTGTG-3’

　　(2)广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2的构建

　　以pMD18-T-BVDV2-E2为模板，分别设计特异性引物BVDV2-E2B-F和BVDV2-E2H-R进行目的基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对目的片段进行胶回收，回收产物分别与所述的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1经BamH I和Hind III双酶切后的片段进行连接，连接产物转化入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取重组质粒，重组质粒经单双酶切鉴定正确后测序,测序正确的重组阳性质粒命名为pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2；引物序列为：

　　BVDV2-E2H-R：5’-CGCAAGCTTHind IIITTAACGATTAGCCATCTGCTC-3’

　　BVDV2-E2B-F：5’-CCGGGATCCBamH IATGATTCCTGAATGCAAAGAGGGC-3’；

　　(3)重组BacMam病毒的制备

　　将构建的重组质粒pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2转化DH10EMBacVSVTM感受态细胞，涂布于含有Kan、Ten、Gen、X-gal和IPTG的LB琼脂板上，进行蓝白斑筛选，恒温箱培养48h后挑选若干白色菌落以及1个蓝色菌落至5mL LB培养基中37℃，220r/min摇床中培养12h，将其按照1％的菌量接种到含有Kan+、Ten和Gen的100mL LB培养基中，37℃，220r/min摇床中培养12h，进行质粒大剂量提取纯化；取以上制备的重组质粒作为模板，用M13-F和M13-R通用引物对重组杆粒进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的重组杆粒命名为DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2，即为所述的表达牛病毒性腹泻病毒基因2型E2蛋白(BVDV2-E2)的重组BacMam病毒。

　　更进一步的，本发明还提供了所述的表达牛病毒性腹泻病毒基因2型E2蛋白(BVDV2-E2)的重组BacMam病毒在制备预防和治疗牛病毒性腹泻病毒感染药物中的应用。

　　相较于现有技术，本发明的有益效果是：

　　1、本发明采用PCR和酶切连接结合的方法，构建出了一种可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达外源蛋白的广宿主表达载体，构建的载体简便快捷，通用性好，解决了在不同表达系统需要构建不同载体的繁琐。

　　2、本发明PCR和酶切连接结合的方法，构建出了一种带红色荧光蛋白标记的可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞、禽类细胞和昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达外源蛋白的广宿主表达载体，构建的载体可以快速鉴别蛋白的表达，在解决不同表达系统需要构建不同载体的繁琐操作的同时，也简化了蛋白表达的鉴定步骤。

　　3、使用上述构建的广宿主表达载体获得了一种能在昆虫细胞、禽类细胞和哺乳动物细胞表达外源蛋白的重组BacMam病毒，这使得BacMam病毒在哺乳动物细胞表达的同时也能在禽类细胞与昆虫细胞进行表达，大大扩展了BacMam病毒的应用范围。

　　4、使用构建的包含BVDV2-E2基因的重组BacMam病毒免疫小鼠后，其体内产生了特异性抗体，产生的抗体具有中和BVDV2活性，且具有淋巴细胞增殖活性，可作为BVDV候选疫苗。

　　附图说明

　　图1A为广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1的构建流程图；

　　图1B为广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1的载体图谱；

　　图2为BVDV2-E2基因片段PCR扩增(A)及酶切鉴定(B)结果；

　　其中：图A中，M：DNA分子质量；1：阴性对照；2-5：BVDV2-E2 PCR扩增产物；图B中，M：DNA分子质量；6、8：pMD-18T-BVDV2-E2 EcoR I单酶切结果；7、9：pMD-18T-BVDV2-E2 EcoRI、Hind III双酶切结果；

　　图3为BVDV2-E2基因的PCR扩增以及重组载体的酶切鉴定；

　　其中：A-C：M：DNA分子质量；1、3、5：BVDV2-E2 PCR扩增产物；2、4、6：阴性对照；D-F：M：DNA分子质量；1、3、5：pET-30-BVDV2-E2 Xho I单酶切结果；2、4、6：pET-30-BVDV2-E2 XhoI、Hind III双酶切结果；7、9：pACEMam1-BVDV2-E2 BamH I单酶切结果；8、10：pACEMam1-BVDV2-E2BamH I和Hind III双酶切结果；11：pACEMam1-BVDV2-E2重组质粒；12、14：pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2 EcoR I、Hind III双酶切结果；13、15：pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2 EcoRI单酶切结果。

　　图4为pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白SDS-PAGE分析；

　　其中：A：pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白；M：蛋白分子标准；1：pET30a空载体；2：pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白诱导前；3：pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白超声后上清；4：pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白超声后包涵体；B：pET30a-BVDV2-E2表达重组蛋白的纯化；5：40mM咪唑洗脱重组蛋白；6：80mM咪唑洗脱重组蛋白；7：100mM咪唑洗脱重组蛋白；8：150mM咪唑洗脱重组蛋白；

　　图5为pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白多抗效价的测定；

　　图6为Western blot分析pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2的原核表达；

　　其中：M：蛋白分子质量标准；1：pMulEX-ACEMam1空载体；2：rpMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2诱导前；3：rpMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2超声后上清；4：rpMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2超声后包涵体。

　　图7为Western blot分析pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2在HEK-293T中的表达；

　　其中：M：蛋白分子质量标准；1：转染pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2质粒1.6μg；2：转染pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2质粒0.8μg；3：转染pMulEX-ACEMam1空载体；4：空细胞对照。

　　图8A为带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry的构建流程图；

　　图8B为带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry的载体图谱；

　　图9为广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry启动子基因片段PCR扩增及鉴定；

　　其中：M：DNA分子质量标准；A：1-5：CMV-T7-P10-6His PCR扩增结果；6：阴性对照；B：7：阴性对照；8-10：CMV-T7-P10-6His-mCherry PCR扩增结果；C：1-3：pMulEX-ACEMam1PCR鉴定；4：阴性对照；D：5、7：pMulEX-ACEMam1-mCherry EcoR I单酶切鉴定；6、8：pMulEX-ACEMam1-mCherry EcoR I、EcoR V双酶切鉴定；9：pMulEX-ACEMam1-mCherry质粒；

　　图10为重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的原核表达；

　　其中：1：重组蛋白rpMulEX-ACEMam1-mCherry超声后沉淀；2：重组蛋白rpMulEX-ACEMam1-mCherry超声后上清；3：阳性对照pTriEx-mCherry-PA-Rac1超声后沉淀；4：阳性对照pTriEx-mCherry-PA-Rac1超声后上清；

　　图11为SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的原核表达；

　　其中：A：M：蛋白分子质量标准；1：重组蛋白rpMulEX-ACEMam1-mCherry超声后沉淀；2：重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry超声后上清；3：阳性对照pTriEx-mCherry-PA-Rac1超声后沉淀；4：阳性对照pTriEx-mCherry-PA-Rac1超声后上清；B：M：蛋白分子质量标准；5：pMulEX-ACEMam1空载体；6：pMulEX-ACEMam1-mCherry诱导前；7：pMulEX-ACEMam1-mCherry诱导后上清；

　　图12为Western blot分析重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的真核表达；

　　其中：M：DNA分子质量标准；1：HEK-293T空细胞对照；2：转染pMulEX-ACEMam1空载体；3：转染pMulEX-ACEMam1-mCherry重组质粒；

　　图13为荧光显微镜观察重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的真核表达(200×)；

　　其中：A：转染pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒；B：转染pMulEX-ACEMam1空载体；C：转染pMulEX-ACEMam1-mCherry重组质粒；

　　图14为重组杆粒DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2的PCR鉴定；

　　其中：M：DNA分子质量；1-3：DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2重组杆粒；4：野生杆粒对照；5-6：DH10EMBacVSVTM-BVDV2-E2重组杆粒；7：空对照；

　　图15为重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒的PCR鉴定；

　　其中：M：DNA分子质量；1-3：BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒；4-5：BacMam-BVDV2-E2病毒；6：空对照；

　　图16为BacMam/CPT-BVDV2-E2的电镜观察(20000×)；

　　其中：A：BacMam/CPT-BVDV2-E2电镜图；B：BacMam-BVDV2-E2电镜图；

　　图17为Western blot分析重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒在Sf9中的表达；

　　其中：M：蛋白分子标准；1：Sf9空细胞；2：BacMam/WT野生杆状病毒；3：BacMam/CPT-BVDV2-E2重组BacMam病毒；

　　图18为IFA分析重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒在Sf9中的表达(200×)；

　　其中：A：BacMam/CPT-BVDV2-E2感染Sf9；B：BacMam/WT野生杆状病毒感染Sf9；C：Sf9空细胞；

　　图19为重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒的增殖曲线；

　　图20为BacMam/CPT-BVDV2-E2感染Sf9不同时间点E2蛋白的表达；

　　其中：1-6：BacMam病毒感染Sf9细胞0h～120h；

　　图21为重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒转导HEK-293T细胞Western blot分析；

　　其中：1：Sf9空细胞；2：BacMam/WT野生杆状病毒；3-6：重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒感染复数分别为MOI＝20，16，12，8；

　　图22为重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒免疫小鼠血清抗体滴度；

　　图23为重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒免疫小鼠血清中针对BVDV2中和抗体滴度；

　　图24为脾淋巴细胞增殖检测。

　　具体实施方式

　　下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

　　实施例一：广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1的构建及鉴定

　　方法：

　　1、广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1的构建

　　以pACEMam1杆状病毒转移载体为基础骨架，对其启动子进行改造，使其可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞、禽类细胞以及昆虫细胞中均能表达目的蛋白。首先以pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒为模板，CMV-P10-T7-F和6his-R为特异性引物克隆得到CMV-T7-P10-6His片段，然后将扩增的片段胶回收后与pACEMam1载体经I-Ceu I、BamH I双酶切回收后的片段用T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen(7μg/mL)的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取质粒，经PCR和单双酶切鉴定正确后进行测序，测序正确的重组质粒命名为pMulEX-ACEMam1。

　　引物序列：

　　CMV-P10-T7-F：5’-AGTCTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAI-Ceu IGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTC-3’

　　6his-R：5’-AGCTGGATCCBamH IGTGATGGTGGTGATGG-3’

　　广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1的构建流程如图1A所示，其载体图谱如图1B所示，并且具有SEQ ID NO.1所示的序列。

　　2、BVDV2-E2基因的克隆

　　将本实验室分离保存的BVDV2型毒株在BL细胞上大量进行繁殖，Trizol法提取病毒RNA，并使用M-MLV将RNA反转录成cDNA，设计特异性引物BVDV2-E2-F和BVDV2-E2-R进行BVDV2-E2目的基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对目的片段进行胶回收。回收产物与pMD18-T克隆载体连接，重组质粒经单双酶切鉴定正确后测序，测序正确的重组阳性质粒命名为pMD18-T-BVDV2-E2。

　　BVDV2-E2-F:5’-CCTGAATGCAAAGAGGGCTTCCAAT-3’

　　BVDV2-E2-R:5’-AGCCATCTGCTCAGACAGTATTGTG-3’

　　3、原核表达载体pET-30a-BVDV2-E2的构建

　　以pMD18-T-BVDV2-E2为模板，设计特异性原核表达引物BVDV2-E2B-F、BVDV2-E2X-R进行目的基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对目的片段进行胶回收。回收产物与原核表达载体pET-30a经BamH I和Xho I双酶切后进行连接，连接产物转入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Kan(50μg/mL)的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取重组质粒，重组质粒经单双酶切鉴定正确后测序,测序正确的重组阳性质粒命名为pET-30a-BVDV2-E2。

　　BVDV2-E2B-F：5’-CCGGGATCCBamH IATGATTCCTGAATGCAAAGAGGGC-3’

　　BVDV2-E2X-R：5’-CCGCTCGAGXho ITTAACGATTAGCCATCTGCTCAGA-3’

　　4、原核表达载体pET-30a-BVDV2-E2表达重组蛋白的表达与纯化

　　将构建的重组原核表达质粒pET-30a-BVDV2-E2转化于RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞中，使用含有Kan(50μg/mL)的培养基进行筛选，经IPTG诱导表达6h，采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白rBVDV2-E2在大肠杆菌中的表达情况。大剂量表达后，用Ni亲和层析柱对重组蛋白rBVDV2-E2进行纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。纯化后的含尿素的蛋白进行透析复性并用PEG2000进行浓缩具体操作如下：(1)将透析膜在沸水中煮10min；(2)将相同浓度咪唑洗脱的蛋白流出液放于一个透析袋中，并将透析袋两端封口；(3)每间隔4h，用不含尿素的TGE透析液换液，每次更换1/3体积，换3次；更换1/2体积，换2次；最后全部换成不含尿素的TGE透析液，4h后用PEG2000进行浓缩。将浓缩后的蛋白用12％SDS-PAGE分析蛋白浓缩后情况，用BCA试剂盒测定透析浓缩后的蛋白浓度。

　　5、鼠抗BVDV2-E2多克隆抗体的制备

　　将纯化后的rBVDV2-E2蛋白与弗氏完全佐剂按照1:1的体积混合并乳化，以100μg的剂量皮下多点注射免疫小鼠；2周后，rBVDV2-E2蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，对小鼠进行加强免疫，2周后给予第三次加强免疫。第三次免疫10d后采血制备血清，将纯化后的rBVDV2-E2蛋白稀释，按照每孔100ng包被96孔酶标板(100μL/每孔)，将抗体血清从1:40依次倍比稀释作为一抗，将免疫前血清作为阴性对照，通过间接ELISA法检测抗体效价。免疫前血清为阴性对照。

　　6、广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2的构建

　　以pMD18-T-BVDV2-E2为模板，分别设计特异性引物BVDV2-E2E-F和BVDV2-E2H-R，BVDV2-E2B-F和BVDV2-E2H-R进行目的基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，对目的片段进行胶回收。回收产物分别与pACEMam1和pMulEX-ACEMam1经BamH I或EcoR I和Hind III双酶切后的片段进行连接，连接产物转化入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen(7μg/mL)的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取重组质粒，重组质粒经单双酶切鉴定正确后测序,测序正确的重组阳性质粒分别命名为pACEMam1-BVDV2-E2和pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2，其中pACEMam1-BVDV2-E2为对照载体。

　　BVDV2-E2E-F：5’-GCCGAATTCEcoR IAAATTCCTGAATGCAAAGAG-3’

　　BVDV2-E2H-R：5’-CGCAAGCTTHind IIITTAACGATTAGCCATCTGCTC-3’

　　BVDV2-E2B-F：5’-CCGGGATCCBamH IATGATTCCTGAATGCAAAGAGGGC-3’

　　7、广宿主表达载体表达BVDV2-E2重组蛋白的鉴定

　　将构建的广宿主表达重组质粒pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2转化于RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞中，使用含有Gen(7μg/mL)的培养基进行筛选，经IPTG诱导表达6h，采用Western blot分析重组蛋白BVDV2-E2在大肠杆菌中的表达情况。

　　大量提取鉴定正确的广宿主表达重组质粒pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2，随后使用LipofectamineTM2000脂质体将重组质粒转染至HEK-293T细胞，采用Western blot分析重组蛋白rBVDV2-E2在哺乳细胞中的表达情况。

　　结果：

　　1、BVDV2-E2基因的克隆

　　图2为BVDV2-E2基因片段PCR扩增及pMD18-T-BVDV2-E2的酶切鉴定结果，从该结果可以看出PCR扩增得到BVDV2-E2特异性条带，条带大小为1116bp。克隆载体连接，重组质粒pMD-18T-BVDV2-E2经EcoR I单酶切得到片段大小约为3900bp的条带，经EcoR I和Hind III双酶切得到片段大小为1100bp和2800bp两条条带，与预期相符。

　　2、pET-30a-BVDV2-E2、pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2以及pACEMam1-BVDV2-E2的酶切鉴定

　　图3为BVDV2-E2基因的PCR扩增以及重组载体的酶切鉴定，从该结果可以看出PCR扩增出1116bp大小片段，结果如图A、B、C所示。重组质粒pET-30a-BVDV2-E2、pACEMam1-BVDV2-E2和pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2进行单双酶切鉴定，单酶切分别获得6538bp、4559bp和4941bp片段，双酶切均获得1116bp的目的片段，分别获得5422bp、3443bp和3825bp的载体片段，大小均与预期相符。

　　3、pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白SDS-PAGE分析

　　图4为pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白的SDS-PAGE分析，从该结果可以看出pET-30a-rBVDV2-E2表达的重组蛋白在分子质量为50kDa处有特异性蛋白条带，大小与预期相符，并且重组蛋白以包涵体形式存在，如图4A所示。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化、透析和浓缩后，SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白pET-30a-rBVDV2-E2显示清晰的单一条带，如图4B所示。

　　4、BVDV2-E2多抗效价的测定

　　结果如图5所示，该结果说明：使用pET30a-BVDV2-E2表达的重组蛋白免疫小鼠制备了高效价的抗BVDV2-E2多克隆抗体。

　　5、广宿主载体表达BVDV2-E2重组蛋白的Western blot分析

　　图6为Western blot分析pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2的原核表达，从该结果可以看出pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2表达的重组蛋白在分子质量为46kDa处出现特异性条带，大小与预期相符，表达的重组蛋白以包涵体的形式存在。

　　图7为Western blot分析pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2在HEK-293T中的表达，从该结果可以看出pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2表达的重组蛋白在分子质量大小约为46kDa处出现特异性条带，大小与预期相符，结果表明重组蛋白可在哺乳动物细胞中表达。

　　实施例二：带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry的构建及鉴定

　　方法：

　　1.带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry的构建

　　以pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒为模板，CMV-P10-T7-F和mCherry-R特异性引物克隆得到CMV-T7-P10-6His-mCherry片段。将扩增的片段胶回收后与pACEMam1载体经I-CeuI、BamH I双酶切回收后，用T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞E.coil DH5α中，使用含有Gen(7μg/mL)的LB琼脂平板进行筛选，试剂盒提取质粒，经PCR和单双酶切鉴定正确后进行测序，测序正确的重组质粒命名为pMulEX-ACEMam1-mCherry。

　　CMV-P10-T7-F：5’-AGTCTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAI-Ceu IGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTC-3’

　　mCherry-R：5’-CCAAGGATCCBamH ICTTGTACAGCTCGT-3’

　　带有荧光蛋白标记的广宿主表达载体pMulEX-ACEMam1-mCherry的构建流程如图8A所示，其载体图谱如图8B所示，并且具有SEQ ID NO.2所示的序列。

　　2.荧光蛋白标记mCherry的广宿主表达

　　将鉴定正确的广宿主表达重组质粒pMulEX-ACEMam1-mCherry转化于大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞中，使用含有Gen(7μg/mL)的培养基进行筛选，经IPTG诱导表达6h，包涵体及上清分别处理后，观察mCherry蛋白表达时的颜色变化情况，同时采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白mCherry在大肠杆菌中的表达情况。pTriEx-mCherry-PA-Rac1作为阳性对照，空载体pMulEX-ACEMam1作为阴性对照。

　　大量提取鉴定正确的广宿主表达重组质粒pMulEX-ACEMam1-mCherry，随后使用LipofectamineTM2000脂质体将重组质粒转染至HEK-293T细胞，Western blot和直接荧光检测mCherry在哺乳动物细胞中的表达情况。pTriEx-mCherry-PA-Rac1作为阳性对照，空载体pMulEX-ACEMam1作为阴性对照。

　　结果：

　　1、广宿主表达载体启动子基因片段PCR扩增及鉴定

　　结果如图9所示，从该结果可以看出以pTriEx-mCherry-PA-Rac1质粒为模板，克隆得到CMV-T7-P10-6His(1136bp)片段以及CMV-T7-P10-6His-mCherry(1847bp)片段。重组质粒pMulEX-ACEMam1进行PCR鉴定，扩增出1136bp大小的条带，与预期大小相符。重组质粒pMulEX-ACEMam1-mCherry用EcoR I单酶切鉴定，结果获得大小约为4600bp的条带，用EcoRI、EcoR V双酶切鉴定，获得大小约为1800bp、2700bp的条带，结果与预期大小相符。

　　2、重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的原核表达

　　结果如图10所示，从该结果可以看出重组载体pMulEX-ACEMam1-mCherry能够在大肠杆菌表达，包涵体及上清均呈现粉红色。

　　3、SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的原核表达

　　结果如图11所示，SDS-PAGE分析结果可知，重组蛋白ACEMam1-mCherry在分子质量约为35kDa处出现目的条带，与预期大小相符，是可溶性表达，同时在包涵体中也有少量表达，如图A。经Western blot分析可知，表达的重组蛋白可与鼠抗His单抗发生特异性反应如图B。

　　4、Western blot分析重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的真核表达

　　结果如图12所示，结果说明：Western blot检测pMulEX-ACEMam1-mCherry在哺乳动物细胞中得到表达，蛋白大小为35kDa与预期相符。

　　5、荧光显微镜观察重组蛋白pMulEX-ACEMam1-mCherry的真核表达(200×)

　　结果如图13所示，直接荧光检测结果显示，阳性对照pTriEx-mCherry-PA-Rac1和重组质粒pMulEX-ACEMam1-mCherry转染HEK-293T，呈现特异性红色荧光，而转染空载体pMulEX-ACEMam1的细胞则未出现特异性红色荧光。

　　实施例三：广宿主重组BacMam病毒表达系统的构建及鉴定

　　方法：

　　1、重组杆粒DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2的制备

　　将构建的重组质粒pACEMam1-BVDV2-E2和pMulEX-ACEMam1-BVDV2-E2转化DH10EMBacVSVTM感受态细胞，涂布于含有Kan、Ten、Gen、X-gal和IPTG的LB琼脂板上，进行蓝白斑筛选，恒温箱培养48h后挑选若干白色菌落以及1个蓝色菌落至5mL LB培养基中37℃，220r/min摇床中培养12h，将其按照1％的菌量接种到含有Kan、Ten和Gen的100mL LB培养基中，37℃，220r/min摇床中培养12h，进行质粒大剂量提取纯化。取以上制备的重组质粒进行1:100倍稀释，作为模板，用M13-F和M13-R通用引物对重组杆粒进行PCR鉴定。PCR鉴定正确的重组杆粒命名为DH10EMBacVSVTM-BVDV2-E2和DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2。

　　2、重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒的制备

　　将Sf9细胞接种6孔板，待细胞贴壁后使用LipofectamineTM2000脂质体转染重组杆粒DH10EMBacVSVTM-BVDV2-E2和DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2。27℃培养箱培养5h，弃去原培养液，换成SFMC培养液，继续于培养箱培养7d。每日观察细胞形态直至出现合胞体样病变，收集细胞培养液上清，避光保存于4℃，作为原代毒。将100μL原代毒接种于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养到90％细胞出现合胞体样病变时，收集细胞上清。取200μL上清，用病毒DNA/RNA试剂盒提取病毒DNA，提取的DNA作为模板，用BVDV2-E2-F和BVDV2-E2-R进行PCR鉴定，鉴定正确的重组BacMam病毒命名为BacMam-BVDV2-E2和BacMam/CPT-BVDV2-E2。

　　将超离的重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒分别吸附于铜网上，作用30min，用3％的磷钨酸染液染色2min，用滤纸吸干多余液体后风干30min，将铜网置于电镜下观察杆状病毒的形态。

　　3、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒滴度的测定

　　将Sf9细胞接种6孔板，待细胞长至80％时，将BacMam-BVDV2-E2和BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒液用无血清Grace’s以10倍梯度从10-3依次稀释到10-7，将细胞板中培养液弃去，每孔加入800μL稀释好的病毒液。27℃感作2h，弃去细胞板中液体，加入2mL SFMC与低熔点琼脂糖混合物(SFMC体积:低熔点琼脂糖体积＝3:1)。室温放置至琼脂糖完全凝固，倒置于27℃培养箱，培养4d～10d，每天观察空斑形成情况，直到第二天空斑数无明显变化，用中性红室温染色30min，观察记录空斑个数：PFU/mL(病毒原液滴度)＝1/稀释倍数×空斑数×1/(接种量mL/平板)。

　　4、BacMam/CPT-BVDV2-E2的增殖曲线

　　将Sf9细胞接种6孔细胞板，细胞长至80％时，将BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒、BacMam-BVDV2-E2病毒和WT(野生未重组病毒)按照MOI＝0.1剂量感染，放于27℃培养箱培养0h、24h、48h、72h、96h和120h，收集细胞上清，TCID50法测定BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒感染Sf9细胞不同时间点病毒滴度值，制作病毒增殖曲线。

　　5、BacMam/CPT-BVDV2-E2的表达

　　将Sf9细胞接种6孔细胞板，细胞长至80％时，上述构建的重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒按照MOI＝0.1剂量感染，于27℃培养箱培养48h。收集细胞，用PBS洗3遍，用昆虫细胞裂解液处理细胞沉淀，Western blot分析BVDV2-E2在Sf9细胞中表达情况；弃去细胞培养液，PBS洗3遍；用4％多聚甲醛室温固定细胞15min，PBS洗3遍；用1％Triton-100室温作用细胞10min，PBS洗3遍；1％牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1h，PBS洗3遍；1:2000稀释鼠抗His单抗作为一抗，室温孵育1h，PBS洗3遍；1:200稀释FITC标记山羊抗鼠抗体作为二抗，室温避光孵育1h后PBS洗3次，IFA分析BVDV2-E2在Sf9细胞中表达情况。同时使用Western blot分析BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒感染Sf9细胞不同时间点BVDV2-E2表达量。

　　将HEK-293T细胞接种12孔板，待细胞长至60％时，以感染复数MOI＝20、16、12和8的BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒及BacMam-BVDV2-E2病毒接种HEK-293T细胞(病毒用无菌PBS稀释)，在37℃培养箱中孵育4.5h。弃去病毒液，用PBS洗涤一次，加入含有3mM丁酸钠2％血清的DMEM培养液。培养48h后，收集细胞，裂解液处理细胞沉淀，Western blot分析BVDV2-E2表达情况。

　　6、BacMam/CPT-BVDV2-E2表达重组蛋白免疫原性分析

　　小鼠免疫接种：将4周龄C57BL/6雌鼠随机分为5组，每组6只，分别免疫PBS、WT野生杆状病毒、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒、BacMam-BVDV2-E2病毒和甲醛灭活的BVDV2。WT、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒接种剂量为1×109PFU/只，腿部肌肉注射。灭活BVDV2作为抗原与弗氏完全佐剂等体积乳化后，按照200μg/只皮下多点注射免疫小鼠。14d后按照同样的剂量再次接种小鼠。在首次免疫后每周对小鼠进行断尾采血，分离血清保存备用。

　　特异性抗体检测：利用间接ELISA法检测血清特异性抗体。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释超离后的BVDV2作为抗原，按100ng/孔浓度包被96孔ELISA板，4℃孵育过夜；PBST洗涤3次后，用5％脱脂乳孵育，300μL/孔，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，将免疫后鼠血清用PBST从1:20开始倍比稀释，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，加入1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，加入TMD显色液100μL/孔，37℃避光显色10min；最后加入100μL/孔2mol/L H2SO4终止显色，酶标仪测定OD450nm数值。

　　血清中和试验：将MDBK细胞接种96孔细胞板，每孔1×104个细胞，细胞密度达到80％。将100TCID50 BVDV2与倍比稀释的免疫后鼠血清等体积混合，37℃作用1h后，弃掉96孔细胞板中的培养液，加入100μL/孔病毒血清混合液，37℃孵育2h，换成含2％血清的DMEM，培养箱中培养，每日观察细胞病变情况(并设有空白对照和100TCID50病毒对照孔)，用Reed-Muench法计算血清中和效价。

　　淋巴细胞增殖试验：在小鼠首免35d，分别将每组3只免疫的小鼠，眼球采血后置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台内将小鼠固定于泡沫板上，打开腹腔取出脾脏，将脾脏用PBS清洗后用200目铜网研磨脾脏，使用脾淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将细胞按照5×105个/孔接种96孔细胞板(100μL/孔)，再加入100μL BVDV2抗原刺激淋巴细胞(终浓度为10μg/mL)，同时设置空细胞对照，培养箱中培养72h。加入10μL/孔CCK-8试剂，继续培养4h，用酶标仪检测OD450nm数值。计算刺激指数SI＝OD450nm(实验孔)/OD450nm(对照孔)。

　　结果：

　　1、重组杆粒DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2的PCR鉴定

　　结果如图14所示，该结果说明：重组成功的杆粒DH10EMBacVSVTM-CPT-BVDV2-E2可以扩增出大小约为3500bp的目的片段，未重组成功的野生型杆粒片段大小约为300bp。

　　2、BacMam/CPT-BVDV2-E2的PCR鉴定

　　结果如图15所示，该结果说明：BacMam/CPT-BVDV2-E2和BacMam-BVDV2-E2经PCR扩增出大小为1160bp的目的条带，与预期相符。

　　3、BacMam/CPT-BVDV2-E2的电镜观察

　　结果如图16所示，该结果说明：BacMam/CPT-BVDV2-E2和BacMam-BVDV2-E2呈现长杆状形态，大小约为370nm。

　　4、Western blot分析BacMam/CPT-BVDV2-E2在Sf9中的表达

　　结果如图17所示，该结果说明：重组BacMam病毒BacMam/CPT-BVDV2-E2在Sf9细胞中得到表达，目的蛋白大小为46kDa，与预期大小相符。

　　5、IFA分析重组BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒在Sf9中的表达

　　结果如图18所示，IFA分析显示，与野生杆状病毒BacMam/WT和空细胞对照组相比，BacMam/CPT-BVDV2-E2感染的Sf9细胞出现特异性绿色荧光。

　　6、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒的增殖曲线

　　结果如图19所示，该结果说明：在重组BacMam病毒感染细胞后，病毒滴度逐渐升高，直到72h时滴度达到最高值，之后略有下降。

　　7、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒感染Sf9不同时间点E2蛋白的表达

　　结果如图20所示，Western blot分析结果显示，在24h时可以检测到E2蛋白的表达，48h～96h重组蛋白的表达量提高，在120h时重组蛋白表达量明显降低。

　　8、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒转导HEK-293T细胞Western blot分析

　　结果如图21所示，Western blot分析结果显示，构建的BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒能在哺乳动物细胞中表达E2蛋白，并且随着病毒感染复数增加，BacMam病毒在哺乳动物细胞中的转导蛋白表达量也提高。

　　9、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒免疫小鼠血清抗体滴度

　　结果如图22所示，该结果说明：BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒免疫组第一次免疫后的抗体效价明显高于BacMam/WT组和PBS对照组，加强免疫后抗体水平明显升高。而免疫BacMam/WT对照组和PBS组小鼠抗体水平始终低于临界值(P/N<2)。BacMam病毒免疫组抗体效价始终低于BVDV2免疫组，但是两种BacMam病毒免疫组之间没有明显差异。

　　10、BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒免疫小鼠中和抗体测定

　　结果如图23所示，该结果说明：首次免疫后14d，与野生BacMam/WT病毒组和PBS对照组相比，BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒、BacMam-BVDV2-E2病毒和BVDV2免疫组中和抗体滴度明显较高(P<0.01)；免疫后28d，实验组中和抗体滴度显著提高。BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒和BacMam-BVDV2-E2病毒两组之间没有明显差异，而BacMam病毒免疫组血清中和抗体滴度始终低于BVDV2免疫组(P<0.05)。

　　11、脾淋巴细胞增殖检测

　　结果如图24所示，该结果说明：BVDV刺激细胞后用CCK-8试剂盒检测，与BacMam/WT组和PBS组对照组相比，BacMam/CPT-BVDV2-E2病毒、BacMam-BVDV2-E2病毒和BVDV2免疫组淋巴细胞有明显的增殖(P<0.01)，表明BacMam/CPT-BVDV2-E2和BacMam-BVDV2-E2病毒免疫小鼠能诱导机体产生细胞免疫反应。

　　序列表

　　<110> 东北农业大学

　　<120> 一种广宿主表达载体、基于该载体制备的重组BacMam病毒及其应用

　　<160> 2

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 3825

　　<212> DNA

　　<213> artificial sequence

　　<400> 1

　　accggttgac ttgggtcaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 60

　　aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 120

　　caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 180

　　aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 240

　　accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 300

　　aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 360

　　ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 420

　　agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 480

　　accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 540

　　gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 600

　　tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 660

　　cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 720

　　cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 780

　　cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 840

　　ctttcctgcg ttatcccctg attgacttgg gtcgctcttc ctgtggatgc gcagatgccc 900

　　tgcgtaagcg ggtgtgggcg gacaataaag tcttaaactg aacaaaatag atctaaacta 960

　　tgacaataaa gtcttaaact agacagaata gttgtaaact gaaatcagtc cagttatgct 1020

　　gtgaaaaagc atactggact tttgttatgg ctaaagcaaa ctcttcattt tctgaagtgc 1080

　　aaattgcccg tcgtattaaa gaggggcgtg gccaagggca tgtaaagact atattcgcgg 1140

　　cgttgtgaca atttaccgaa caactccgcg gccgggaagc cgatctcggc ttgaacgaat 1200

　　tgttaggtgg cggtacttgg gtcgatatca aagtgcatca cttcttcccg tatgcccaac 1260

　　tttgtataga gagccactgc gggatcgtca ccgtaatctg cttgcacgta gatcacataa 1320

　　gcaccaagcg cgttggcctc atgcttgagg agattgatga gcgcggtggc aatgccctgc 1380

　　ctccggtgct cgccggagac tgcgagatca tagatataga tctcactacg cggctgctca 1440

　　aacttgggca gaacgtaagc cgcgagagcg ccaacaaccg cttcttggtc gaaggcagca 1500

　　agcgcgatga atgtcttact acggagcaag ttcccgaggt aatcggagtc cggctgatgt 1560

　　tgggagtagg tggctacgtc tccgaactca cgaccgaaaa gatcaagagc agcccgcatg 1620

　　gatttgactt ggtcagggcc gagcctacat gtgcgaatga tgcccatact tgagccacct 1680

　　aactttgttt tagggcgact gccctgctgc gtaacatcgt tgctgctgcg taacatcgtt 1740

　　gctgctccat aacatcaaac atcgacccac ggcgtaacgc gcttgctgct tggatgcccg 1800

　　aggcatagac tgtacaaaaa aacagtcata acaagccatg aaaaccgcca ctgcgccgtt 1860

　　accaccgctg cgttcggtca aggttctgga ccagttgcgt gagcgcatac gctacttgca 1920

　　ttacagttta cgaaccgaac aggcttatgt caactgggtt cgtgccttca tccgtttcca 1980

　　cggtgtgcgt cacccggcaa ccttgggcag cagcgaagtc gccataactt cgtatagcat 2040

　　acattatacg aagttatctg taactataac ggtcctaagg tagcgaggtc attagttcat 2100

　　agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 2160

　　cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 2220

　　gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 2280

　　catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 2340

　　gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc ctacttggca gtacatctac 2400

　　gtattagtca tcgctattac catgctgatg cggttttggc agtacaccaa tgggcgtgga 2460

　　tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 2520

　　ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta ataaccccgc cccgttgacg 2580

　　caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagacgtcg tttagtgaac 2640

　　cgtcagatca ctagatgctt tattgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgccagt 2700

　　ctcgaactta acgtgcagaa gttggtcgtg aggcactggg caggtaagta tcgggccctt 2760

　　tgtgcggggg gagcggctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg 2820

　　ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 2880

　　gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 2940

　　catcattttg gcaaagaatt ggatcggacc gaaattaata cgactcacta taggggaatt 3000

　　gtgagcggat aacaattccc cggagttaat ccgggacctt taattcaacc caacacaata 3060

　　tattatagtt aaataagaat tattatcaaa tcatttgtat attaattaaa atactatact 3120

　　gtaaattaca ttttatttac aatcaaagga gatataccat ggcacaccat caccaccatc 3180

　　acggatcccg gtccgaagcg cgcggaattc aaaggcctac gtcgacgagc tcacttgtcg 3240

　　cggccgcttt cgaatctaga gcctgcagtc tcgacaagct tgtcgagaag tactagagga 3300

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　　gatcactgct tgagcctaga agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 3600

　　gctgctgcca ccgctgagca ataactatca taacccctag ggtataccca tctaattgga 3660

　　accagataag tgaaatctag ttccaaacta ttttgtcatt tttaattttc gtattagctt 3720

　　acgacgctac acccagttcc catctatttt gtcactcttc cctaaataat ccttaaaaac 3780

　　tccatttcca cccctcccag ttcccaacta ttttgtccgc ccaca 3825

　　<210> 2

　　<211> 4536

　　<212> DNA

　　<213> artificial sequence

　　<400> 2