用于生产脂质载体的方法
技术领域
本发明涉及用于生产脂质载体、例如脂质体的方法。
背景技术
脂质生物活性成分递送系统
基于脂质的生物活性成分的递送系统已经显示出在水溶性差的生物活性成分、例如主要是亲脂性的药物和几种成功上市产品的递送方面的巨大潜能。脂质载体结构(例如双层，立方形，六边形等)取决于参与该过程的磷脂/脂质浓度及其几何形状，这与它们的化学结构有关(D.Papahadjopoulos,J.C.Watkins,Phospholipid model membrane,Permeability properties of hydrated liquid crystals,Biochim.Biophys.Acta 135,639(1967)；J.Milhaud,New insights into water-phospholipid model membraneinteractions,Biochim.Biophys.Acta1663,19(2004)；D.D.Lasic,et al.,Spontaneousvesiculation,Adv.Colloid.Interface Sci.89-90,337(2001))。因此，它们可以截留疏水、亲水乃至两亲的生物活性成分。将生物活性成分预先溶解在脂质、表面活性剂或脂质与表面活性剂的混合物中省去了溶解步骤，溶解步骤是水溶性差的生物活性成分经口吸收的潜在速率限制因素，并因此限制了其有效性。然而，脂质不仅在结构和物理化学性质上有所不同，而且在其可消化性和吸收途径上也有所不同；因此，脂质赋形剂和剂型的选择对生物活性成分的生物药学和药代动力学方面具有深远的影响，包括在生物体内的吸收和分布。可以在体内和体外观察到这些作用(C.Demetzos,Pharmaceutical Nanotechnology:Fundamentals and practical applications.Springer ISBN 978-981-10-0791-0(2016))。
脂质体
脂质体是封闭的伪球形结构，其由一个或多个脂质双层组成，在其中截留水介质，且其特征为热力学上不稳定的胶态分散体(D.Papahadjopoulos,J.C.Watkins,Phospholipid model membrane,Permeability properties of hydrated liquidcrystals,Biochim.Biophys.Acta 135,639(1967)；J.Milhaud,New insights intowater-phospholipid model membrane interactions,Biochim.Biophys.Acta1663,19(2004)；D.D.Lasic,et al.,Spontaneous vesiculation,Adv.Colloid.InterfaceSci.89-90,337(2001)；V.Guida,Thermodynamics and kinetics of vesicles formationprocesses,Adv.Colloid.Interface Sci.161(1-2),77(2010)；C.Puglia,F.Bonina,Lipidnanoparticles as novel delivery systems for cosmetics and dermalpharmaceuticals,Expert Opin.Drug Deliv.9,429(2012))。脂质双层主要由磷脂和胆固醇组成，但不排除使用其它生物材料、例如聚合物作为脂质体结构单元。磷脂由于其具有两亲性而可在水环境中定向和自组装，使得其极性头最终朝向水介质，而其亲脂性烃链则通过在它们之间发生疏水性相互作用受到保护而免受水分子连接的影响。此行为由其几何特征且更具体地由其临界堆积参数(critical packing parameter)定义：
其中V是表面活性剂的尾体积，lc是碳链长度，且a0是每个分子在聚集体表面的平衡面积。例如，具有堆积参数1/2<CPP<1的分子具有截锥形状，并自组装成双层囊泡(J.N.Israelachvili et al.,Theory of self-assembly of hydrocarbon amphiphilesinto micelles and bilayers,J.Chem.Soc.,Far.Trans.2:Mol.Chem.Phys.,72,1525(1976)；R.Nagarajan,Molecular Packing Parameter and Surfactant Self-Assembly:The Neglected Role of the Surfactant Tail,Langmuir,18,31(2002))。
在脂质体表面上，可以附着小分子或大分子，例如聚合物、肽、受体特异性配体和抗体；这些改变了表面的物理化学性质。这一事实非常重要，并定义了纳米系统的功能性，这取决于其生产后即刻的物理化学特性以及随时间变化的物理稳定性。
基于脂质体的大小、双层数目、电荷、表面性质和功能性，存在几种类型的脂质体(D.Papahadjopoulos et al.,Sterically stabilized liposomes:Improvements inpharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,11460(1991)；M.Riaz,Liposome Preparation Method,J.Pharm.Sci.19 65(1996)；Y.P.Patil,S.Jadhav,Novel methods for liposome preparation.ChemPhys.Lipids.177:8-18(2014))。在过去的几年期间，与脂质体相关的研究蓬勃发展，因为开发了用于治疗目的的转运和递送载体(即药物/药品和生物药物的递送)。脂质体显示出许多重要的生物学特性，其中一些为既可以包含亲水性药物分子也可以包含疏水性药物分子的能力，可以为这些分子提供保护，可以递送至特定的细胞或细胞区室的能力，而且具有表征它们的生物的相容性，以及对其物理化学和生物学特性的灵活定制。
由于它们的双重性质(脂质体双层和亲水核)，脂质体可以用作亲脂性和亲水性生物活性成分的载体。根据它们的性质的不同，可以将不同生物活性成分置于脂质体的脂质双层内部或亲水性部分中。在第一种情况下，将生物活性成分掺入脂质体的双层中，而在第二种情况下，将生物活性成分包封在脂质体的含水内部。据报道，改变其脂质组成(磷脂以及通常具有不同结构的脂质)、ζ电位、大小和大小分布至关重要，并且可以定义体内和体外的脂质体行为(C.Demetzos,Pharmaceutical Nanotechnology:Fundamentals andpractical applications.Springer ISBN 978-981-10-0791-0(2016))。
根据生物材料的结构和几何特性、物理化学特性和能量含量的不同，通过自组装和结构组织化来生产脂质载体是决定最终药品开发的重要事实。根据其吸收、分布、代谢和排泄(ADME)特性，它与载体的物理化学特性、物理稳定性、生物活性成分的截留能力、释放速率和功效直接相关。
脂质体和其它基于脂质的纳米粒的制备方法
生产脂质体的方法包括不同技术，例如反相蒸发法，超声处理法，挤出法，法压(French press)法，均化法，乙醇注射法，脱水-再水化法，其中一种典型的技术为Bangham方法(薄膜水化法)(D.Papahadjopoulos,et al.,Sterically stabilized liposomes:Improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,11460(1991)；M.Riaz,Liposome Preparation Method,J.Pharm.Sci.19 65(1996)；Y.P.Patil,S.Jadhav,Novel methods for liposomepreparation.Chem Phys.Lipids.177:8-18(2014))。根据Bangham方法，如下获得包含脂质体的混悬液：将至少一种磷脂溶于有机溶剂、例如氯仿中，并将该溶液置于容器、例如圆底烧瓶中；然后，通过蒸发除去氯仿，在容器的底部暂时形成脂质膜，在其上添加水溶液，例如缓冲液，并混合容器内容物。按照这种方式，产生多层囊泡(MLV)，并通过尺寸减小和均化技术对其进行进一步加工，以获得脂质体，该脂质体为小的单层囊泡(SUV)。
最近，如下所述，出现了脂质体制备技术的新分类。制备巨型单层脂质体(GUV)的常规方法为：适度水化磷脂膜，电成形(使磷脂膜沉积在电极上，且随后在电场存在下水合数小时)和冷冻-解冻周期。为制备MLV，使用以下方案：在流体动力流(真空)下水合磷脂膜，溶剂-小球法和前体脂质体的水合。SUV和大型单层脂质体(LUV)通过以下方法制备：反相蒸发，将有机溶剂溶解的磷脂注入水相，洗涤剂透析以及降低MLV的尺寸和层状性(lamellarity)。为了扩大规模，微流体技术是制备脂质体和基于脂质的系统的方法。微流体涉及具有典型地在5-500nm范围内的横截面尺寸的通道中的流体流动。在过去的十年中，已经开发了几种基于微流体的新颖技术来生产脂质体。可以用于脂质体生产优势的微流体系统的特征包括：精确分配纳升体积的能力，对界面位置的精确控制，扩散为主的轴向混合以及小体积连续运行模式。另外，US20100239521公开了一种生产生物活性成分在聚合物或脂质载体中的复合物的方法。该方法包括提供复合区，给该复合区提供包含载体材料的水性介质，搅拌并加热该介质，将生物活性成分添加到水性介质中，并回收生物活性成分的载体复合物。WO2005084641公开了类似于US20100239521的方法，其中，另外，惰性气体穿过水性介质。
用于生产脂质载体的现有技术方法存在许多缺陷。因此，在许多这些方法中，使用了氯化的和其它挥发性有机溶剂。然而，这些溶剂代表安全和健康危害，并且期望避免使用它们。此外，许多现有技术的方法是复杂的和/或需要大量的资源、时间和精力。另外，通过大部分现有技术方法获得的载体的尺寸和多分散性指数并不令人满意，且由此需要额外的步骤，例如超滤。
本发明提供了用于生产脂质载体的方法，该方法成功地解决了现有技术方法的缺陷。
发明概述
本发明提供了用于生产脂质载体的方法，该方法包括在包含水和液体多元醇的液体介质中搅拌脂质和促进剂的混合物，在两步中加热该混合物，其中该混合物在第二步骤中的温度高于第一步骤中的温度，并使混合物冷却至室温。
该方法除了利用搅拌导致的机械冲击外，还利用在加热的第二步骤中温度升高导致的热冲击。这导致形成具有期望特性、例如大小和多分散性指数(PDI)的脂质载体和脂质体。
该方法无需使用氯化或其它挥发性有机溶剂即可生产脂质载体和脂质体。此外，该方法无需利用超声处理或离心。此外，该方法无需使用减压。
附图简述
图1显示使用实施例1的20％甘油的脂质体的A)强度(DI)、B)体积(DV)和C)数量(DN)的分布和峰分析。
图2显示使用实施例2的1.8胆固醇摩尔比的脂质体的A)强度(DI)、B)体积(DV)和C)数量(DN)的分布和峰分析。
图3显示实施例3的脂质体的尺寸稳定性。
图4显示实施例3的脂质体的PDI的稳定性。
图5显示实施例6的脂质体的尺寸稳定性。
图6显示实施例6的脂质体的PDI稳定性。
图7显示使用实施例9的20％甘油的脂质体的A)强度(DI)、B)体积(DV)和C)数量(DN)的分布和峰分析。
发明详述
本发明提供了用于生产脂质载体且优选脂质体的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供两亲脂质和促进剂在包含水和液体多元醇的液体介质中的混合物；
b)在30-80℃下在第一加热步骤中搅拌和加热该混合物；
c)在比第一加热步骤的温度高10-50℃的温度下在第二加热步骤中搅拌和加热该混合物；和
d)使该混合物冷却至室温。
将“脂质载体”在本文中定义为主要具有脂质性质的生物活性成分(例如药物、营养保健品(nutraceutical)、药物化妆品(cosmeceutical)等)递送系统，其主要由两亲脂质、例如磷脂或非离子表面活性剂组成。它也可以包含少量的自组装促进剂，例如脂质两亲或亲脂性生物材料(例如固醇)和非脂质两亲或亲脂性生物材料(例如聚合物)。
将“脂质体”在本文中定义为脂质载体的一个子类别，且更具体地为大小为至多800nm的球状囊泡，由至少一个脂质双层组成，并且主要包含磷脂。
将“两亲性脂质”在本文中定义为两亲性分子，其包含脂质部分并且具有1/2至1之间的堆积参数，从而使其能够形成脂质载体，且优选脂质体。本发明的天然和/或合成的两亲脂质的实例包括磷脂，例如氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(eggPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、醚脂质、心磷脂或形成囊泡的任何类型的脂肪酸-或头基-改性的磷脂。它们还包括鞘脂，例如神经酰胺，和辅助脂质(adjuvant lipids)，例如二甲基二(十八烷基)铵(dimethyldioctadecylammonium)(DDA)。形成类脂质体(niosomes)的离子型或非离子型表面活性剂，例如山梨聚糖脂质和聚山梨醇酯也属于这一类别。所有上述举出的分子的混合物均是可能的。
将“促进剂”在本文中定义为在载体中少量添加的分子或物质，其有利于上述举出的本体两亲性脂质的自组装过程，并改善最终载体的物理化学、热力学和生物物理学特性。作为流动性调节剂的促进剂将稳定载体结构并使其更具功能性。本发明的促进剂的实例包括二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)和二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)，固醇，例如胆固醇，带电荷或不带电荷的两亲性分子，脂肪酸和脂肪酸胺，例如硬脂胺，以及上述聚乙二醇化的类似物。聚合物例如刺激响应性/敏感性的聚合物，泊洛沙姆和分子量大于600的聚乙二醇(PEG)也属于该类别。所有上述促进剂的混合物也是可能的。优选地，所述促进剂为硬脂胺。
将术语“液体多元醇”在本文中定义为水溶性有机化合物，其在25℃下为液体，并包含多个羟基。液体多元醇驱动/增强两亲脂质的水合过程，促进它们在较小的载体中的自组装，并控制脂质载体和脂质体的热力学含量。在对脂质载体进行冻干的情况下，液体多元醇在冻干和重构过程中在脂质载体的物理稳定性和冷冻保护中也起关键作用。本发明的液体多元醇的实例包括甘油(甘油)、丙二醇(PG)、具有低于600的分子量的PEG及其混合物。优选地，所述液体多元醇为甘油。
将“生物活性成分”在本文中定义为对活生物体、组织或细胞有影响的成分。实例为药物或活性药物成分(API)、营养保健品、药物化妆品等。可以将一种以上生物活性成分包封或掺入到脂质载体和脂质体中，并通过口服(经口)、静脉内(iv)或其它施用方式递送至生物体内。
本方法适合于在不存在氯化的和其它挥发性有机溶剂的情况下制备各种脂质载体和脂质体。这些载体的实例为脂质体、混合/嵌合脂质体、类脂质体、混合/嵌合类脂质体和聚合物接枝脂质体。优选地，通过本发明的方法产生的脂质载体为脂质体。
通常，该方法取决于液晶材料在其相变温度(Tm)以上的流动性/迁移率，以及在该点以下的刚性。作为结果，它适合于生产由例如磷脂组成的结构。具体地，由于来自水性介质分子和助溶剂分子的水合作用，由于搅拌过程而引起的机械冲击和由于温度升高而引起的热冲击而形成脂质载体。
优选地，液体介质中分散的两亲脂质和促进剂的总浓度为5-100mg/mL。术语“mg/mL”是指每mL液体介质中所述物质的mg。术语“液体介质”是指本体水性介质(例如水)和一种或多种助溶剂(即液体多元醇)的系统。
优选地，多元醇浓度最高为液体介质的30％v/v。术语“％v/v”是指每100ml液体介质中的多元醇ml。更优选地，多元醇浓度为液体介质体积的10-30％v/v。
优选地，促进剂的总重为两亲脂质总重的0.1-20.0％w/w。术语“％w/w”是指每100mg两亲脂质中的促进剂mg。
在本发明方法的第一加热步骤中，将两亲脂质与促进剂在液体介质中的混合物加热到两亲脂质的主要转变温度(Tm)以上，即在30-80℃，同时搅拌。在第二加热步骤中，将该混合物的温度升高10-50℃，并将该混合物进一步搅拌。优选地，在每个步骤期间将搅拌速度和温度保持稳定。优选地，在第二加热步骤中，与第一加热步骤的温度相比，该混合物的温度升高20-40℃。更优选地，在第二加热步骤中，与第一加热步骤的温度相比，该混合物的温度升高25-35℃。优选地，第一加热步骤的搅拌和加热进行0.5-2小时。优选地，第二加热步骤的搅拌和加热进行0.5-4小时。优选地，两个加热步骤中的搅拌速度均为400-1000rpm。在该方法的最终步骤中，使该混合物冷却至室温(25℃)，优选冷却速率不大于5℃/min。温度水平、搅拌速度以及加热或冷却的持续时间和速率可能影响所制备的脂质载体和脂质体的物理化学性质。不过，这些参数的调整属于本领域技术人员的公知常识。
根据其组成的不同，通过本发明的方法生产的脂质载体达到约100nm，具有0.200的多分散性指数(PDI)，而没有尺寸减小或进一步加工。与利用提高过滤器或类似方法挤出的现有技术方法相比，这代表了很大的优势。应当注意，所生产的载体的物理化学特性取决于所利用的两亲脂质的Tm。例如，HSPC具有约52℃的非常高的熔化温度，而eggPC具有23℃的低得多的转变温度，并且在室温下呈液晶相。该方法仅需很少且简单的步骤即可生产出直径小且均匀的脂质载体。它们适合于口服(经口)以及静脉内(i.v.)和其它类型的施用。
尽管不一定必要，但是可以使根据本发明生产的脂质载体经历尺寸减小的过程，包括超声处理、均化和挤出。在多元醇含量低的情况下和在产生具有大直径和高多分散性的载体的组成的情况下，可以通过这样的方法来改善载体，以使它们用于口服、静脉内使用或其它类型的施用。一个挤出循环足以改善这种方法中的载体，这意味着能耗低，且由此经济成本也低。
由于多元醇的低温保护(cryo-protection)和冷冻保护(lyo-protection)，冻干过程可以应用于根据本发明生产的所有载体。冻干的产品可长期保持稳定。在多元醇浓度高于10％时，添加与初始溶液体积相等的液体介质会导致脂质载体和脂质体重新悬浮，并恢复其初始物物理化学状态和特性，即粒径、多分散性和ζ-电位。
在口服施用的情况下，可以在要求保护的方法的步骤a)、b)、c)或d)中将甜味剂或其混合物例如糖、糖替代品和矫味剂添加到液体介质中，并用作甜味因子，以及有助于冻干，因为它们可作为低温保护剂和冷冻保护剂。冻干和重构后，它们的甜味特性得以维持。糖的实例为葡萄糖、果糖和蔗糖，而一些糖替代品为阿司帕坦和糖精。
根据本发明生产的脂质载体可以装载各种亲脂性和/或亲水性天然和/或合成生物活性成分，例如药物、营养保健品和药物化妆品。在这种情况下，可以在要求保护的方法的任何步骤中，优选在a)、b)或c)期间将生物活性成分添加到液体介质中。在载体内部实现了亲水性成分的包封、亲脂性成分的掺入或两亲性成分的分布。然而，当载体经历冻干时，也可以将生物活性成分添加到冻干产品中，其中上述现象在重构期间发生。所制备的载体与生物活性成分的简单混合以及随后的涡旋或超声处理将提供有限量的包封、掺入或分布。使用冻融过程可以得到更好的结果。生物活性成分的实例包括药物、营养保健品和药物化妆品及其混合物。这些可能是典型的药物或API，基因，蛋白质，肽，激素例如胰岛素，抗体，以及类黄酮，多酚，类胡萝卜素，碳水化合物，益生元，姜黄素类例如姜黄素，它们是姜黄(姜黄(curcuma longa))提取物的成分，谷胱甘肽、硫辛酸以及维生素复合物B、C、D和K。精油和提取物也属于此类生物活性成分。在掺入和/或包封到载体中之前，无需稳定生物活性成分，并且在配制过程之后保持稳定。此外，所利用的生物材料之间的协同作用有助于它们的结合和/或包封，该过程无需利用金属成分等。该过程温度必须适合于生物活性成分，且不影响其稳定性，因此，必须适当使用在该温度下熔化的两亲脂质。可以在相同的脂质载体制剂中共同施用一种以上的生物活性成分，特别是由于这些颗粒将成分截留在不同的隔室中的能力，例如，在水性核心中包封亲水性脂质，并在脂质双层中掺入亲脂性或疏水性脂质。对于某些目的，例如，空载体的施用对于化妆品而言也具有价值，其中其组成可以提供水合作用或保护作用。
由于简单的方法参数、准确度和可重复的结果、时间效率、低成本、不存在氯化的和挥发性有机剂溶、安全和低温，因此，本发明的方法可以便利地按比例放大并在工业中利用，其中使用或不使用尺寸减小技术。
实施例
本发明通过下列实施例示例：
实施例1
HSPC:硬脂胺脂质体的制备
称重摩尔比为9:0.25的HSPC(30.0mg)和硬脂胺(0.3mg)，并将其置于大的球形烧瓶中。将3mL纯水与溶解的甘油20/15/10％v/v添加到烧瓶中，并将该混合物涡旋短暂时间。在硅油浴中放入磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。然后，在相同的搅拌下，将该混悬液在90℃加热1小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL的HPLC-级水稀释，并用光子相关光谱法(PCS)测量，以计算脂质体的大小、多分散性和ζ-电位。然后，将该混悬液在90℃下以700rpm加热1小时，冷却后，再测量50uL的样品。制备的脂质体的结果如表1中所示，而使用20％甘油的颗粒的强度、体积和数目的大小分布如图1中所示，其中对于每个示意图，存在3条曲线，在这种情况下，它们彼此非常接近。下面给出三种方法的峰分析面积和平均值：
强度峰分析
体积峰分析
数目峰分析
表1
实施例2
eggPC:胆固醇:硬脂胺脂质体的制备
称重摩尔比为9:0.5:0.25或9:1.8:0.25的EggPC(30.0mg)、胆固醇(0.8/3.0mg)和硬脂胺(0.3mg)，并将其置于大的球形烧瓶中。将3mL纯水与溶解的甘油20％v/v添加到烧瓶中，并将该混合物涡旋短暂期限。在硅油浴中放入磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。然后，在相同的搅拌下将该混悬液在90℃加热2小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算脂质体的大小和多分散性。制备的脂质体的结果如表2中所示，而使用1.8胆固醇摩尔比的颗粒的强度、体积和数目的大小分布如图2中所示，其中对于每个示意图，存在三条曲线，在这种情况下非常它们彼此接近。下面给出三种方法的峰分析面积和平均值：
强度峰分析
体积峰分析
数目峰分析
表2
实施例3
通过本发明方法制备的脂质体的物理稳定性
开发了包含HSPC:硬脂胺9:0.25、eggPC:胆固醇:硬脂胺9:1.8:0.25和DSPC:硬脂胺9:0.25的脂质体，并通过使用PCS测量其大小和多分散性来评估它们的物理/胶体稳定性约30天期限。
称重摩尔比9:0.25的HSPC(30.0mg)和硬脂胺(0.3mg)、摩尔比9:1.8:0.25的eggPC(30.0mg)、胆固醇(3.0mg)和硬脂胺(0.3mg)和摩尔比9:0.25的DSPC(30.0mg)和硬脂胺(0.3mg)，并放入单独的大球形烧瓶中。将3mL纯水与溶解的甘油20％v/v添加到烧瓶中，并将该混合物涡旋短暂时间期限。在硅油浴中放入磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。然后，在相同的搅拌下，将该混悬液在90℃加热1小时。将形成的混悬液以3℃/min的速度冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算脂质体的大小和多分散性。重复测量30天期限，以评估脂质体的物理/胶体稳定性，且结果如图3和图4中所示。
实施例4
大量脂质体的尺寸和尺寸异质性的减小
如实施例1所述，通过混合2000.0/1000.0/500.0mg的EggPC/DPPC/HSPC和5.0/10.0/20.0mg的硬脂胺、添加200/100/50mL纯水与溶解的甘油10％/15％/20％v/v并且在90℃加热2小时制备摩尔比为9:0.25的EggPC/DPPC/HSPC:硬脂胺脂质体。使最终制剂通过孔径为200nm的聚碳酸酯滤膜挤出。用PCS测量挤出前后的尺寸和多分散性且如表3中所示。
表3
实施例5
脂质体的冻干
将实施例1的制剂冻干并重构。将每种制剂的500uL样品用干冰和丙酮冷冻，并立即以10-2至10-1mbar冻干。该过程的结果取决于制剂内甘油的量。较高量的甘油产生凝胶状产物，而较低量产生粉末。通过添加等量的初始纯水体积适量至500uL来实现重构。将50uL样品用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算脂质体的大小、多分散性和ζ-电位。结果如表4中所示。
表4
实施例6
亲脂性生物活性分子的掺入和复合物的物理稳定性
将姜黄素以摩尔比9:0.25:0.8、9:0.25:1和9:0.25:2HSPC:硬脂胺:姜黄素添加到实施例1的初始脂质混合物中。总脂质浓度为10-50mg/mL。甘油浓度在5-20％v/v之间改变。对于每种情况，将一块磁铁放入硅油浴中，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。然后，在相同搅拌下将该混悬液在90℃加热2小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算脂质体的大小和多分散性。结果如表7中所示。还通过重复测量30天期限来评估第一和第三制剂的物理/胶体稳定性，且结果如图5和6中所示。
表7
实施例7
该实施例与本发明无关。它显示了不使用促进剂且进行一步加热的过程结果。
称重HSPC或eggPC(150.0mg)，并将其放入一个大的球形烧瓶中。应当注意，两种脂质的Tm显著不同，即HSPC为52℃，eggPC为23℃。将5mL纯水与溶解的甘油3％v/v加入到烧瓶中，并将该混合物短暂涡旋。在硅油浴中放入磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算粒径和多分散性。结果如表8中所示。
表8
实施例8
本实施例与本发明无关。它显示了其中使用促进剂且进行一步加热的过程的结果。
称重摩尔比9:0.25的HSPC(50.0mg)和硬脂胺或DPPG(分别为0.5或1.3mg)，并将其置于大的球形烧瓶中。将5mL纯水与溶解的甘油3％v/v添加到烧瓶中，并将该混合物涡旋短暂时间期限。在硅油浴中放入磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌1小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算粒径、多分散性和ζ-电位。结果如表9中所示。
表9
实施例9
本实施例与本发明无关。它显示了一种方法，其中第二加热步骤在与第一加热步骤相同的温度下进行。
称重摩尔比9:0.25的HSPC(30.0mg)和硬脂胺(0.3mg)，并将其置于大的球形烧瓶中。将3mL纯水与溶解的甘油20/15/10/5％v/v添加至烧瓶中，并将该混合物涡旋短暂时间期限。在硅油浴中放入一块磁铁，并将该混合物在60℃加热，同时以700rpm搅拌2小时。将形成的混悬液以3℃/min的速率冷却至室温，并提取50uL样品，将其用2950uL HPLC-级水稀释并用PCS测量，以计算粒径和多分散性。然后，将该混悬液在60℃下以700rpm再加热1小时，冷却后，再测量50uL的样品。结果如表10中所示，而使用20％甘油的颗粒的强度、体积和数目的大小分布如图7中所示，其中对于每个图存在3条曲线。下面给出三种方法的峰分析面积和平均值：
强度峰分析
体积峰分析
数目峰分析
表10
表10的前6个脂质载体的组成与表1(实施例1)的载体的组成相同。本实施例的方法不同于实施例1的方法的方面在于在第二加热步骤中没有温度升高。结果表明，缺乏温度跃迁对获得的脂质载体的性质产生负面影响。
