staurosporine在制备治疗胃癌以及胃癌转移的药物中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及staurosporine在制备治疗胃癌以及胃癌转移的药物中的用途。
背景技术
目前临床上胃癌的诊治通过是内镜检测、手术治疗(内镜下局部切除或进行胃部切除)并辅以化疗、放疗或分子靶向治疗。随着上述基础研究的深入、手术技术的提高以及由发明人团队所制定的综合治疗方案的持续优化，近年来，胃癌的诊断和治疗水平有了明显的提高。然而，在2018年，胃癌仍然是第五大最常被诊断的癌症和第三大癌症死亡原因，全球新增病例超过100万，死亡人数达78.3万人(Bray et al.,2018)。在中国，由于超过80％的患者发现胃癌时已处于进展期(Torre et al.,2015；Zong et al.,2016)，因此患者的5年生存率仍然非常低。
一线化疗药物如5氟尿嘧啶、奥沙利铂等，存在耐药性。存在化疗耐药性的胃癌患者进行化疗治疗获益不高，而且存在化疗药物毒副作用，影响正常细胞及组织的功能。目前临床上胃癌的靶向药物曲妥珠单抗主要针对细胞表位 HER2阳性的肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用。由于胃癌异质性高，关于HER2的研究报道，在胃癌细胞中的阳性率不尽相同，约为12-20％。HER2阳性率不高使得曲妥珠单抗的效用局限。
癌细胞转移是胃癌患者死亡的主要原因，其中腹膜转移是胃癌患者最常见的转移模式，其预后较差，5年生存率约为5％。目前为止，被广泛研究有“种子与土壤”假说、肿瘤细胞内在决定因素以及肿瘤细胞间质相互作用(如外泌体传递 EGFR形成转移前生态)，但胃癌转移的具体分子机制尚不明确。为了寻找出驱动胃癌转移至腹膜的关键蛋白，发明人团队在2012年通过二维荧光差异凝胶电泳(2d-dige)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)，发现蛋白MYH9在腹膜转移灶中的表达水平明显高于原发肿瘤灶和正常黏膜。
MYH9，又名肌球蛋白IIa或肌球蛋白重链9(NMMHC-IIA)，是II类传统肌球蛋白的226-kDa亚基，是由两条重链和两对轻链组成的六聚体酶。MYH9可以与胞质的肌动蛋白进行相互作用，参与不同的细胞过程，如细胞活力、细胞迁移和细胞粘附。MYH9缺乏将会导致MYH9-related disease(MYH9-RD)，一种常染色体显性遗传与巨型血小板减少症；在小鼠胚胎敲除MYH9基因将会导致胚胎致死性、细胞粘附功能缺陷以及内胚层缺陷。这表明MYH9除了具有常见的骨架蛋白的功能，还有尚未阐明的关键功能。有文献报道，MYH9是rhoc-rock通路的效应分子，可增强胃癌细胞活力，而且此通路在胃癌中被频繁激活。发明人团队前期研究发现MYH9在胃癌细胞中表达上调，并且能够促进胃癌细胞的侵袭转移。然而，也有报道称敲低MYH9能够增强了黏液性胃癌(MGC)的细胞迁移，诱导胞浆内粘蛋白和细胞伸长(Rokutan etal,2016)。
基于上述理论，本发明可通过MYH9研究治疗胃癌以及胃癌转移的新渠道。
发明内容
本发明的目的在于针对胃癌临床治疗疗效尚不理想而提供了一种治疗胃癌的药物组合物，本发明还提供了staurosporine在制备治疗胃癌的药物中的用途。
为实现上述目的，所采取的技术方案为：提供了staurosporine在制备治疗胃癌以及胃癌转移的药物中的用途。
本发明还提供了staurosporine在制备抑制MYH9 1943位点磷酸化试剂中的用途。
本发明还提供了staurosporine在制备抑制β-catenin蛋白表达水平试剂中的用途。
本发明还提供了MYH9作为靶点在制备治疗胃癌以及胃癌转移的药物中的用途。
本发明还提供了MYH9在制备抑制CTNNB1的启动子转录试剂中的用途。进一步地，所述CTNNB1的启动子区域为+3bp～+45bp。
本发明还提供了一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括staurosporine以及药学上可用的载体。
发明人发现，核内MYH9可特异性识别CTNNB1的启动子DNA结合域 (DBD)，并促进β-catenin转录，导致胃癌细胞wnt信号通路激活增强，并增强腹膜转移灶中肿瘤细胞的凋亡抵抗能力。此外，发明人发现staurosporine(STS) 能够抑制MYH9 S1943位点的磷酸化，下调MYH9介导的CTNNB1转录，从而能够抑制胃癌细胞的腹膜转移。
Staurosporine(STS)是从链霉菌分离出来的生物碱，是一种小分子蛋白抑制剂，常作为PKC的强效抑制剂之一，常被用作研究PKC功能的探针，该试剂可从美国APExBIO公司购买获得，产品编号：A8192。
本发明的有益效果：本发明通过实验证实了Staurosporine能抑制胃癌以及胃癌转移相关的MYH9轴从而降低胃癌细胞的侵袭转移能力。
附图说明
图1为实施例1中验证MYH9促进CTNNB1基因的转录结果示意图。
图2为实施例1胃癌细胞进行了凋亡抵抗分析示意图。
图3为实施例2验证MYH9 1943位点磷酸化与CTNNB1表达水平的关系示意图。
图4实施例2验证STS抑制MYH9 1943位点磷酸化及β-catenin蛋白水平结果示意图。
图5为实施例3动物实验操作流程图。
图6为实施例3动物实验结果示意图。
图7为实施例3的HE染色结果示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1验证MYH9促进CTNNB1基因的转录
为了检测MYH9是否与CTNNB1启动子结合以增加CTNNB1基因的转录，我们首先构建了7个质粒构建体(C1-7)，其中包含不同长度的CTNNB1启动子，从-1618到+270nt。这些质粒分别与MYH9质粒，MYL9质粒或β-actin质粒共转染至MGC 80-3细胞中，然后进行双荧光素酶报告实验来确定CTNNB1启动子区域相互作用的蛋白质，并以Renilla荧光素酶报告质粒(pR-TK)(Promega，#E2241)作对照。24小时后，进行双荧光素酶报告基因测定，计算荧光素酶的相对活性。
分别用anti-MYL9，anti-β-actin，anti-RNAPII和anti-TFIIB抗体在胃癌细胞中进行染色质免疫沉淀实验。对免疫沉淀所得的DNA进行PCR扩增CTNNB1 5’侧区(+3bp～+270bp)，结果显示，MYH9与MYL9，β-actin，RNAPII，TFIIB，可能结合+3至+270nt CTNNB1启动子区域，与荧光素酶报告基因分析的结果一致。
由图1可以看出，不同长度的启动子C1～C7中，C1～C5荧光素酶的相对活性较高，C6～C7荧光素酶的相对活性较低。因此，CTNNB1启动子区的43bp (+3bp～+45bp)主要负责CTNNB1基因的转录。同时，与MYH9质粒共同转染的细胞，其荧光素酶的相对活性均高于与MYL9质粒或β-actin质粒共同转染的细胞。由此说明，MYH9能促进CTNNB1启动子的转录。
为确定核MYH9-相关性的β-catenin表达所导致的胃癌细胞的生物功能，我们构建了四种类型的GC胃癌细胞模型，分别向细胞转入NC与vector (NC+vector)质粒，MYH9shRNA3与vector(shRNA3+vector)质粒，MYH9 shRNA3与MYH9 plasmid(shRNA3+MYH9)质粒以及MYH9 shRNA3与CTNNB1 (shRNA3+CTNNB1)质粒。
进一步对上述胃癌细胞进行了凋亡抵抗分析。结果提示，MYH9敲低组 (MYH9shRNA3+vector)与对照组(NC+vector)相比，细胞凋亡显著增加，但MYH9 和β-catenin过表达组(MYH9 shRNA3+MYH9组与MYH9 shRNA3+CTNNB1组) 细胞凋亡显著下降(图2)。结果说明，过表达MYH9和β-catenin均能降低胃癌细胞的凋亡率，增强胃癌细胞的生长活性；而敲底MYH9能抑制CTNNB1基因的转录，抑制β-catenin蛋白的表达，进而阻断胃癌细胞wnt信号通路，达到抑制胃癌腹膜转移的功效。
实施例2验证staurosporine(STS)抑制MYH9 1943位点磷酸化及β-catenin 蛋白水平
据文献报道，有研究发现MYH9的c端残基存在5个磷酸化位点，而且STS 能抑制MYH9的S1916位点磷酸化(Vicente-Manzanares et al.，2009)。因此我们推测，STS下调CTNNB1 mRNA是通过抑制MYH9的S1916位点磷酸化来实现的。因此，我们构建了5个磷酸化位点(Thr1800、S1803、S1808、S1916和 S1943)MYH9突变质粒，并转染入MYH9敲低的胃癌细胞。结果显示，转入S1943 位点突变的质粒(G1943)的胃癌细胞中，CTNNB1 mRNA未见显著上调，这提示 MYH9 S1943位点磷酸化能够显著上调CTNNB1表达(图3A、B)，而其余位点磷酸化不影响CTNNB1表达。这表明MYH9 S1943位点磷酸化在调节 CTNNB1转录活动中发挥重要作用。另外，我们进一步用STS(150nmol/L)处理 MYH9-G1916与MYH9-G1943胃癌细胞并检测CTNNB1表达水平，结果提示， MYH9-G1943胃癌细胞经STS处理后CTNNB1 mRNA未见显著上调(图3C)，这表明STS通过影响1943位点磷酸化抑制CTNNB1的转录。同时，转入1943 位点突变的MYH9(G1943)相对于转野生质粒(S1943)未能上调CTNNB1蛋白水平，说明STS通过影响1943位点磷酸化抑制CTNNB1蛋白水平。
通过不同浓度(25、50、75、100、125nmol/L)的staurosporine(STS)验证其对MYH9、MYH9 1943位点磷酸化(p-MYH9)和β-catenin的抑制效果，结果如图4D所示，在MGC 80-3和AGS细胞中，随着STS的浓度的增加， p-MYH9和β-catenin的表达量逐渐降低，说明STS能抑制1943位点磷酸化的 MYH9和β-catenin的表达。
将1943位点突变的MYH9质粒(G1943)和野生MYH9质粒(S1943)分别与转入含有CTNNB1启动子质粒的MGC 80-3细胞中，检测MYH9，p-MYH9 和β-catenin的表达量。结果显示(图4E)，转入1943位点突变的MYH9(G1943) 相对于转野生质粒(S1943)未能上调β-catenin蛋白水平，说明STS通过影响1943位点磷酸化抑制β-catenin蛋白水平。
实施例3动物实验
为了检测staurosporine(STS)是否能在体内有效抑制胃癌细胞，构建正交异性异种移植胃癌模型，方法如下：
1)胃癌原位种植小鼠模型建立
裸鼠禁食过夜，对裸鼠沿腹部中线行剖腹手术，用血管钳轻柔地将裸鼠胃部拉出，将肿瘤组织小块用Maxon 7/0缝线缝合至裸鼠胃窦大弯侧，使两侧胃壁形成“口袋状”，包埋肿瘤组织小块。完成肿瘤原位种植后，用Dexon 5/0缝线逐层关腹，并消毒皮肤。
2)药物治疗
将上述构建好的20只肿瘤裸鼠随机分为两组，STS组和对照组(DMSO)。用药物STS对裸鼠(0.6mg/kg/day,i.p.连续5天)进行治疗。用药后，每两天检测裸鼠体重情况。在异源肿瘤原位种植六周后，处死裸鼠并采用多功能体内成像系统(MIIS；Molecular Devices,LLC.,Sunnyvale,CA,USA)观察裸鼠成瘤情况。原位肿瘤和转移性结节将进行HE和IHC染色进一步验证。用游标卡尺测量肿瘤直径，并根据已知公式计算肿瘤大小(0.5×长×宽2)。计算时间，起始点：原位种植术后2周；终点：原位种植术后6周，实验操作流程如图5所示。
肿瘤大小测量方法：
结果如图6所示，STS治疗组的肿瘤体积显著小于对照组(DMSO)，转移结节也明显少于对照组。HE染色进一步证实肠道和腹腔转移(图7)。综上所述，本实验证明staurosporine(STS)对小鼠胃癌的生长和腹腔转移具有明显的抑制作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，
