一种润滑避孕套及其制备方法
技术领域
本申请属于计生用品的技术领域，尤其涉及一种润滑避孕套及其制备方法。
背景技术
避孕套是生殖健康产品，以避孕、阻隔病毒、细菌，预防性传播疾病为目的，避孕套产品延伸震动和香味等，也能助性。但是，国际著名的医学期刊上发表的研究结果：《新英格兰医学杂志》报告避孕套预防艾滋病的失败率为16.7％，《英国社会科学医学杂志》报告避孕套预防艾滋病的失败率高达31％。美国国立卫生研究院(NIH)、食品和药品监督管理局(FDA)、疾病预防和控制中心(CDC)以及美国国际开发署(US-AID)共同组成的科学特别小组，研究了避孕套对乙肝、艾滋病、淋病、衣原体、梅毒、软下疳、性病淋巴肉芽肿、生殖器疱疹和尖锐湿疣等9种性传播疾病的保护效果，发现目前广泛使用的避孕套不能安全有效的防止任何一种性病传播。
究其原因，主要是精液中的病毒，例如艾滋病、乙肝、人体乳头瘤等病毒远比精子小，避孕套能阻隔精子，但是不能阻隔各种病毒、细菌。传统避孕套每只约有一亿多个120纳米以上孔径，(其乳胶膜体质量问题，存在5000到70000纳米之间的天然裂隙)，仅可对直径类似人精子大小的颗粒(直径约5000纳米)有效阻隔，而对于直径相当于或小于120纳米的颗粒物并不能完全阻隔。也就是说，42纳米的乙肝病毒、50～55纳米的人体乳头瘤病毒、120纳米的艾滋病毒、180纳米的二型疱疹病毒，完全有可能穿透传统天然胶乳避孕套。研究开发具有预防细菌、病毒及微生物功能的避孕套是当务之急。
综上所述，由于避孕套只可对直径类似人精子大小的颗粒有效阻隔，也可阻隔衣原体、支原体等病菌，但不能有效防御小于120纳米孔径的细菌或病毒。因此，传统的橡胶避孕套只能阻隔大部分精子，但是在预防病毒与病菌传播方面效果较差。可见，避孕套不等于安全套，研发一种有能直接抗菌抗病毒、又具有阻隔精子的避孕套具有重大的社会价值。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种润滑避孕套及其制备方法，能有效解决现有传统橡胶避孕套只可对直径类似人精子大小的颗粒有效阻隔，但不能有效防御小于120纳米孔径的细菌或病毒的技术缺陷。
本申请第一方面提供了一种润滑避孕套，包括避孕套本体和润滑剂；
所述避孕套本体的内表面或/和外表面附着有所述润滑剂；
所述润滑剂包括以下组分：
人溶菌酶和溶剂。
需要说明的是，本申请人溶菌酶可以为从人体中提取的人溶菌酶，也可以为重组人溶菌酶，从人体中提取的人溶菌酶和重组人溶菌酶为含有130个氨基酸，分子量约为14700Da，其氨基酸序列为：
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；
本申请重组人溶菌酶也可以为多四个氨基酸的重组人溶菌酶，多四个氨基酸的重组人溶菌酶有134氨基酸，分子量约为15,100Da，其氨基酸序列为：
EAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；
本申请重组人溶菌酶也可以为多六个氨基酸的重组人溶菌酶，多六个氨基酸的重组人溶菌酶有136氨基酸，其氨基酸序列为：
EAEAEAKVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV。
其中，上述多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的效果与重组人溶菌酶的效果相当，多四个氨基酸的重组人溶菌酶与多六个氨基酸的重组人溶菌酶的纯度和活性比重组人溶菌酶更高。
作为优选，所述润滑剂的pH值为4.5～5.5。润滑剂为酸性，使得润滑避孕套为酸性，润滑避孕套与阴道的pH环境相当，不会对阴道粘膜等造成伤害，而且人溶菌酶能在酸性环境具有活性。
作为优选，本申请所述润滑避孕套，还包括润滑液、乳化剂、防腐剂、消毒剂和增稠剂。
作为优选，所述润滑液选自甘油或/和二甲基硅油；所述乳化剂选自吐温-80；所述防腐剂选自双(羟甲基)咪唑烷基脲；所述消毒剂选自聚六亚甲基双胍；所述增稠剂选自阳离子丙烯酰胺聚合乳液。
具体的，所述增稠剂选择的产品为聚季铵盐Fs222；本申请发现，选择现有常规的增稠剂例如卡波姆会使得重组人溶菌酶活性降低，本申请选择的阳离子丙烯酰胺聚合乳液，不会影响重组人溶菌酶的活性，使得润滑剂具有一定的黏度，使润滑剂保持均匀的稳定的悬浮状态或乳浊状态。
作为优选，所述润滑剂中每1000ml的溶剂中含有：
作为优选，所述润滑剂中每1000ml的溶剂中含有：
作为优选，所述避孕套本体为男用避孕套本体。男用避孕套本体可以为现有常见的男用避孕套。
作为优选，所述避孕套本体为女用避孕套本体。女用避孕套本体可以为现有常见的女用避孕套。
本申请第二方面提供了一种润滑避孕套的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将人溶菌酶和溶剂混合，制得润滑剂；
步骤2、将避孕套本体浸润在所述润滑剂中，使得所述避孕套本体的内表面或/和外表面附着有所述润滑剂，制得润滑避孕套。
作为优选，所述润滑剂还包括润滑液、乳化剂、防腐剂、消毒剂和增稠剂；所述润滑剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将润滑液、乳化剂、防腐剂和消毒剂添加至溶剂中混合，得到混合物1；
步骤二、将人溶菌酶添加至所述混合物1中混合，得到混合物2；
步骤三、将增稠剂添加至所述混合物2中混合，制得润滑剂；
所述润滑剂中每1000ml的溶剂中含有：
本申请的目的针对现有传统橡胶避孕套只可对直径类似人精子大小的颗粒有效阻隔，但不能有效防御小于120纳米孔径的细菌或病毒的技术缺陷。因此，本申请提供了一种新型的润滑避孕套，包括避孕套本体和润滑剂；避孕套本体的内表面或/和外表面附着有所述润滑剂；润滑剂包括以下组分：人溶菌酶和溶剂。一般来说，人溶菌酶基本作为药物使用在人体体内，而本申请创造性的将人溶菌酶使用到避孕套中，将人溶菌酶涂覆在避孕套的内表面或/和外表面，由于人溶菌酶是强阳离子，带有正电荷，能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活；同时，人溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，由于粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，人溶菌酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。因此，在使用避孕套时，人溶菌酶迅速对精液或阴道中的细菌和/或病毒发生发生反应，将细菌水解，将病毒中和使其失活，从而使得避孕套具有了抗菌抗病毒的作用，对精液和/或阴道中的病毒和/或细菌能进行有效阻断，能有效预防病毒和/或细菌穿过橡胶避孕套的纳米通孔导致的性病传播。在广东省中部某市的社区中投放了本申请的润滑避孕套，试验前该社区梅毒、淋病、尖锐湿疣、生殖器疱疹的发病率分别为：55.60/10万、27.16/10万、22.41/10万和10.56/10万。本申请的润滑避孕套在该社区投入使用一年后，据卫生部门统计，该社区的梅毒、淋病、尖锐湿疣、生殖器疱疹发病率为50.21/10万、24.30/10万、20.21/10万、9.15/10万，该地区的性病发生率下降约10％左右，具有重大的社会价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例1提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后避孕套内菌落总数变化；
图2为本申请实施例1提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗变化；
图3为本申请实施例2提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后自慰器内菌落总数变化；
图4为本申请实施例2提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗变化。
具体实施方式
本申请提供了一种润滑避孕套及其制备方法，用于解决现有传统橡胶避孕套只可对直径类似人精子大小的颗粒有效阻隔，但不能有效防御小于120纳米孔径的细菌或病毒的技术缺陷。
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
以下实施例所用的人溶菌酶均为重组人溶菌酶。
其中，重组人溶菌酶：批号20170319，纯度98.50％活性单位为50000U/mg，由广州奇龙生物科技有限公司提供；重组人溶菌酶含有130个氨基酸，分子量约为14700Da，氨基酸序列为：
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGV；
本申请实施例的重组人溶菌酶通过发酵工程获得，方法为：以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20－35℃，在恒温箱上培养36－48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将重组人溶菌酶发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行蛋白含量、纯度、活性检测保存。将合格的重组人溶菌酶与无菌纯水混合，调节pH值至5后制得10000U/ml，30000U/ml，50000U/ml的重组人溶菌酶溶液；
实施例1～实施例2采用的溶壁微球菌：批号F819BD0354，为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；
实施例1～实施例2采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH6.2)，其制备方法为将二水合磷酸二氢钠11.71g，十二水合磷酸氢二钠7.85g，定容至1L，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)；
实施例1～实施例2采用的生理盐水制备方法为将氯化钠0.9g，定容至100ml，以9ml每支的量分装于试管中，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)；
实施例1～实施例2采用的培养基为液体LB培养基，液体LB培养基的制备方法为将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加适量去离子水充分溶解，用氢氧化钠调PH至7.4，并定容至1L，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，4℃保存备用，用时恢复至室温；
实施例1～实施例2采用的LB琼脂斜面，LB琼脂斜面的制备方法为将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，加适量去离子水充分溶解，用氢氧化钠调PH至7.4，并定容至1L，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，采用无菌试管，分装制成琼脂斜面，4℃保存备用，用时恢复至室温；
实施例1～实施例2采用的LB琼脂平板，LB琼脂平板的制备方法为LB琼脂斜面：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，加适量去离子水充分溶解，用氢氧化钠调PH至7.4，并定容至1L，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，采用无菌平板，分装制成琼脂平板，4℃保存备用，用时恢复至室温；
实施例1～实施例2的菌株复苏方法为：以无菌操作方式，取0.5ml液体LB培养基，滴入装有溶壁微球菌标准菌株冻干粉的安瓿瓶中，轻轻震荡，使冻干菌体溶解并充分分散，将菌体悬浮液移植入LB琼脂斜面，37℃培养箱，培养18h—24h，4℃保存备用；
实施例1～实施例2的菌株扩大培养方法为：以无菌操作方式，挑取适量菌体至LB琼脂斜面划线纯化，在(37±1)℃培养箱中培养24h，并观察单菌落形态。选取湿润，凸起，边缘光滑，呈黄色的菌落，于LB琼脂平板中再次划线纯化，在(37±1)℃培养箱中培养24h。平板于4℃保存，一个月内使用；挑取二次划线纯化的LB琼脂平板中的单菌落于50ml液体LB培养基中混匀，于(37±1)℃恒温摇床中，110r/min摇菌18h后于4℃保存，用时恢复至室温，一周内使用。取500ul菌液至50ml液体LB培养基中混匀，于(37±1)℃恒温摇床中，110r/min摇菌18h后制成菌悬液A；
实施例1～实施例2的菌悬液制备为：将上述菌株扩大培养后制得的菌悬液A离心(12000rpm，5min)收集菌体，采用磷酸盐缓冲液洗涤菌体至无培养基状态；然后，打开紫外分光光度计，调波长至450nm，于(25±1)℃室温预热，将一定量菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，并用磷酸盐缓冲液调节菌体浓度，使450nm处吸光度值为1.300。
实施例1～实施例2检测不同处理组的重组人溶菌酶的酶活性，方法为：准确量取1ml(精确至0.01ml)重组人溶菌酶样品，于适量磷酸盐缓冲液中，使其充分分散并定容至100ml，使其1min内吸光度值变化量处于0.025—0.125，且1min时读数值不应小于1.000，同一试样进行平行试验测定。然后，于(25±1)℃的室温或恒温水浴锅中，于反应管中加入上述制得的2.5ml菌悬液，加入0.5ml重组人溶菌酶的试样，反应1min时记录450nm处的读数A1，反应2min时记录450nm处的读数A2，通过公式换算得出对应的重组人溶菌酶的酶活性，每个重组人溶菌酶样品做两个平行。
结果计算公式为：
其中，I为酶活性；
∣A1-A2∣为450nm处每分钟吸光度的变化；
Ew为0.5ml检测用样品中含有原始样品的体积(ml)；
0.001为以每分钟使450nm处吸光度值下降0.001为一个活性单位。
实施例1～实施例2的溶壁微球菌平板计数方法为：以无菌操作方式，用移液枪移取1ml样品注入9ml生理盐水中，制成1:10样品稀释液A；按10倍梯度逐级稀释，至最终平板菌落总数在25—250cfu间即可；计数步骤包括：
①用三角瓶配制100ml的LB琼脂培养基，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，取出于55℃水浴锅中保温备用；
②以无菌操作的方式，用移液枪分别移取上述制得的1ml样品稀释液A于三个无菌空培养皿中，再分别加入约15ml保温备用的LB琼脂培养基，迅速摇匀，水平静置待培养基凝固；
③待平板凝固后倒置于37℃恒温培养箱中，培养24h即可计数。
实施例1～实施例2中1.0×107cfu/ml溶壁微球菌菌悬液的配制方法为：以无菌操作的方式，精确称量0.2g(精确到0.01g)经平板计数为0.5×1011cfu/g活菌数的溶壁微球菌菌粉，加适量生理盐水使菌粉充分溶解，定容至1L。溶壁微球菌因其粒径与精子接近，故采用溶壁微球菌模拟精子，以此来探究重组人溶菌酶透过避孕套及其杀菌效果。本试验以10000U/ml、30000U/ml、50000U/ml三个不同酶活力梯度的重组人溶菌酶和50000U/ml的蛋清溶菌酶为实验组，以磷酸盐缓冲液为对照组，来探究重组人溶菌酶的杀菌效果。
实施例1～实施例4中自慰器为女性健慰器，购买自宁波久爱成人用品有限公司产品，避孕套，青岛伦敦杜蕾斯有限公司产品。
实施例3～实施例4中采用的重组人溶菌酶为广州奇龙生物科技有限公司提供，纯度99.60％，活性200000U/ml，批号20190601。阳性药阿昔洛韦：中国食品药品检定研究院，批号：170630-201703，含量：99.8％；对照品蛋清溶菌酶：上海易恩化学技术有限公司，纯度98.50％，活性40000U/mg，批号201806-88-3。
实施例3～实施例4中HPV53型一株样本由中山大学附属第一医院采集提供，准确称量样本质量后用玻璃匀浆器匀浆，加入适量生理盐水配置成5mg/ml的离体混悬液，备用。取200μL混悬液，使用Takara公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒(Code No.9766)提取HPV病毒DNA；使用中山大学达安基因股份有限公司的人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型试剂盒(PCR-反向点杂交法)确定为HPV53亚型株。
实施例3～实施例4中BSC-1000-Ⅱ-B2生物安全柜(深圳市新朗普电子科技有限公司)、ESJ780-4电子天平(深圳市新朗普电子科技有限公司)、HH-1恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)、7500荧光定量PCR仪(ThermoFisher)。
实施例3～实施例4中培养基：RPMI-1640完全培养基，含有10％胎牛血清,2mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM 2-巯基乙醇，100,000IU青霉素配制而成。
实施例1
本申请实施例提供了不同酶活力的重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌的试验，具体步骤如下：
1、向避孕套中加入2ml的1.0×107cfu/ml的溶壁微球菌菌液，将避孕套套入震动棒中；
2、吸取5ml的10000U/ml重组人溶菌酶溶液于自慰器中；
3、将震动棒插入自慰器中进行涌动；
4、设10min、20min、40min、60min四个取样时间点进行取样，每时间点取100μl避孕套内溶液用于溶壁微球菌菌落总数计数，取100μl自慰器中溶液用于溶壁微球菌菌落总数计数；
5、重复以上步骤完成30000U/ml、50000U/m重组人溶菌酶溶液，以及50000U/ml蛋清溶菌酶溶液及对照组试验。结果如表1～表3和图1～图2所示，图1为本申请实施例1提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后避孕套内菌落总数变化；图2为本申请实施例1提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗变化，图1中分别标记对照(空白对照为pH值为无菌纯水)、试1(即10000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试2(即30000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试3(即50000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试4(即50000U/ml蛋清溶菌酶溶液)；图2中分别标记试1(即10000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试2(即30000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试3(即50000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试4(即50000U/ml蛋清溶菌酶溶液)。
表1重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后避孕套内菌落总数变化
注：所有样品菌落总数均按2ml体积计。
表2重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后自慰器内部的菌落透过变化
注：所有样品菌落总数均按2ml体积计。
表3重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗
从上表2可以看出，溶壁微球菌有2.6％的几率可以透过避孕套，数量很少，重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶对透过避孕套的溶壁微球菌杀菌率高达100％；
从图1可以看出添加重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶的组别的由避孕套的外表面向避孕套的内表面渗透杀菌试验后避孕套内溶壁微球菌菌落总数均明显减少，但等量同活性的重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶相比，重组人溶菌酶杀菌效果显著明显优于蛋清溶菌酶，且重组人溶菌酶随酶活力的提高，溶壁微球菌菌落总数下降增加；从图2可以看出，随着试验的进行，重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶酶活力下降，重组人溶菌酶活性下降的比较慢，蛋清溶菌酶活性下降比较快，且与图1对应曲线下降趋势趋于一致；综合图1和图2可以看出，重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶均能有效透过避孕套，且有显著的杀菌效果，重组人溶菌酶的杀菌效果明显优于蛋清溶菌酶。
实施例2
本申请实施例提供了不同酶活力的重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌的试验，具体步骤如下：
1、向避孕套中加入2ml的10000U/ml的重组人溶菌酶溶液，将避孕套套入震动棒中；
2、吸取5ml的1.0×107cfu/ml的溶壁微球菌菌液于自慰器中；
3、将震动棒插入自慰器中进行涌动；
4、设10min、20min、40min、60min四个取样时间点进行取样，每时间点取100μl避孕套内溶液用于酶活力测定，取100μl自慰器中溶液用于溶壁微球菌菌落总数计数；
5、重复以上步骤完成30000U/ml、50000U/m重组人溶菌酶溶液、50000U/ml蛋清溶菌酶溶液及对照组试验。结果图表4～表5和图3～图4所示。图3为本申请实施例2提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后自慰器内菌落总数变化；图4为本申请实施例2提供的重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗变化。图3～图4中分别标记试1(即10000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试2(即30000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试3(即50000U/ml重组人溶菌酶溶液)、试4(即50000U/ml蛋清溶菌酶溶液)。
表4重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后菌落总数变化
注：所有样品菌落总数均按5ml体积计。
表5重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶由避孕套的内表面向避孕套的外表面渗透杀菌试验后重组人溶菌酶，蛋清溶菌酶的酶活力损耗
综合图1～图4可知，图1与图3、图2与图4所对应的曲线趋势几乎一致，即重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶无论是由避孕套内向外渗透以达到杀菌效果，或是由避孕套外向内渗透以达到杀菌效果，均效果显著，且重组人溶菌酶在该实验中杀菌效果明显优于蛋清溶菌酶。
实施例3
本申请实施例提供了重组人溶菌酶、阿昔洛韦和蛋清溶菌酶抗高危型HPV病毒作用对比试验，具体步骤如下：
1、制备润滑避孕套：配方由以下原料制成，将甘油、吐温-80、聚六亚甲基双胍、二甲基硅油加入到1000ml无菌水里面搅拌均匀，再将纯度90％—99％的重组人溶菌酶加入进来混合搅拌均匀，最后将聚季铵盐Fs222入进来混合搅拌均匀，将pH值调至5即得润滑剂，其中，润滑剂中每1000ml的无菌水中含有：
50‰的甘油；1‰的吐温-80；4‰的双(羟甲基)咪唑烷基脲；2‰的聚六亚甲基双胍；20‰的聚季铵盐Fs222；50‰的二甲基硅油；3000万单位的重组人溶菌酶。
2、本试验设置空白组、重组人溶菌酶、阳性药阿昔洛韦及对照药蛋清溶菌酶组别。分4个10ml EP管，吸取3ml的5mg/ml的离体混悬液(含有HPV53亚型株病毒颗粒)于EP管中振摇均匀，并置于37℃培养箱中培养。
设倍比稀释的阳性对照品：重组人溶菌酶(30000U/ml)的应用液体；阿昔洛韦配制成500μg/ml应用液体；蛋清溶菌酶(30000U/ml)的应用液体，以磷酸盐缓冲液为对照。
具体操作方法是，把4个自慰器分别灌入2毫升上述制备的病毒混悬液；把避孕套套在震动器上，分别吸取三个阳性对照品(重组人溶菌酶、阿昔洛韦和蛋清溶菌酶)1毫升液体，分别均匀涂抹在避孕套的外表面上，把这三个涂抹了阳性对照品的套有避孕套的震动器，插入自慰器中进行涌动，分别记为阿昔洛韦组、重组人溶菌酶组和蛋清溶菌酶组，空白组为将阳性对照品替换为磷酸盐缓冲液进行上述同样试验。设四个取样时间，在10min、20min、40min、60min分别取样本10μl，使用Takara公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒(Code No.9766)提取HPV病毒DNA。使用HPV53型核酸检测试剂盒进行HPV53型荧光PCR标准曲线的制作及检测。结果如表5所述。
表5对HPV53型的荧光PCR检测结果
从表5中可以看出，从阿昔洛韦组、重组人溶菌酶组和蛋清溶菌酶组之间对比看，随着处理时间的增加，阿昔洛韦、重组人溶菌酶和蛋清溶菌酶在体外对HPV核酸降解的效果逐渐增加，阿昔洛韦和重组人溶菌酶组效果近似，阿昔洛韦和重组人溶菌酶组效果优于蛋清溶菌酶的效果，作为人源性蛋白重组人溶菌酶在体外对HPV核酸具有很好的降解效果。
实施例4
本申请实施例提供了不同酶活力的重组人溶菌酶抗高危型HPV病毒作用对比试验，步骤与实施例3相似，具体步骤如下：
1、制备润滑避孕套：配方由以下原料制成，将甘油、吐温-80、聚六亚甲基双胍、二甲基硅油加入到1000ml无菌水里面搅拌均匀，再将纯度90％—99％的重组人溶菌酶3000U～30万U/mL加入进来混合搅拌均匀，最后将聚季铵盐Fs222入进来混合搅拌均匀，将pH值调至5即得润滑剂，其中，润滑剂中每1000ml的无菌水中含有：
50‰的甘油；1‰的吐温-80；4‰的双(羟甲基)咪唑烷基脲；2‰的聚六亚甲基双胍；20‰的聚季铵盐Fs222；50的二甲基硅油；重组人溶菌酶。配置成三个组，分别为低酶活力重组人溶菌酶组、中酶活力重组人溶菌酶组和高酶活力重组人溶菌酶组，低酶活力重组人溶菌酶组为每毫升1万单位重组人溶菌酶；中酶活力重组人溶菌酶组为每毫升3万单位重组人溶菌酶；高酶活力重组人溶菌酶组为每毫升5万单位重组人溶菌酶
2、本试验设置空白组、低酶活力重组人溶菌酶组、中酶活力重组人溶菌酶组和高酶活力重组人溶菌酶组。分4个10ml EP管，吸取3ml混悬液离体混悬液(含有HPV53亚型株病毒颗粒)于10ml EP管中振摇均匀，并置于37℃培养箱中培养。
低酶活力重组人溶菌酶组为每毫升1万单位重组人溶菌酶；中酶活力重组人溶菌酶组为每毫升3万单位重组人溶菌酶；高酶活力重组人溶菌酶组为每毫升5万单位重组人溶菌酶的应用液体；磷酸盐缓冲液为对照。
具体操作方法是，把三个自慰器分别灌入2毫升上述制备的病毒混悬液；把避孕套套在震动器上；分别吸取1毫升三个不同酶活力药品液体(低酶活力重组人溶菌酶组、中酶活力重组人溶菌酶组和高酶活力重组人溶菌酶组)，分别均匀涂抹在避孕套的外表面上，把这三个涂抹药品的套有避孕套的震动器，插入自慰器中进行涌动，其中，空白对组组与上述相似，区别仅在于将不同酶活力药品液体替换为磷酸盐缓冲液。设四个取样时间，在10min、20min、40min、60min分别取样本10μl，使用Takara公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒(Code No.9766)提取HPV病毒DNA。使用HPV53型核酸检测试剂盒进行HPV53型荧光PCR标准曲线的制作及检测。
表6重组人溶菌酶低、中、高酶活力对HPV53型的荧光PCR检测结果
从表6中可以看出，随着处理时间的增加，重组人溶菌酶在体外对HPV核酸降解的效果逐渐增加，重组人溶菌酶高剂量组和中剂量组效果接近，低剂量组效果次之。重组人溶菌酶润滑液高剂量组效果最好，为避孕套抗菌抗病毒、又具有阻隔效应，提供了新的选择。
实施例5
本申请实施例提供了润滑避孕套的润滑剂为含有重组人溶菌酶的润滑剂、普通润滑液、蛋清溶菌酶润滑液的阴道粘膜刺激性试验，具体步骤如下：
按照GB 15979-2002《一次性使用卫生用品》和《消毒技术规范》2008版的规定，选用SPF级SD大鼠进行阴道粘膜刺激试验，本申请实施例的含有重组人溶菌酶的润滑剂为每1000ml的无菌水中含有：50‰的甘油；1‰的吐温-80；4‰的双(羟甲基)咪唑烷基脲；2‰的聚六亚甲基双胍；20‰的聚季铵盐Fs222；50‰的二甲基硅油；2000万单位的重组人溶菌酶；普通润滑液为市购，其配方为水、丙三醇、氢氧化钠、聚丙烯酸钠、苯甲醇、对羟基苯甲酸，聚季铵盐Fs222、吐温-80、杰马bp、聚六亚甲基双胍、二甲基硅油；蛋清溶菌酶润滑液的配方与本申请实施例的含有重组人溶菌酶的润滑剂相似，区别仅在于将蛋清溶菌酶替换掉重组人溶菌酶。
每种润滑液使用9只SPF级SD大鼠试验。分析检测结果见表7。结果表明，本申请实施例的含有重组人溶菌酶的润滑剂对大鼠阴道粘膜刺激强度为无刺激性(无充血现象、无水肿现象)，而其他二种润滑液(普通润滑液和蛋清溶菌酶润滑液)对大鼠阴道粘膜存在不同程度的刺激。
蛋清溶菌酶润滑油试验组三只动物，肉眼观察，其中一只动物阴道粘膜可见明显充血、水肿、溃疡及轻微糜烂，粘膜表面布满乳白色粘液；另外两只动物阴道粘膜可见轻微充血、水肿，粘膜表面存在少量乳白色粘液。在光学显微镜下观察(HE，×100)，均可见动物阴道粘膜上皮细胞坏死脱落，粘膜明显充血、水肿，并可见大量炎细胞浸润；
普通润滑液的动物阴道粘膜肉眼观察和光学显微镜下观察均未见明显病理性改变。按阴道粘膜刺激反应标准评分，试验用蛋清溶菌酶润滑油避孕套对阴道粘膜的刺激指数为9.88，对新西兰兔阴道粘膜具中刺激性。病理组织学结果见表7。
结果显示，含有重组人溶菌酶的润滑剂对SPF级SD大鼠的阴道粘膜均无刺激，无病理变化，说明人源性重组人溶菌酶亲和力好，更适合人避孕套润滑液的使用。但含蛋清溶菌酶的润滑液对SPF级SD大鼠的阴道粘膜有轻度刺激作用，有充血水肿，这与其蛋白的种属来源有关。
表7不同润滑液对SD大鼠的阴道粘膜刺激性试验结果
传统避孕套每只约有一亿多个120纳米以上孔径，(其乳胶膜体质量问题，还存在五千到七万纳米之间的天然裂隙)，通过试验得知，与精子大小相当的溶壁微球菌有穿过避孕套的机率，小于精子的病毒、细菌更有可能穿过避孕套感染人群。试验数据证明，添加重组人溶菌酶避孕套润滑液，可以杀灭细菌、病毒，同时，可以中和精液中的病毒，使得精液或阴道中的细菌和/或病毒无法穿过橡胶避孕套的纳米通孔，在避孕套润滑液内附着重组人溶菌酶，对男女双方预防病毒、细菌感染均有明显的保护作用。
以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
