一种囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种囊泡，特别是可抗吞噬且靶向肿瘤细胞的囊泡，及其制备方法和应用，以及一种包载药物的囊泡及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是活细胞主动分泌到胞外环境的，由磷脂双分子层包被的微小囊泡，其尺寸在30-150nm之间，其在血液、唾液以及各种体液种均可被检测到。外泌体携带与其来源细胞相关的信息，其内容物包括蛋白质、mRNA、miRNA、DNA片段、lncRNA、磷脂等。外泌体膜表面除了共有标记物(如CD9、CD63、CD81等)外，亦表达多种特异性标记物(如GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256、EpCAM等)。通常，外泌体被认为是细胞间通讯的重要介质，因而在调节免疫应答、炎症、感染和肿瘤发生发展等许多机体的生理和病理过程中起到了至关重要的作用。
作为天然囊泡，外泌体有望成为生物医学应用的理想载体。目前已有研究从干细胞、树突状细胞等细胞系中分离获得外泌体来靶向递送治疗性核酸、蛋白以及药物。同种细胞系来源的外泌体比传统的合成药物载体要具有很多优势，如有限的免疫原性、靶向特定细胞、更强的循环稳定性和固有生物相容性。
外泌体作为天然药载靶向递送系统，尽管有这些优势，但仍然存在一些挑战：首先外泌体在体内会遇到大量吞噬细胞的吞噬作用，所以要避免载药外泌体被吞噬而顺利达到肿瘤病灶处是需要改良和优化外泌体表面蛋白来应对机体内的大量吞噬作用；另外是缺乏可流程化地将药物或基因载入外泌体的技术方法从而实现量产达到临床需求的情况。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种人工合成的囊泡、包载药物的囊泡，及其制备方法和应用。
本发明第一方面提供一种囊泡，其包含双亲分子形成的双分子层以及功能组分。
具体地，上述双分子层形成封闭的空心结构，上述功能组分可以连接在双分子层表面或嵌入双分子层中。
在本发明的一个实施方式中，上述功能组分包含CD47；在本发明的一个实施例中，CD47来源于红细胞。
在本发明的一个实施方式中，上述功能组分包含细胞粘附分子，例如上皮细胞粘附分子(EpCAM)、人半乳凝集素-3蛋白(Galectin 3)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、E-cadherin、β-环连蛋白(β-catenin)、连接粘附因子A(JAM-A)、CD44、LSECtin等中的一种或多种；具体地，上述细胞粘附分子来源于肿瘤细胞，其可粘附到同源肿瘤细胞上；在本发明的一个实施例中，细胞粘附分子来源于人乳腺导管癌细胞BT-483细胞。
具体地，上述功能组分可以包含从红细胞获得的膜表面蛋白，其中包含CD47。
具体地，上述功能组分可以包含从肿瘤细胞(例如BT-483细胞)获得的膜表面蛋白，其中包含细胞粘附分子，如EpCAM、Galectin 3、N-cadherin等。
具体地，上述膜表面蛋白的制备可以采用本领域任何已知的可用方法，例如Dermot Walls and Sinéad T.Loughran(eds.),Protein Chromatography:Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,vol.1485,DOI10.1007/978-1-4939-6412-3_21的Chapter 21中Strategies for the Purification of Membrane Proteins.所描述的方法，具体例如，低渗裂解、机械破膜法和差异离心等。
在本发明的一个实施例中，上述功能组分包括红细胞膜表面蛋白和BT-483细胞膜表面蛋白；其中，红细胞膜表面蛋白和BT-483细胞膜表面蛋白的质量比为0.1-10:1(具体如0.1:1、0.2:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6:1、8:1、10:1)，如1:1。
具体地，上述双分子层与功能组分的质量比为100-1000:1(具体如100:1、150:1、200:1、220:1、240:1、260:1、280:1、300:1、350:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1)，特别是200-350:1。
在本发明的一个实施方式中，上述双分子层为脂质双分子层，其制备原料包括磷脂和胆固醇。
具体地，上述磷脂可以选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂中的一种或多种；更具体地，上述磷脂可以选自：大豆磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，上述磷脂包括1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱和1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱；其中，1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱与1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱的质量比可以为1-10:1(具体如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.8:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1)，特别是1-2:1。
具体地，上述磷脂与胆固醇的质量比可以为1-50:1(具体如1:1、5:1、10:1、12:1、14:1、15:1、16:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1)，特别是10-20:1。
具体地，上述囊泡具有球形结构，其平均粒径为50-500nm(具体如50、100、110、120、130、140、150、200、250、300、400、500nm)，特别是100-200nm。
本发明第二方面提供一种上述囊泡的制备方法，其包括将功能组分与双分子层结合的步骤。
具体地，上述制备方法包括如下步骤：将磷脂膜与功能组分混合，加热并涡旋，得到囊泡。
具体地，上述加热的温度为40-50℃(具体如40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50℃)；在本发明的一个实施例中，上述温度为45℃。
具体地，上述涡旋处理的时间为1-60分钟(具体如1、5、10、15、20、25、30、40、50、60分钟)，特别是10-30分钟。
具体地，上述制备方法还可包括磷脂膜的制备步骤，该磷脂膜的制备步骤包括：将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂，然后除去有机溶剂，得到磷脂膜。
具体地，上述磷脂可以选自：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂中的一种或多种；更具体地，上述磷脂可以选自：大豆磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，上述磷脂包括1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱和1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱；其中，1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱与1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱的质量比可以为1-10:1(具体如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.8:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1)，特别是1-2:1。
具体地，上述磷脂与胆固醇的质量比可以为1-50:1(具体如1:1、5:1、10:1、12:1、14:1、15:1、16:1、18:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1)，特别是10-20:1。
具体地，上述有机溶剂可以选自：氯仿、甲醇、乙醚、乙醇中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，上述有机溶剂包含氯仿和甲醇；其中，氯仿和甲醇的体积比可以为1-10:1(具体如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.8:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、8:1、10:1)，特别是1-5:1。
具体地，磷脂和胆固醇与有机溶剂的质量体积比可以为1-50:1(mg/ml)(具体如1:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1)，特别是5-15:1。
具体地，上述除去有机溶剂的方法可以为旋转蒸发。
具体地，上述囊泡的制备方法还可包含功能组分的制备步骤，例如根据现有技术中任何可用的方法(例如Dermot Walls and Sinéad T.Loughran(eds.),ProteinChromatography:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.1485,DOI 10.1007/978-1-4939-6412-3_21的Chapter 21中Strategies for the Purificationof Membrane Proteins.所描述的方法)制备细胞膜表面蛋白(例如红细胞膜表面蛋白、BT-483细胞膜表面蛋白)。
本发明第三方面提供一种上述囊泡在制备药物载体中的应用。
本发明第四方面提供一种包载药物的本发明上述的囊泡。
具体地，上述药物的包载可通过现有技术中已知的任何适当的方法进行，例如硫酸铵梯度法。
在本发明的一个实施方式中，上述药物为抗肿瘤药物；具体地，该抗肿瘤药物可以选自：氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙酸氮芥、卡氮芥、环己亚硝脲、甲环亚硝脲、嘧啶亚硝脲、福莫司汀、噻替哌、二溴卫矛醇、二去水卫矛醇、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、喃氟啶、氟铁龙、希罗达、阿糖胞苷、吉西他滨、卡莫氟、巯基嘌呤、阿霉素、盐酸阿霉素、表阿霉素、表柔比星、吡柔比星、阿克拉霉素、柔红霉素、米托蒽醌、链脲菌素、丝裂霉素、博来霉素、放线菌素D、光神霉素、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、龟臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、托瑞米芬、依西美坦、来曲唑、比卡鲁胺、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、曲妥珠单抗等中的一种或多种；在本发明的一个实施例中，上述药物为阿霉素或盐酸阿霉素。
具体地，上述包载药物的囊泡中，药物的包封率可达85％以上，特别是90％以上。
本发明第五方面提供一种上述包载药物的囊泡的制备方法，其包括如下步骤：将药物水溶液加入囊泡悬液中，温育；其中药物和囊泡具有本发明上述相应定义。
具体地，上述制备方法还可包括：将温育后的液体进行透析(例如通过1000kDa透析袋)，以除去未被包载的药物等杂质。
具体地，上述制备方法中，药物与囊泡的双分子层的质量比可以为1:10-100(具体如1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100)，特别是1:10-50。
具体地，上述包载药物的囊泡的制备方法还包含囊泡的制备步骤(例如本发明上述囊泡的制备步骤)。
本发明第六方面提供一种上述囊泡和包载药物的囊泡在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，包括但不限于：肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、口腔癌、鼻咽癌、淋巴瘤、白血病等等；在本发明的一个实施例中，上述肿瘤为乳腺癌。
本发明第七方面提供一种药物组合物，其包含本发明上述包载药物的囊泡，以及药学上可接受的辅料。
具体地，上述药学上可接受的辅料为药学领域常规的药物辅料，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物等；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
具体地，根据所需给药方式，上述药物组合物将包含约1至约99重量％(具体如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％)的本发明上述包载药物的囊泡，其余为适宜的辅料。
具体地，上述药物组合物可用于以任何适宜的途径给药，例如，静脉注射、肌内和皮下注射、口服给药、眼部给药、肺部给药、经皮给药、鼻腔给药等等。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如，使活性成分与一种或多种辅料混合，然后将其制成所需的剂型。
具体地，上述药物组合物中，本发明上述包载药物的囊泡可以作为唯一的活性成分，也可与一种或多种其它用于相同适应症的活性成分联用。
本发明第八方面提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括给与受试者治疗有效量的本发明上述包载药物的囊泡的步骤。
在本发明的一个实施方式中，上述疾病为肿瘤，包括但不限于：肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、胃食管腺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、输卵管癌、子宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌、阴茎癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、脑癌、口腔癌、鼻咽癌、淋巴瘤、白血病等等；在本发明的一个实施例中，上述肿瘤为乳腺癌。
本发明提供了一种可稳定量产的、可抵抗体内吞噬作用、可靶向肿瘤细胞的囊泡，其对药物的包封率高，稳定性好，包载药物后可有效实现靶向治疗，特别是对肿瘤(如乳腺癌)的靶向治疗，有效抑制肿瘤组织的增殖，且该囊泡可抵抗巨噬细胞吞噬，增强抗肿瘤治疗效果。另外，该囊泡可通过更换功能组分及载药等，实现定制，靶向不同癌肿，满足个性化治疗的需求。
附图说明
图1所示为评估实施例1中人工合成的微囊泡的形态及特性NTA分析微囊泡粒径的结果图。
图2所示为通过western blot鉴定微囊泡表面蛋白的结果图。
图3所示为微囊泡粒径稳定性的结果图，其中，a图为微囊泡在20％FBS中的粒径稳定性评估结果图，b图为微囊泡在pH7.4PBS中的粒径稳定性评估结果图。
图4所示为微囊泡膜蛋白活性评估结果图。
图5所示为有整合膜蛋白的微囊泡载药后在各溶液中的释放曲线。
图6所示为微囊泡中DOX含量荧光强度结果，其中，上图为微囊泡中DOX含量荧光强度结果图(其中细胞核经过Hoeschst 33342染色显示蓝色，细胞浆中因摄入了DOX显示红色)，下图为微囊泡中DOX含量荧光强度对比结果。
图7所示为细胞活力检测结果，其中，a图为未包载DOX微囊泡影响肿瘤细胞活力情况，b图为包载不同浓度DOX微囊泡体外抑制肿瘤细胞活力情况。
图8所示为包载DOX(6.5mg/kg)的微囊泡注射到小鼠体内后，两组微囊泡在血液中的滞留/抗吞噬情况。
图9所示为各组微囊泡对荷瘤裸鼠体内抗肿瘤作用，其中，a图为不同时间点各组肿瘤生长曲线(means±SD，n＝5；t-test，**p＜0.01)，b图为不同时间点裸鼠体重变化(means±SD，n＝5)，c图为代表性肿瘤照片，d图为荷瘤小鼠的H&E染色肿瘤切片。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
“磷脂”是指含有磷酸的脂类，根据磷脂的主链结构可分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，其中，磷酸甘油酯(phosphoglycerides)主链为甘油-3-磷酸，甘油分子中的另外两个羟基都被脂肪酸所酯化，磷酸基团又可被各种结构不同的小分子化合物酯化后形成各种磷酸甘油酯，根据极性头部基团的不同，磷酸甘油酯可分为磷脂酰胆碱(卵磷脂)(Phosphatidylcholines，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamines，PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serines，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidyl inositols，PI)、磷脂酰甘油(PG)、甘油磷脂酸(phosphatidic acid，PA)等；鞘磷脂是含鞘氨醇或二氢鞘氨醇的磷脂，其分子不含甘油，是一分子脂肪酸以酰胺键与鞘氨醇的氨基相连。
“囊泡”在本发明中是指某些两亲性分子，如许多天然的、合成的表面活性剂及不能简单缔合成胶团的磷脂，分散于水中时会自发形成的一类具有封闭双层结构的分子有序组合体；如果这些两亲分子是天然表面活性剂磷脂，则形成的结构称为脂质体。囊泡具有微结构，在本发明中有时也称为“微囊泡”。在本发明中单独提到的“囊泡”为空白囊泡，即未包载药物或其他预防和/或治疗疾病的活性成分的囊泡。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：制备获得嵌合有特定膜蛋白的仿生微囊泡
通过低渗裂解、机械破膜法和差异离心获得红细胞和BT483细胞表面的膜蛋白，经Western blot实验确认获得红细胞膜蛋白CD47和BT483细胞膜表面EpCAM、Galectin3、N-Cadherin后，将红细胞膜表面蛋白和BT-483细胞膜表面蛋白按照质量1:1、于PBS(pH 7.4)中混合获得混合膜蛋白。
膜蛋白分离纯化方法参考：Dermot Walls and Sinéad T.Loughran(eds.),Protein Chromatography:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.1485,DOI 10.1007/978-1-4939-6412-3_21这本书中Chapter 21中Sinéad M.Smith写的Strategies for the Purification of Membrane Proteins.
通过薄层蒸发法和挤压法制备获得人工合成微囊泡。即首先将1.5ml和氯仿和0.5ml甲醇混合获得混合有机物，然后将10.8mg 1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱、7.2mg 1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱、1.2mg胆固醇(Lipoid，德国)溶解在上述2ml混合有机物中。然后通过IKA旋转蒸发器RV10(IKA，Germany)将溶剂蒸发形成薄膜。再将这个薄膜与70μg的混合膜蛋白混合，然后45℃加热和轻轻涡旋20min，获得人工合成微囊泡。
通过透射电镜和NTA粒径分析确认定制获得的人工合成微囊泡的形态和大小，结果如图1所示。通过Western Blot实验检测该定制获得的人工合成微囊泡表面蛋白分子，结果如图2所示，其表明所合成的囊泡表面包括CD47、EpCAM、Galectin3、N-Cadherin。
人工合成微囊泡在PBS和FBS中稳定性评估：将人工合成微囊泡(10mg/ml)分别与PBS和20％的胎牛血清于37℃进行孵育。结果如图3所示。
采用转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)作为模型评估膜蛋白的原始生物学活力，即将上述定制的获得的人工合成外泌体和转铁蛋白偶联的金纳米颗粒(5纳米)进行孵育，然后通过投射电镜进行观察。结果如图4所示，结果表明，金纳米粒子可以与上述定制的获得的人工合成微囊泡表面的转铁蛋白受体相互作用，说明上述定制获得的人工合成微囊泡的表面蛋白具有一定的生物学功能的。
实施例2：人工合成微囊泡包载盐酸阿霉素DOX
1.通过硫酸铵梯度法将DOX包载至微囊泡中：将DOX水溶液(5mg/mL)分别加入到无膜蛋白的微囊泡和有整合膜蛋白的微囊泡悬液中，按照阿霉素/脂材＝(1/20，w/w)，孵育即得，其中脂材包含10.8mg 1,2-二棕榈酸磷脂酰胆碱、7.2mg 1,2-二硬脂酰磷脂酰胆碱、1.2mg胆固醇(Lipoid，德国)。获得的囊泡随后通过1000kDa透析袋透析过夜，以消除原材料和未合并的蛋白质。采用紫外分光光度法测定DOX载药率情况。
2.确定检测波长：配制盐酸阿霉素水溶液(25μg/mL)，以蒸馏水为空白对照，在波长200～800nm范围内进行紫外全波长扫描，根据吸收光谱情况发现盐酸阿霉素的最大吸收波长为λ＝485nm，因此选择485nm作为检测波长。
3.建立标准曲线：以PBS(pH7.4)为溶剂，配制成0.25、0.5、1、2、5、10、20、40μg/mL的盐酸阿霉素溶液。使用紫外可见分光光度计，波长为485nm，测定上述各标准溶液的吸光度(Abs)。以Abs(y)对浓度(x)做线性回归方程。盐酸阿霉素溶液在0.25～40μg/mL范围内，Abs(y)与浓度(x)呈良好的线性关系。以Abs(y)对浓度(x)做线性回归方程。线性回归方程为y＝0.0182x+0.0114，R2＝0.9949。
4.测定微囊泡包封率：包封率为被包封在微囊泡中的药物占总投药量的百分比。包封率的大小是评价载药微囊泡的重要指标。
精密吸取制备的阿霉素微囊泡0.5mL，上Sephadex G50柱(径高比1/6)，用PBS(pH7.4)洗脱，收集微囊泡部分，置于5mL容量瓶中，加入10％
Triton-X100 0.2mL，用PBS(pH7.4)稀释至刻度，摇匀。以PBS(pH7.4)为空白，波长为485nm，用紫外可见分光光度计测定吸光度值，并将吸光度值代入标准曲线中计算得到微囊泡中的阿霉素的浓度(CDOX1)。
另精密吸取制备的阿霉素微囊泡0.5mL，置于5mL容量瓶中，加入10％Triton-X1000.2mL，用PBS稀释至刻度，摇匀。以PBS为空白，波长为485nm，测定吸光度值，并将吸光度值代入标准曲线中计算得到阿霉素微囊泡中的总投药量(CDOX2)。
EE(％)＝(CDOX1×V1/CDOX2×V2)×100％
EE是指包封率，CDOX1指包于微囊泡中的阿霉素的浓度，CDOX2指微囊泡中的总投药量，V1＝V2＝5mL。
结果表明无膜蛋白的微囊泡和有整合膜蛋白的微囊泡针对盐酸阿霉素的包封率分别约为92.68％±2.0％和93.46％±1.8％，两者之间没有差异，符合后续实验要求。
5.评估载药稳定性
5.1扫描荧光光谱：取适量阿霉素水溶液，浓度为40μg/mL，用F-380荧光分光光度计在200nm～800nm波长范围进行光谱扫描(扫描速度：240nm/min，灵敏度：2.0s，激发狭缝：2.5nm，发射狭缝：2.5nm)。由荧光光谱扫描结果得知盐酸阿霉素的最大激发波长λex＝480nm，最大发射波长λem＝590nm。
5.2建立标准曲线：称取一定量的盐酸阿霉素原料，分别用PBS(pH7.4)、20％FBS、PBS(pH7.4)-20％FBS(v/v,1:1)溶解。配制浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5、10μg/mL系列标准溶液。分别以PBS(pH7.4)、20％FBS、PBS(pH7.4)-20％FBS(v/v,1:1)为空白对照。采用F-380荧光分光光度计，设置激发波长λex＝480nm，发射波长λem＝590nm，测定系列标准溶液的荧光强度。以荧光强度(y)对浓度(x)做线性回归方程，结果如下：
盐酸阿霉素PBS(pH7.4)溶液在0.025～5μg/mL范围内，荧光强度(y)与浓度(x)呈良好的线性关系。以荧光强度(y)对浓度(x)做线性回归方程。线性回归方程为y＝2783.2x+490.31，R2＝0.9873。
盐酸阿霉素20％FBS溶液在0.025～5μg/mL范围内，荧光强度(y)与浓度(x)呈良好的线性关系。以荧光强度(y)对浓度(x)做线性回归方程。线性回归方程为y＝1549.5x+106.51，R2＝0.9976。
盐酸阿霉素pH7.4PBS-20％FBS溶液在0.025～5μg/mL范围内，荧光强度(y)与浓度(x)呈良好的线性关系。以荧光强度(y)对浓度(x)做线性回归方程。线性回归方程为y＝989.8x+67.676，R2＝0.9976。
5.3测定释放度
1)释放介质：PBS(pH7.4)、20％FBS、PBS(pH7.4)-20％FBS(1:1，v/v)。
2)分别取1mL无膜蛋白的微囊泡和有整合膜蛋白的微囊泡放入透析袋(MW3000)内，夹紧两端，置于50mL的释放介质中，启动转子搅拌透析外液，37℃，避光。在0、0.5、1、2、3、5、7、12、24、36、48h取1mL透析液，同时补入释放介质。透析完成后剪破透析袋，加入2mL的10％的Triton-X100，搅拌均匀，作为时间趋于无穷时的药物泄漏量。
3)样品测定：在相应的时间点，透析液用荧光分光光度法在Ex/Em＝480/590nm处，测定荧光强度。
4)累积释放率(％)＝[(Cn+Cn-1+...+C2+C1)×50]/m×100
Cn为取样时间点时样品的浓度，m为样品含药量。
4)通过试验结果表明，如图5所示，有整合膜蛋白的微囊泡载体在PBS(pH7.4)-20％FBS(1:1，v/v)释放介质中，随着时间的延长，12h后累积释放率增大，接近18％。微囊泡载体在PBS(pH7.4)、20％FBS释放介质中，随着时间的延长，累积释放率变化不大，接近9％。有整合膜蛋白的微囊泡载体在三种释放介质中，相应的和有整合膜蛋白的微囊泡载体累积释放率差别不大。结果表明，微囊泡载体在三种释放介质中，累积释放率相对较低，稳定性较好。
实施例3：评估BT-483细胞对整合膜蛋白微囊泡的摄取及抗巨噬细胞吞噬能力
基于上述制备获得的嵌有红细胞膜蛋白CD47和BT-482细胞系膜表面黏附蛋白的整合膜蛋白微囊泡，评估乳腺癌细胞系BT-483对其的摄取及抵抗吞噬细胞吞噬的能力。
1.细胞分组及培养：
靶向细胞是BT-483细胞((
对照细胞是HeLa细胞(
小鼠巨噬细胞RAW264.7(
上述三种细胞培养：于8孔板中每孔加入200ul培养基、接种2×104个细胞/孔。盖上盖玻片之后5％CO2，37℃培养24小时。将各个细胞分成两组：换液时分别加入有整合膜蛋白的微囊泡组和无膜蛋白的微囊泡。DOX剂量是10μM孵育2h。收集两组各细胞。
2.体外靶向BT-483细胞
用枪头吸取PBS冲洗细胞三遍、4％的多聚甲醛溶液固定20min，再用Hoechst33258染色10分钟，然后再吸取PBS冲洗三遍，最后用CLSM显微镜(尼康A1，日本)观察BT-483细胞和HeLa细胞分别摄取两组微囊泡的情况。结果发现在BT-483细胞与有整合膜蛋白的微囊泡的孵育结果中显示DOX荧光信号强度明显更强，表明BT-483细胞对有整合膜蛋白的微囊泡的吸收要显著强于无膜蛋白的微囊泡；而在Hela细胞中，其对两组微囊泡摄入无明显差别，这结果表明微囊泡上的膜蛋白促进癌细胞对整合有膜蛋白微囊泡的吸收。
3.评估微囊泡抵抗小鼠单核巨噬细胞的吞噬情况：
用枪头吸取PBS冲洗细胞三遍、4％的多聚甲醛溶液固定30min，然后使用CLSM显微镜(尼康A1，日本)观察有整合膜蛋白的微囊泡组和无膜蛋白的微囊泡在小鼠巨噬细胞中抗吞噬能力。
微囊泡抵抗吞噬作用则是通过巨噬细胞对两种微囊泡的吸收情况来评估的。如图6所示，从细胞荧光成像结果发现小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7对两种微囊泡的吸收，其对无膜蛋白的微囊泡的吸收要明显强于对有整合膜蛋白的微囊泡，说明有整合膜蛋白的微囊泡其表面膜蛋白能够有效的协助微囊泡抵抗巨噬细胞的吞噬。
4.体外抗肿瘤细胞增殖作用：
CKK-8评估未包载DOX和包载各浓度DOX的两组微囊泡分别和BT-483细胞孵育24小时的细胞活性情况。
4.1制作标准曲线测定细胞具体数量
1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
2)按1/2比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，设置5个细胞浓度梯度，每个浓度3个复孔。
3)接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。
4.2细胞活性检测
1)在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5％CO2)。
2)向培养板中分别加入10μL有整合膜蛋白的微囊泡和无膜蛋白的微囊泡。
3)将培养板在培养箱中分别孵育24小时。
4)向每孔中连续的加入10μL CCK-8溶液，避免在孔中生成气泡以致影响OD值的读数。
5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
4.3检测肿瘤细胞增殖情况
1)在96孔板中配制100μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。
2)向培养板分别加入10μL包载有不同浓度DOX有整合膜蛋白的微囊泡和无膜蛋白的微囊泡。
3)将培养板在培养箱中分别孵育24小时。
4)向每孔中连续的加入10μL CCK-8溶液，避免在孔中生成气泡以致影响OD值的读数。
5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果如图7所示，发现：在未加入DOX的情况下，两组微囊泡在检测浓度下的细胞毒性均可忽略不计，说明微囊泡具有良好的生物相容性。包载不同浓度的DOX后，发现随着DOX剂量的增加能有效抑制癌细胞的生长，当DOX浓度超过0.1mg/mL时，有整合膜蛋白的微囊泡处理的BT-483细胞的存活率低于无膜蛋白的微囊泡处理BT-483细胞的存活率。
实施例4：人工合成微囊泡的体内抗巨噬细胞吞噬作用
1.C57小鼠静脉注射人工合成微囊泡，分为2组(n＝5)：
无膜蛋白的微囊泡+DOX组：
有整合膜蛋白的微囊泡+DOX组：
分别静脉注射无膜蛋白的微囊泡、有整合膜蛋白的微囊泡，DOX剂量为6.5mg/kg。
2.分别于给药时间：0、0.5、1、2、4、8、12和24小时后通过眶静脉采血收集全血到肝素钠抗凝采血管中，以5000rpm、4℃离心10min，收集血浆样本。
3.在样品中加入乙腈沉淀所有蛋白质，提取药物的含量。离心后收集有机层并浓缩，用HPLC分析检测DOX的每克组织百分注射剂量率(Injected Dose per Gram ofTissue,％ID/g)。
4.结果如图8所示，发现：包载DOX(6.5mg/kg)的微囊泡注射到小鼠体内后，有整合膜蛋白的微囊泡组在血液中的滞留的时间要比无膜蛋白微囊泡组，而且随着时间的推移，这个滞留时间的差距不断拉开并趋于一个相对较为稳定的差值(9.2±0.85)，表明有整合膜蛋白的微囊泡载药体内抗吞噬能力是强于无膜蛋白的微囊泡载药的抗吞噬能力的。
实施例5：载药人工合成微囊泡体内治疗效果
1.取BT-483细胞(1×107细胞量)移植到裸鼠后肢后部，培养人肿瘤异种移植瘤，
2.将小鼠随机分为2个治疗组(n＝5)：
无膜蛋白的微囊泡+DOX组；
有整合膜蛋白的微囊泡+DOX组；
PBS组作为对照组。
当肿瘤平均体积约为80mm3时，采用静脉注射上述各组微囊泡，每3天注射一次，连续注射5次。
3.期间随着注射时间称量动物重量，通过公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝Π/6×最大直径×(最小直径)2。
4.实验结束时处死所有裸鼠，切除肿瘤并拍照。
5.基于平均肿瘤体积和对应的量取时间点绘制肿瘤生长曲线；同时绘制裸鼠体重变化曲线。
6.结果如图9所示，发现PBS组肿瘤抑制不明显，DOX治疗组肿瘤增长显著被抑制(P＜0.01)，而且是包载有DOX的有整合膜蛋白的微囊泡对应组的肿瘤增长被抑制得更为显著(P＜0.01)。说明有整合膜蛋白的微囊泡载药抑制肿瘤增殖效果要强于无膜蛋白的微囊泡载药抑制效果，微囊泡表明的粘附性膜蛋白对于靶向同源肿瘤细胞系具有增强微囊泡载药靶向作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
