野黄芩素在制备抗急性咽炎药物中的应用
技术领域
本研究涉及野黄芩素在制备抗急性咽炎药物中的应用，属于医药领域。
背景技术
急性咽炎是常见季节性多发上呼吸道疾病，空气污染、雾霾等环境因素，熬夜、吸烟、酗酒等不良生活习惯，均使其发病率呈逐年上升趋势。患者在发病期间咽部出现干燥、瘙痒、红肿、灼热、疼痛等症状，严重影响患者的正常生活和心理健康。急性咽炎病因机制主要是病毒、细菌或者理化因素刺激造成的咽喉部炎症反应。目前，西医治疗多以抗生素为主，但存在毒副作用大、二重感染、易产生耐药等缺点。2012年，西方国家急性咽炎治疗指南中将抗炎镇痛药作为伴有咽喉肿痛症状急性咽炎的一线药物，但是，甾体类和非甾体类抗炎镇痛药都存在副作用大等问题。
野黄芩素(结构式见，图1)是灯盏细辛(Erigeron breviscapus)、车前草(Lerodendrum phlomidis)和木蝴蝶(Oroxylum indicum)中的活性单体成分。上述中药具有广泛的抗炎镇痛活性，木蝴蝶更是治疗急喉痹的传统中药，尽管，现有技术中有报道野黄芩素的抗炎作用，野黄芩苷的镇痛作用。然而目前，现有技术中尚无野黄芩素可以用于治疗急性咽炎的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了野黄芩素在制备抗急性咽炎药物中的应用。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1是野黄芩素的结构式
图2是野黄芩素对急性咽炎大鼠炎症因子的影响
图3野黄芩素对急性咽炎大鼠咽部粘膜的影
图4野黄芩素对热板实验痛阈值的影响
具体实施方法
以下的实施例，实验例是用于说明本发明的。
实施例1
本发明所用的化合物野黄芩素为合成所得，合成路线与王晶合成路线相同，采用质谱鉴定合成的化合物为野黄芩素。
实验例1
野黄芩素抗大鼠急性咽炎的实验研究。
1.实验目的
探讨野黄芩素对，急性咽炎大鼠的治疗效果。
2.材料
2.1实验动物
健康SD大鼠，清洁级，雄性，体质量200±20g，共60只。健康云南小鼠，清洁级，雌性，体质量20±2g，共80只。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK(沪)2017-0005。所有动物均正常饲养，自由饮水、进食，饲养温度24～26℃，相对湿度40％～60％。动物保健机构和使用委员会批准这项研究，所有动物的护理与美国国立卫生研究院公布的《实验动物保健原则》No.85-23(1996年修订)一致。
2.2实验药品与试剂
野黄芩素纯度98％(合成)；咽炎片(浙江华润三九药业有限公司)；25％氨水纯度98％；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor Alpha，TNF-α)、白细胞介素-1β(inter-leukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-6(inter-leukin-6，IL-6)酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunesorbent assay，ELISA)检测试剂盒(武汉Bio-Swamp公司)。
2.3实验仪器
全波长多功能酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；RB-200智能热板仪(成都泰盟科技有限公司)；超速控温离心机(美国Backman Coulter公司)；荧光倒置显微镜(德国Carl Zeiss公司)；咽喉喷雾装置(贵州三力制药股份有限公司)；2mL EDTA-K2真空抗凝管、3mL真空促凝管、头皮针(上海康德莱公司)。
3.实验方法
3.1对氨水致大鼠急性咽炎模型的影响
取SD大鼠60只，体质量200±20g，雌雄各半，适应喂养1周。随机分为5组，每组12只，分别为空白组(不造模，给药生理盐水)，急性咽炎模型组(造模，给同等剂量生理盐水)，野黄芩低剂量组(造模，给药2.5mg/kg野黄芩素)，野黄芩高剂量组(造模，给药10mg/kg野黄芩素)，咽炎片组(造模，给药160mg/kg咽炎片)。除空白组外，其余各组用咽喉喷雾装置将25％氨水喷于动物咽部，每次3下，每天1次，连续3天造成急性咽炎模型[7]。第4天，各组动物分别称重后按照以下给药方式、剂量给药，1次/天，连续3天。空白组：同等剂量生理盐水(ip)，野黄芩素低剂量组：2.5mg/kg(ip)，野黄芩高剂量组：10mg/kg(ip)，咽炎片组：160mg/kg(ig)。最后一次给药2h后，10％水合氯醛麻醉，取仰卧位，打开腹腔，充分暴露其腹主动脉，用一次性采血管在腹主动脉分叉处与血管平行插入，一部分置入2mL EDTA-K2真空抗凝管，取样2mL。另一部分置入3mL普通促凝管，取样3mL，3000r/min离心10min，小心吸取上清液于1mL ep管中，将分离所得的上清液置于-80℃保存。
积分标准：各组大鼠按评分标准评分(评分标准：按组织颜色、光泽、分泌物数、充血、咽部肿胀分为四级。病理判断标准如下：“-”咽喉组织呈浅红色，表面湿润发亮，无分泌物，无充血、肿胀等病理现象。“+”咽喉组织光泽不好，少量的分泌物，少量的急性充血。“++”组织颜色暗红色，色泽较差，出现分泌物，并伴有急性、轻度肿胀等现象。“+++”咽部组织呈暗红色和暗色，黏液分泌大大增加，急性充血、肿胀明显)。
血常规比较：使用全自动动物血液分析仪(BC-2800Vet，中国迈瑞)分析血液中的18个血常规指标，比较各组大鼠血液的白细胞数目和中性粒细胞数目。
炎性因子比较：肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor Alpha，TNF-α)、白细胞介素-1β(inter-leukin-1β，IL-1β)和白细胞介素-6(inter-leukin-6，IL-6)检测方法为双抗夹心法，试剂盒均购自武汉Bio-Swamp公司，检测吸光度所用的仪器为全波长多功能酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)。
咽部病理学比较：安乐处死大鼠后，快速剥离咽喉组织，然后中性缓冲福尔马林(V福尔马林/V水＝10％，pH＝7.4)固定24h，流水冲洗，梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，然后采用蔡司倒置显微镜观察大鼠咽部粘膜及组织病变情况。
3.2对小鼠热板引起的中枢疼痛的影响
将体质量20±2g雌性小鼠放在预热至52±0.5℃恒温金属板上，记录每只小鼠的反应时间(舔爪或跳跃)，即用热板反应的潜伏期表示其痛阈值。筛选痛阈值在5～30s之间的小鼠，剔除大于30s或者小于5s，筛选出40只小鼠。小鼠随机分成4组，每组10只，分别为空白组、野黄芩素高剂量组、野黄芩素低剂量组以及吲哚美辛组。各组动物分别称重后按照以下给药方式、剂量给药。野黄芩素低剂量组：2.5mg/kg(ip)；野黄芩高剂量组：10mg/kg(ip)；吲哚美辛组：10mg/kg(ig给药)；空白组给予相同体积的生理盐水(ip)。
给药前先重复测定小鼠的正常痛阈值，痛阈值为小鼠置于恒温金属板发生舔足现象所用时间，取2次正常痛阈值的平均值为该小鼠的给药前痛阈值，然后分别ip给药，于给药后30、60、90、120、150和180min再测小鼠的痛阈值，若小鼠60s内仍没有出现舔后足的现象，则立即将小鼠取出，痛阈值按60s计。
3.3对醋酸导致外周炎症疼痛的影响
40只体质量为20±2g的雄性昆明小鼠，随机将小鼠分为4组，每组10只，分别为空白组、野黄芩素高剂量组组、野黄芩素低剂量组以及阳性药吲哚美辛组。各组动物分别称重后按照以下给药方式、剂量给药。野黄芩素低剂量组：2.5mg/kg(ip)；野黄芩高剂量组：10mg/kg(ip)；吲哚美辛组：10mg/kg(ig给药)；空白组：相同体积的生理盐水(ip)。给药60min后，采用ip，于每只小鼠注射0.4ml的0.6％醋酸溶液。
注射醋酸5min后开始观察并记录小鼠5min内出现的扭体次数，并按下列公式计算受试药物对小鼠扭体的抑制率。
抑制率(％)＝(空白组扭体均数-给药组扭体均数)÷空白组扭体均数×100％
3.4统计学处理
所有数据均使用SPSS18.0软件进行分析，结果用均数±标准差
4.实验结果
4.1对氨水致急性咽炎大鼠模型的影响
4.1.1对大鼠急性咽炎模型体征状况积分的影响
从表1可以看出，空白组大鼠咽部炎症反应均为“-”水平，无炎症特征。与空白组相比，模型组大鼠咽部炎症反应以“++”为主，咽粘膜及组织病理改变明显，产生了明显的炎症特征。与模型组相比，各给药组大鼠咽部组织炎症症状均有不同程度改善。
表1野黄芩素对大鼠急性咽炎模型体征状况积分的影响(
积分标准“-”，“+”，“++”，“+++”参考3.1
4.1.2对各组大鼠白细胞和中性粒细胞数目的影响
白细胞和中性粒细胞是炎症反应的效应器官，其血液中数目的多少可以反应炎症状况[10]。从表2可以看出：与空白对照组比较，模型组大鼠血液白细胞计数、中性粒细胞计数均极显著升高(P＜0.01)。与模型组大鼠相比，给予2.5mg/kg野黄芩素三天后，大鼠白细胞计数显著降低(P＜0.05)、中性粒细胞极显著降低(P＜0.01)。给予10mg/kg野黄芩素或160mg/kg咽炎片，大鼠的白细胞、中性粒细胞计数均极显著降低(P＜0.01)。
表2对各组大鼠白细胞和中性粒细胞数目的影响(
##与空白组比P＜0.01，*与模型组比P＜0.05，**与模型组比P＜0.01
4.1.3各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α浓度比较
大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α浓度是急性咽炎的重要指标[11]。实验结果发现：与空白组相比，模型组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量极显著高于空白组(P＜0.01)。与模型组相比，2.5、10mg/kg野黄芩素和160mg/kg咽炎片可以明显减少血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平(P＜0.01)。并且，野黄芩素具有计量依赖性的减少血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，野黄芩素剂量越高，其抗炎效果越好(图2)。
4.1.4各组大鼠咽部组织状态比较
实验各组大鼠的咽组织的HE显微图像显示：空白组大鼠咽部粘膜鳞状上皮细胞、粘膜下的结缔组织、血管、肌肉和腺体均正常，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠粘膜破损，粘膜下可见结缔组织、腺体明显增生和充血现象，并伴有大量炎性细胞浸润；2.5mg/kg野黄芩素组部分大鼠仍可见粘膜破损，结缔组织、腺体明显增生和充血现象；160mg/kg咽炎片组和10mg/kg野黄芩素组大鼠粘膜状况均有改善，结缔组织增生减轻，无明显充血，炎性细胞浸润显著减少(图3)。
4.2各组小鼠痛阈值比较
小鼠的热板实验可以用来评价野黄芩素对中枢疼痛模型的镇痛作用。野黄芩素现出显著的剂量和时间依赖性的镇痛作用，而且在60min时出现了镇痛的峰值。因此，我们选择60min时的镇痛效果为代表，此时，与空白对照组相比，2.5mg/kg野黄芩素提高了小鼠的热板痛阈值，但是没有显著差异(P＞0.05)；10mg/kg野黄芩素、吲哚美辛提高了小鼠的热板痛阈值，并且有显著性差异(P＜0.01)(图4)。
4.3各组小鼠扭体次数比较
小鼠醋酸扭体实验可以用来评价野黄芩素对外周炎症性疼痛模型的镇痛作用。实验结果发现，随着野黄芩素剂量的增加，其对小鼠扭体的镇痛作用增强。与空白对照组相比，2.5mg/kg的野黄芩素可以减少5min内小鼠扭体次数，并且具有显著差异(P＜0.05)，10mg/kg的野黄芩素、吲哚美辛可以减少5min内小鼠扭体次数，并且有极显著性差异(P＜0.01，Table 3)。
表3对各组大鼠醋酸致扭体数目的影响(
**与空白组相比P＜0.05，##与空白组相比P＜0.01
以上表明：野黄芩素具有抗炎镇痛的功效，对急性咽炎疗效稳定可靠，具有很好的使用价值，其合成方法简单，易于推广应用，是制备抗急性咽炎药物上的创新。
