作为癌症免疫治疗的检查点阻断剂的工程化纳米囊泡
该发明是在美国国立卫生研究院授予的第1L1TR001111号政府拨款的支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。本申请要求于2018年2月15日提交的第62/630,956号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用其全部内容并入本文。
背景技术
外科手术是大多数实体瘤临床治疗的主要选择。然而，由于肿瘤的不完全切除，手术常有复发的风险。此外，也有研究表明手术有时能促使癌症转移。因此，开发有效的治疗癌症或预防癌症术后复发的策略备受瞩目。癌症免疫治疗旨在利用人体免疫系统来消灭癌细胞。让人感到欣慰的是,肿瘤抗原特异性T细胞有望清除残留的肿瘤细胞。CD8+ T细胞是肿瘤最重要的淋巴细胞反应之一，尤其是携带突变基因的淋巴细胞。事实上，这些新抗原(突变蛋白衍生抗原)特异性CD8+ T细胞可以浸润到肿瘤中，产生积极的免疫治疗结果。然而，程序性死亡配体1(PD-L1)在肿瘤中的表达抑制了T细胞的反应，导致T细胞耗尽(Tex)。PD-L1配体通过抑制性受体程序性死亡-1(PD-1)抑制Tex细胞。此外，Tex细胞能抑制IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和穿孔素等免疫细胞因子的产生，导致肿瘤无法根除。通过检查点抗体阻断PD-1/PD-L1轴，可以使Tex细胞在临床治疗中恢复活力，并对多种人类癌症，特别是黑色素瘤表现出积极的响应。在黑色素瘤患者中，检查点抗体疗法的成功率为约37％至38％，而在其他类型的癌症(诸如肾细胞癌、非小细胞肺癌和膀胱癌)中的应答率相似。然而，抗PD-1疗法并不是对所有类型的癌症都有效。事实上，超过半数的患者对PD-1抗体疗法表现出耐药性，只有少数患者因多重免疫阻断剂而受益。同时，现有的人源化抗体大多来自小鼠，需要复杂的设计和分离。因此，检查点抗体疗法的费用对许多患者来说仍然难以负担。因此，需要开发对抗PD-1/PD-L1抑制剂轴的替代方法。
发明内容
本发明公开了与编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡或工程化血小板相关的方法和组合物，所述组合物可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂。
在一个方面中，所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3。
本文还公开了任何前述方面的工程化纳米囊泡或工程化血小板，其中所述工程化纳米囊泡或工程化血小板衍生自树突状细胞、干细胞、免疫细胞、巨核细胞祖细胞或巨噬细胞。
在一个方面中，本文公开了包括任何前述方面的工程化纳米囊泡或工程化血小板的药物组合物。
本文还公开了任何前述方面的药物组合物，其进一步包括治疗剂，诸如例如，小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱(norharmane)、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于阿特珠单抗(Atexolizumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)和阿维鲁单抗(Avelumab))。
在一个方面中，本文公开了任何前述方面的药物组合物，其中所述治疗剂封装在所述工程化纳米囊泡或工程化血小板中。
本文还公开了治疗受试者的癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)的方法，其包括向癌症患者施用所述工程化纳米囊泡、工程血小板或任何前述方面的药物组合物。
在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中将所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给所述患者。
本文还公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中所述工程化纳米囊、工程化血小板或药物组合物每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。
在一个方面中，本文公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中施用的工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。
本文还公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其进一步包括施用化学治疗剂。
本文公开了任何前述方面的治疗受试者的癌症的方法，其中所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物在手术切除肿瘤之后施用。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了几个实施例，并且与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。
图1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H和1I显示用于癌症免疫治疗的PD-1阻断剂NV的示意图和特征。图1A显示制备负载1-MT的PD-1 NV的示意图。(i)构建稳定表达小鼠PD-1受体的HEK 293T细胞系。(ii)收获表达PD-1受体的细胞膜。(iii)通过挤压法制备PD-1 NV。图1B显示PD-L1通过与PD-1受体相互作用来排出CD8+ T细胞。由Treg细胞诱导IDO的表达，其抑制CD8+细胞的活性。图1C显示用PD-1 NV的PD-L1阻断剂使耗尽的CD8+细胞恢复以攻击肿瘤细胞。释放IDO抑制剂1-MT也使耗尽的CD8+细胞恢复。图1D显示在细胞膜上稳定表达小鼠PD-1的HEK 293T细胞系的建立。用WGA Alexa-Fluor 488染料标记细胞膜。比例尺：10μm。图1E显示示出PD-1 NV的形状和大小的TEM图像。比例尺：100nm。图1F显示示出所述PD-1 NV的自然形状(比例尺：100nm)的冷冻扫描电子显微镜(SEM)图像。图1G显示通过红点指示DsRed-PD-1 NV的存在的共焦图像。比例尺：1μm。图1H显示通过DLS测量的PD-1 NV的大小分布。图1I显示蛋白质印迹测定，其显示小鼠PD-1受体在所述NV上的表达和稳定细胞系的全细胞裂解(HCL)。将Na+K+ ATPase用作负载对照。
图2A、2B和2C显示PD-1 MV的特征。图2A显示通过红点指示DsRed-PD-1 MV的存在的共焦图像。比例尺：1000nm。图2B显示通过DLS测量的PD-1 MV的大小分布。图2C显示游离NV和PD-1 NV的电动电势(n＝3)。误差条，平均值±标准差。
图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H和3I显示PD-1 NV的体外生物学行为和体内生物分布。图3A显示结合在B16F10癌细胞膜上的DsRed-PD-1 NV。将Cy5.5(50μg/mL)标记的PD-1NV(50μg/mL)或PD-1游离NV与B16F10细胞孵育2h。使用WGA Alexa-Fluor 488染料检测B16F10细胞膜(比例尺：10μm)。图3B显示通过DC接收DsRed-PD-1 NV。将PD-1 NV(50μg/mL)与DC孵育2h，用WGA Alexa-Fluor 488染料检测DC膜。比例尺：10μm。图3C显示用EGFP-PD-L1质粒转染B16F10细胞20h，然后与PD-1 NV(50μg/mL)孵育5h，检测到PD-1 NV和PD-L1蛋白共定位(比例尺：10μm)。上面的图像是底面图像上的白环中放大的图像。图3D显示PD-1 NV与B16F10细胞(门控于DsRed+上)结合的代表性流式细胞术分析图像。将PD-1 NV(50μg/mL)与B16F10细胞孵育2h。或如所示将aPD-L1抗体(20μg/mL)与所述细胞孵育4h，然后将所述PD-1NV添加到培养基中。图3E显示用CO-IP和蛋白质印迹检测PD-1(在NV上)和PD-L1(在B16F10细胞上)之间的相互作用。图3F显示经小鼠尾静脉注射Cy5.5标记的游离NV(200μL，5mg/mL)和PD-1 NV(200μL，5mg/mL)。如所示在不同的时间点测量荧光(n＝3)。误差条，平均值±标准差。图3G显示肿瘤和主要器官中游离NV和PD-1 NV分布的IVIS光谱图像。左：肺、心脏和肝脏。右：脾、肾和肿瘤。图3H显示如所示肿瘤和主要器官中每克组织的荧光强度(n＝3)。误差条，平均值±标准差。图3I显示PD-1 NV在器官中的分布和使用共聚焦显微镜观察肿瘤切片。比例尺：100μm。
图4A和4B显示通过尾静脉注射的不同剂量PD-1 NV的体内抗肿瘤作用。图4A显示B16F10黑色素瘤肿瘤的体内生物发光成像。图4B显示不同治疗的小鼠的平均肿瘤体积(n＝7)。误差条，平均值±标准误。NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；用图基事后检验(Tukey post-hoc tests)的单因素方差分析(ANOVA)。
图5A、5B、5C、5D、5E、5F、5G、5H、5I和5J显示PD-1 NV的体内抗肿瘤作用。图5A显示尾静脉注射游离NV、PD-1 NV和PD-L1抗体后不同时间点不同小鼠组B16F10黑色素瘤肿瘤的体内生物发光成像。第0天：第一次治疗的那一天。图5B显示不同组治疗小鼠的平均肿瘤体积(n＝7)。误差条，平均值±标准误。图5C显示从不同组安乐死小鼠中提取的代表性肿瘤的图像(n＝7)。误差条，平均值±标准差。图5D显示接受PD-1 NV、PD-L1抗体和游离NV治疗的小鼠的生存曲线(n＝10)。图5E显示接受治疗的小鼠和对照小鼠的体重。误差条，平均值±标准差。图5F显示在小鼠接受第一次指示治疗后第20天分离的小鼠血清中的IFN-γ水平(n＝3)。误差条，平均值±标准差。图5G和5H显示通过流式细胞术分析的治疗肿瘤中T细胞(门控于CD3+细胞上)的代表性曲线图(5F)和定量分析(5G)(n＝3)。误差条，平均值±标准差。图5I和5J显示示出浸润的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的肿瘤切片免疫荧光染色的代表性图像(5I)和定量分析(5J)(n＝3)。误差条，平均值±标准差。比例尺：100μm。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；用图基事后检验(5B、5C、5F、5H、5J)的单因素方差分析(ANOVA)或用对数秩(Mantel-Cox)检验(5D)。
图6显示IDO酶活性被测量为游离1-MT、1-MT@NV和1-MT@PD-1 NV治疗后对犬尿氨酸产生的抑制。
图7显示如所示不同时间点每克肿瘤组织的荧光强度(n＝3)。误差条，平均值±标准差。
图8显示负载1-MT的PD-1 NV对肿瘤生长的体内抑制作用。图8A显示接受不同治疗的小鼠B16F10肿瘤的体内生物发光成像：PBS(第1组)、游离Nv(第2组)、1-MT(第3组)、PD-1Nv、(第4组)、1-MT@Nv(第5组)、1-MT+aPD-L1(第6组)、1-MT@PD-1 Nv(第7组)。第0天：第一次治疗的那一天。图8B显示如所示不同组治疗小鼠的平均肿瘤体积(n＝7)。误差条，平均值±标准误。图8C显示如所示接受不同治疗的小鼠的生存曲线(n＝10)。图8D和8E显示不同治疗组肿瘤中T细胞的代表性流式细胞术曲线图(8D)和定量分析(dE)。预先门控细胞用于阳性CD3+表达。误差条，平均值±标准差。图8F显示示出浸润的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的肿瘤的免疫荧光。比例尺：100μm。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行两次双因素方差分析来做所述分析(8B和8E)。在游离NV(G2)、PD-1 NV、(G4)、1-MT@NV(G5)和1-MT@PD1-NV(G7)的组之间进行用图基事后检验的首次双因素ANOVA。考虑的两个因素是1-MT和PD-1。在PBS对照(G1)、aPD-L1、1-MT(G3)和aPD-L1+1-MT(G6)的组之间进行用图基事后检验的第二次双因素ANOVA。此模型中的两个因素是1-MT和aPD-L1(8B和8E)或用对数秩(Mantel-Cox)检验(8C)。
图9A、9B和9C显示表达PD-1的血小板的产生和CD8+ T细胞恢复活力的示意图。图9A显示示出稳定表达小鼠PD-1的L8057细胞系和血小板的产生的示意图。图9B显示表达PD-1的血小板靶向手术伤口内的肿瘤细胞。图9C显示用表达PD-1的血小板的PD-L1阻断剂使耗尽的CD8+ T细胞恢复以攻击肿瘤细胞。
图10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I、10J和10K显示表达PD-1的L8057稳定细胞系血小板的产生和特征。图10A显示存在在细胞膜上稳定表达小鼠EGFP-PD-1的L8057细胞系的共焦图像。用WGA Alexa-Fluor 594染料对细胞膜染色(比例尺：10μm)。图10B显示蛋白质印迹分析用于评估PD-1在L8057细胞系中的表达。L8.是L8057细胞的简称。图10C显示用500nm PMA刺激表达EGFP-PD-1的L8057细胞3天，并进行免疫染色以检测Cd42a的表达。图10D显示用500nM PMA刺激L8057细胞3天，并用Wright-Giemsa染料染色(比例尺：10μm)。图10E显示从MK延伸的表达PD-1的前血小板的进化过程(比例尺：10μm)。图10F显示用500nMPMA刺激6天后，从L8057细胞中延伸的PD-1前血小板的形态。从L8057细胞延伸的PD-1前血小板(比例尺：10μm)。图10G显示纯化的表达PD-1的血小板的代表性共焦图像(比例尺：10μm)。图10H显示通过DLS测量的表达PD-1的血小板的大小分布。图10I显示示出表达PD-1的血小板的形态的CSEM图像(比例尺：1μm)。图10J显示示出表达PD-1的血小板的形态和大小的代表性TEM图像(比例尺：1μm)。图10K显示500nM PMA刺激后的表达PD-1的L8057细胞释放的血小板数量(n＝5)。
图11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H和11I显示PD-1血小板的体外和体内生物行为。图11A和11B显示血小板在胶原涂层或未涂层组织培养载玻片上的保留。比例尺，50μm。图11C显示凝血酶刺激的PD-1血小板的共焦、CSEM和TEM图像。血小板微粒(PMP)从血小板中释放。图11D显示用凝血酶治疗30分钟活化后PD-1血小板大小分布的测量结果。PMP产自血小板。图11E显示结合在B16F10细胞膜上的EGFP-PD-1血小板。用Cy5.5标记的PD-1血小板或游离血小板与B16F10细胞孵育20h。用WGA Alexa Fluor 594染料对B16F10细胞膜染色(比例尺：10μm)。图11F显示用DsRed-PD-L1质粒转染20h，然后与EGFP-PD-1血小板孵育5h的B16F10细胞，检测到EGFP-PD-1血小板与DsRed-PD-L1共定位(比例尺：10μm)。图11G显示经小鼠尾静脉注射Cy5.5标记的游离血小板和PD-1血小板。在如所示不同时间点测量荧光(n＝3)。误差条，平均值±标准差。图11H显示游离血小板和PD-1血小板在主要器官和残余肿瘤中分布的体内荧光图像。图11I显示如所示主要器官和肿瘤中每克组织的荧光强度(n＝3)。误差条，平均值±标准差。
图12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H和12I显示PD-1血小板抑制不完全手术肿瘤模型中的肿瘤进展。图12A显示用于不完全手术肿瘤模型疗法的PD-1血小板的示意图。图12B显示B16F10肿瘤的体内生物发光成像，所述B16F10肿瘤来自接受不同治疗的手术小鼠：分别是PBS、游离血小板和PD-1血小板。图12C显示如所示不同组小鼠的平均肿瘤体积。数据显示为平均值±标准偏差。图12D显示如所示接受不同治疗的小鼠的生存曲线。图12E显示示出CD4+ T细胞和CD8+ T细胞浸润的肿瘤切片的免疫荧光(比例尺：100μm)。图12F和12G显示通过流式细胞术(门控于CD3+ T细胞上)分析的不同治疗组肿瘤中T细胞的代表性曲线图(12F)和定量图(12G)。图12H和12I显示通过流式细胞术(门控于CD8+ T细胞上)分析的不同治疗组肿瘤的CD8+ T细胞中GzmB的代表性曲线图(12H)和定量图(12I)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的单因素ANOVA来做所述分析(12C、12G和12I)或用对数秩(Mantel-Cox)检验(12D)。
图13A、13B、13C、13D、13E、13F、13G、13H、13I、13J和13K显示不完全手术肿瘤模型中负载环磷酰胺的表达PD-1的血小板的体内抗肿瘤作用。图13A显示小鼠(n＝8)的平均肿瘤体积，所述小鼠经过以下治疗：PBS(G1)、环磷酰胺(CP)(G2)、表达PD-1的血小板(G3)、无CP血小板(G4)和负载CP的表达PD-1的血小板(G5)。数据显示为平均值±标准偏差。***与PBS对照比较。图13显示治疗小鼠的生存曲线。图13C显示通过流式细胞术(门控于CD4+ T细胞上)分析的肿瘤内CD4+ T细胞中FoxP3的定量图(n＝3)。图13D和13E显示通过流式细胞术(门控于CD8+ T细胞上)分析的肿瘤内CD8+ T细胞中Ki67的代表性曲线图(13D)和定量图(13E)(n＝3)。图13F和13G显示通过流式细胞术(门控于CD3+ T细胞上)分析的肿瘤内CD8+和CD4+ T细胞的代表性曲线图(13F)和定量图(13G)(n＝3)。图13H和13I显示通过流式细胞术(门控于CD8+ T细胞上)分析的肿瘤内CD8+ T细胞中GzmB的代表性曲线图(13H)和定量图(13I)(n＝3)。图13J和13K显示示出CD8+ T细胞浸润的肿瘤的免疫荧光(比例尺：100μm)。总的来说，NS：无显著性，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；进行图基事后检验分析的双因素ANOVA来做所述分析(13A、13C、13E、13G、13I、13K)或用对数秩(Mantel-Cox)检验(13B)。
图14A、14B和14C显示肿瘤部分切除后用表达PD-1的血小板治疗的小鼠的B16F10肿瘤生长。图14A显示B16F10肿瘤的体内肿瘤生物发光。图14B显示通过流式细胞术(门控于CD4+ T细胞上)分析的肿瘤内CD4+ T细胞中FoxP3表达的代表性曲线图(n＝3)。图14C显示治疗和对照小鼠的体重。误差条，±标准差。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有规定，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有规定，否则它们不限于特定的试剂，因为它们当然会有所不同。另外应当了解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。
A.定义
如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定不是这样。因此，例如，对“药物载体”的提及包括两个或更多这样的载体的混合物等。
范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，当公开了“小于或等于”值、“大于或等于值”时，也公开了如本领域技术人员适当理解的值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及介于10和15之间。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
对受试者的“给药”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行给药，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行给药”、“联合给药”、“同时给药(“simultaneousadministration”或“administered simultaneously”)”意指化合物在同一时间点给药或基本上紧接着给药。在后一种情况下，该两种化合物的给药时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点给予化合物时获得的结果不可区分。“全身给药”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部给药”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻给药点的一个或多个区域，并且在治疗上不系统地大量引入该药剂。例如，局部给药的药剂在给药点的局部附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。给药包括自我给药和他人给药。
“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对受试者无毒并且不对受试者造成显著的副作用。
“包含”意指组合物、方法等包括所提到的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应指包括所提到的元素，但不包括对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于给予本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每个所定义的实施例都在本发明的范围内。
“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。
“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。
药剂的“有效量”是指药剂提供所需的效果的足够数量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天给予若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。
“药学上可接受的”组分可指并非生物学上或以其他方式不可取的组分，即该组分可掺入本发明的药物制剂中并给予如本文所述的受试者，而不引起显著的不良生物效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于提及对人体的给药时，该术语通常意味着该组分已达到毒理学和制造试验的要求标准，或者它包括在美国食品药品监督管理局所制定的非活性成分指南中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的药物可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如本文中进一步描述。
“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体表示。聚合物的非限制性实例包括聚乙烯、橡胶、纤维素。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应，其中治疗效应例如治疗障碍或其他不希望的生理病症，预防效应例如预防疾病或其他不良生理症状(例如，非免疫原性癌症)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药学上可接受的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药学上可接受的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确所需的治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待给予的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年给予多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。
在本说明书及随后的权利要求书中，将引用多个术语，将其定义为具有以下含义：
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。
在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本申请，以便更全面地描述本申请所涉及的技术现状。所公开的参考文献也单独并且具体地以引用方式并入本文，参考文献中包含的材料在参考文献所依据的句子中予以讨论。
B.组合物
本发明公开了用于制备本发明所公开的组合物，以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当本发明公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能未明确公开这些化合物的各种不同的个体和集体组合和排列的具体参考，但是其中每个在本文中均得到特别考虑和描述。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F以及组合分子的实例，则公开了A-D，那么即使未单独引用其中每一项，也认为公开了个体和集体考虑的含义组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些组合的任何子集或组合。因此，例如，将认为公开了A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用本发明所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每个均可用本发明所公开的方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行。
可以理解和预期，诸如检查点抑制剂阻断剂之类的免疫治疗可以有效地治疗癌症或肿瘤手术切除之后的复发。然而，在这些阻断剂中使用的抗体会对许多患者造成限制，并对更多患者无效。本文公开了天然细胞膜衍生囊泡，诸如外泌体、微囊泡和细胞膜排斥囊泡，在生物医学上具有广阔的应用前景。相似地，生物工程策略作为增强抗肿瘤免疫的有希望的方法。在此，细胞膜衍生纳米囊泡(NV)被设计成显示PD-1受体，其通过破坏干扰PD-1/PD-L1免疫抑制轴来增强癌症免疫治疗(图1a)。同样，与抗PD-L1偶联的工程化药物可以靶向肿瘤手术创伤，使耗尽的T细胞恢复活力。因此，在一个方面中，本文公开了编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂。
如上所述，免疫抑制相互作用的阻断剂可以挽救或防止T细胞耗尽，并使免疫系统清除肿瘤，并单独或在手术切除之后预防肿瘤增殖和/或转移。本领域已知几种重要的免疫系统阻断剂，包括程序性死亡1(PD-1)/程序性死亡配体1(PDL-1)；具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)/CD155；T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域-3(TIM-3)/半乳凝素-9、磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)或高迁移率族蛋白1(HMGB1)；和/或淋巴细胞活化基因3(LAG3)/MHC-II类。因此，在一个方面中，本文公开了编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3和/或TIM3。
可以理解和预期，所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板可衍生自可支持其制造的任何细胞，包括但不限于树突状细胞、干细胞、免疫细胞、巨核细胞祖细胞、巨核细胞或巨噬细胞。因此，在一个方面中，本文公开了编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞祖细胞或工程化血小板衍生自树突状细胞、干细胞、免疫细胞、巨核细胞祖细胞或巨噬细胞。
1.药物载体/药品的递送
在一个方面中，应当理解，本文所述的工程纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板旨在施用给受试者以治疗、预防、抑制或减少癌症或转移，或治疗、预防、抑制或减少手术切除(即，切除)之后的复发或转移。因此，本文公开了包括本文所公开的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板的药物组合物。例如，本文公开了包括编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板的药物组合物，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3。
在一个方面中，可以理解和预期，其他免疫调节途径的其他抑制剂可与所公开的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞和工程化血小板相结合，对癌症的治疗具有额外益处。例如，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂与例如1-甲基色氨酸(1-MT)可增强对癌症的免疫应答。相似地，抗PDL-1抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿巴伏单抗(pidilizumab)、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)可结合任何工程化纳米囊、工程化巨核细胞或工程化血小板未能结合的PDL-1。因此，本文公开了包括编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板的药物组合物，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3，所述药物组合物进一步包括一种或多种治疗剂，诸如例如，小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。
所述一种或多种治疗剂可与所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞祖细胞或工程化血小板一起提供于药物组合物中。或者，所述一种或多种治疗剂可被封装在所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞祖细胞或工程化血小板中。因此，在一个方面中，本文公开了包括编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板的药物组合物，其可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3，所述药物组合物进一步包括一种或多种治疗剂，诸如例如，小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)；且其中所述一种或多种治疗剂被封装在所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板中。
由于所公开的包括所公开的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板的药物组合物可用于治疗癌症，因此还可以预期的是，所公开的药物组合物可进一步包括本领域已知的任何已知化学疗法，包括但不限于阿贝西尼(Abemaciclib)、乙酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、Abitrexate(甲氨蝶呤(Methotrexate))、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、本妥昔单抗(Adcetris(Brentuximab Vedotin))、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-TrastuzumabEmtansine)、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸氢阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、Afinitor(依维莫司(Everolimus))、Akynzeo(奈妥匹坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride))、艾特乐(Aldara)(咪喹莫德(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾乐替尼(Alecensa)(阿来替尼(Alectinib))、阿来替尼、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、力比泰(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(Copanlisib Hydrochloride)、用于注射的爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑(MelphalanHydrochloride))、爱克兰片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布吉替尼(Brigatinib))、Ambochlorin(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀(Amifostine)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞匹坦(Acrepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、门冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、卡莫司汀(Becenum)(卡莫司汀(Carmustine))、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(伊珠单抗奥加米星)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗(Tositummomab)和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、兰妥莫单抗、Blincyto(兰妥莫单抗)、硼替佐米、Bosulif(波舒替尼)、波舒替尼、本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、白消安(Busulfex)(白消安(Busulfan))、卡巴他赛、卡博替尼(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑珠单抗)、Camptosar(盐酸依立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX、氟尿嘧啶(Carac)(氟尿嘧啶-外用的)、卡铂、卡铂-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米、卡莫司汀(Carmubris)(卡莫司汀(Carmustine))、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞适(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉立滨、环磷酰胺(Clafen)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、Copanlisib Hydrochloride、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体(Cytarabine Liposome)、赛德萨-U(阿糖胞苷)、环磷酰胺(Cytoxan)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素2、地舒单抗、脂质体阿糖胞苷(DepoCyt)(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右丙亚胺、达妥昔单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、氟尿嘧啶(Efudex)(氟尿嘧啶-外用的)、Elitek(拉布立酶)、盐酸表柔比星(Ellence)(盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、依洛珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、恩扎卢胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾比特思(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶菊欧文氏菌)、氨磷汀(Ethyol)(氨磷汀(Amifostine))、凡毕复(磷酸依托泊甙)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、阿霉素脂质体(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-外用的)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、弗隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluoroplex)(氟尿嘧啶-外用的)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-外用的、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、佳达修(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、佳达修9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉姆单抗奥佐米星、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、阿法替尼(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel晶片(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸高锡林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(盐酸拓扑替康)、羟基脲(Hydrea)(羟基脲(Hydroxyurea))、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(Ibrance)(哌柏西利(Palbociclib))、替伊莫单抗、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、lclusig(盐酸帕纳替尼(PonatinibHydrochloride))、依达比星(Idamycin)(盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸伊达比星、艾德拉尼(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、伊布替尼(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(度伐利尤单抗)、咪喹莫德、Imlygic(TalimogeneLaherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、伊珠单抗奥加米星、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组体干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、Istodax(罗米地新)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米(Ixazomib Citrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凯望斯(帕利夫明)、可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺、甲磺酸仑伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸仑伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、留可然(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、克拉屈滨(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、果聚糖(Levulan)(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、醋酸亮丙瑞林贮库型(Lupron Depot)(醋酸亮丙瑞林)、醋酸亮丙瑞林贮库型悬液(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、盐酸丙卡巴肼(Matulane)(盐酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride))、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、美司钠(Mesnex)(美司钠(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴甲钠曲酮、氨甲喋呤钠(Mexate)(甲氨蝶呤)、氨甲喋呤钠-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、氮芥(盐酸氮芥)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、麦罗塔(吉姆单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米粒子(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈昔木单抗、奈拉滨、环磷酰胺(Neosar)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦和盐酸帕洛司琼、Neulasta(培非司亭)、优保津(非格司亭)、多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武利尤单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉(Sonidegib))、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、培门冬酶(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸依立替康脂质体)、Ontak(Denileukin Diftitox)、欧狄沃(Opdivo)(纳武利尤单抗)、OPPA、奥西替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、PAD、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、盐酸帕洛司琼和奈妥匹坦、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇天冬酰胺酶(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(培妥珠单抗)、培妥珠单抗、顺铂(Platinol)(顺铂(Cisplatin))、顺铂-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(奈昔木单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、阿地白介素(Proleukin)(阿地白介素(Aldesleukin))、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕(Eltrombopag Olamine))、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(Provenge)(Sipuleucel-T)、巯嘌呤(Purinethol)(巯嘌呤(Mercaptopurine))、Purixan(巯嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴甲钠曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、立博昔利布(Ribociclib)、R-ICE、利妥昔单抗(Rituxan)(利妥昔单抗(Rituximab))、RituxanHycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶(Hyaluronidase Human))、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地新、罗米司亭、柔红霉素(Rubidomycin)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、Rubraca(樟磺酸瑞卡帕布(Rucaparib Camsylate))、樟磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林贮库型(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(美琥他辛)、硫鸟嘌呤(Tabloid)(硫鸟嘌呤(Thioguanine))、TAC、Tafinlar(达拉非尼(Dabrafenib))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥西替尼(Osimertinib))、滑石、Talimogene Laherparepvec、醋酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(Tarceva)(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰索帝(Taxotere)(多西他赛)、特善奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦西莫司、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺(Thalomid)(沙利度胺(Thalidomide))、硫鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-外用的)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel(坦西莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右丙亚胺)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶(Tipiracil Hydrochloride)、三氧化二砷(Trisenox)(三氧化二砷(Arsenic Trioxide))、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替)、Unituxin(达妥昔单抗(Dinutuximab))、三醋酸尿苷、VAC、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉匹坦)、Vectibix(帕木单抗)、VelP、长春碱(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西尼)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、阿扎胞苷(Vidaza)(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸长春碱、硫酸长春新碱注射剂(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate))、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三醋酸鸟苷)、Voraxaze(谷卡匹酶)、伏林司他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、亚叶酸钙(Wellcovorin)(亚叶酸钙(Leucovorin Calcium))、Xalkori(克唑替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右丙亚胺)、阿柏西普(Ziv-Aflibercept)、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(唑来膦酸(Goserelin Acetate))、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏林司他)、择泰(Zometa)(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(色瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。
如上所述，这些组合物也可以药学上可接受的载体施用到体内。“药学上可接受”意指非生物学上或其他方面不良的材料，即，该材料可与核酸或载体一起施用给受试者，不会造成任何不良生物效应或以有害方式与含其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知，该载体将自然地被选择，以最小化该活性成分的任何降解，并最小化该受试者中的任何不利副作用。
可经口服、肠外(例如静脉)、肌肉注射、腹腔注射、经皮、体外、局部等方式给药，包括局部鼻内给药或通过吸入剂给药。如本文所用，“局部鼻内给药”意指通过一个或两个鼻孔将该组合物递送至鼻腔和鼻腔通道，且可包括通过喷雾机制或液滴机制递送，或通过核酸或载体的喷雾化递送。通过吸入剂的组合物的给药是通过鼻腔或口腔、通过喷雾或液滴机制递送。递送也可以通过插管直接到达呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切数量因受试者而异，具体取决于受试者的物种、年龄、体重和一般情况、所治疗过敏性障碍的严重程度、所使用的特定核酸或载体、其给药方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切数量。然而，适当的量可以由本领域的普通技术人员通过仅使用本文给出教导的常规实验来确定。
该组合物的肠外给药(如果使用)通常以注射为特征。注射剂可以制备成常规形式，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适于在注射前在液体中溶解悬浮液的固体形式，或者是乳剂。最近修订的肠外给药方法包括使用缓释或缓释系统，以保持恒定剂量。参见，例如，第3,610,795号美国专利，其通过引用并入本文。
材料可以是溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)。它们可能通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Senter等人，Bioconjugate Chem.，2:447-451，(1991)；Bagshawe、K.D.，Br.J.Cancer，60:275-281，(1989)；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，58:700-703，(1988)；Senter等人，Bioconjugate Chem.，4:3-9，(1993)；Battelli等人，CancerImmunol.Immunother.，35:421-425，(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews，129:57-80，(1992)；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol，42:2062-2065，(1991))。“隐形”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的针对结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的DNA靶向、淋巴细胞介导的肿瘤靶向和体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向等载体。以下参考文献是利用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(Hughes等人，Cancer Research，49:6214-6220，(1989)；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104:179-187，(1992))。一般来说，受体参与内吞作用的途径，无论是组成性的还是配体诱导的。这些受体聚集在网格蛋白所包被的小窝中，通过网格蛋白所包被的囊泡进入细胞，通过对受体进行分类的酸化的核内体，然后循环到细胞表面、在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，如营养吸收、活化蛋白去除、大分子清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节等。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价态和配体浓度，许多受体遵循不止一个细胞内途径。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and CellBiology 10:6，399-409(1991))。
a)药学上可接受的载体
所述组合物包括抗体，可在治疗上与药学上可接受的载体结合使用。
Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第19版)A.R.Gennaro,Mack Publishing Company,Easton,PA 1995描述了合适的载体及其制剂。通常，在该制剂中使用适当量的药学上可接受的盐以使该制剂等渗。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选为约7至约7.5。进一步的载体包括缓释制剂，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透膜基质，其基质为成型制品的形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，某些载体可能更可取，例如取决于给药途径和给药组合物的浓度。
本领域技术人员已知药物载体。这些通常是给人类施用药物的标准载体，包括无菌水、生理盐水和生理pH下的缓冲液等溶液。这些组合物可以肌肉注射或皮下注射。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。
药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等以及所选择的分子。药物组合物还可包括一种或多种活性成分，如抗菌剂、抗炎剂、麻醉剂等。
根据是否需要局部或全身治疗以及治疗区域的不同，药物组合物可以多种方式施用。给药可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或肠外，例如静脉滴注、皮下、腹腔或肌肉注射。所公开的抗体可经静脉、腹腔、肌肉、皮下、腔内或经皮施用。
用于肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水载体包括水、酒精/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如像抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
局部给药制剂可包括软膏、乳液、面霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。传统的药物载体、水、粉末或油性碱、增稠剂等可能是必要的或可取的。
口服给药组合物包括粉末或颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是可取的。
一些组合物可潜在地作为药学上可接受的酸或碱加成盐施用，并通过无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和延胡索酸)反应形成，或无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(如一、二、三烷基和芳基胺及取代乙醇胺)反应形成。
b)治疗用途
可以凭经验确定施用组合物的有效剂量和时间表，并且进行这种确定在本领域技术范围内。组合物的施用剂量范围应足够大，以产生所需的效果，从而影响障碍的症状。剂量不应太大以致引起不利副作用，例如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以通过本领域技术人员来确定。如果有任何禁忌症，也可以由个体医生来调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一剂量或多剂量施用，持续一天或几天。对于给定类别的药品，可以在文献中找到针对适当剂量的指南。例如，在抗体治疗用途的文献中可以找到选择适当剂量抗体的指南，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编，NogesPublications，Park Ridge,N.J.，(1985)第22章和第303-357页；Smith等人，Antibodiesin Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编，Raven Press，New York(1977)，第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型每日剂量可能在每天约1μg/kg至100mg/kg体重或以上的范围内。
2.治疗癌症的方法
如本文所述，所公开的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物可用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，诸如癌症。因此，在一个方面中，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)；癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌，非小细胞肺癌和/或膀胱癌)的增殖；癌症(包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤(包括，但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌和/或膀胱癌)手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向癌症患者施用本文所公开的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物。因此，在一个方面中，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症；癌症的增殖；癌症的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向受试者施用编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其(或包括其的药物组合物)可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3。可以理解，在所公开的方法中使用的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物可进一步包括一种或多种治疗剂，以增强所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物的免疫治疗效果。例如，在所公开的方法中使用的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物可进一步包括小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。所述一种或多种治疗剂可被封装在所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞和/或工程化血小板中，或与所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞和/或工程化血小板一起供应于药物组合物中。因此，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症；癌症的增殖；癌症的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向受试者施用编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其(或包括其的药物组合物)可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3；且其中所述工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞、工程化血小板和/或药物组合物进一步包括小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。
可以理解和预期，在所公开的癌症治疗、抑制、减少和/或预防方法中使用的化疗药物可包括本领域已知的任何化疗药物，包括但不限于阿贝西尼(Abemaciclib)、乙酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、Abitrexate(甲氨蝶呤(Methotrexate))、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、本妥昔单抗(Adcetris(Brentuximab Vedotin))、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-TrastuzumabEmtansine)、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸氢阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、Afinitor(依维莫司(Everolimus))、Akynzeo(奈妥匹坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride))、艾特乐(Aldara)(咪喹莫德(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾乐替尼(Alecensa)(阿来替尼(Alectinib))、阿来替尼、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、力比泰(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(Copanlisib Hydrochloride)、用于注射的爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑(MelphalanHydrochloride))、爱克兰片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布吉替尼(Brigatinib))、Ambochlorin(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀(Amifostine)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞匹坦(Acrepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、门冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、卡莫司汀(Becenum)(卡莫司汀(Carmustine))、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(伊珠单抗奥加米星)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗(Tositummomab)和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、兰妥莫单抗、Blincyto(兰妥莫单抗)、硼替佐米、Bosulif(波舒替尼)、波舒替尼、本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、白消安(Busulfex)(白消安(Busulfan))、卡巴他赛、卡博替尼(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑珠单抗)、Camptosar(盐酸依立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX、氟尿嘧啶(Carac)(氟尿嘧啶-外用的)、卡铂、卡铂-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米、卡莫司汀(Carmubris)(卡莫司汀(Carmustine))、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞适(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉立滨、环磷酰胺(Clafen)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、Copanlisib Hydrochloride、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体(Cytarabine Liposome)、赛德萨-U(阿糖胞苷)、环磷酰胺(Cytoxan)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素2、地舒单抗、脂质体阿糖胞苷(DepoCyt)(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右丙亚胺、达妥昔单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、氟尿嘧啶(Efudex)(氟尿嘧啶-外用的)、Elitek(拉布立酶)、盐酸表柔比星(Ellence)(盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、依洛珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、恩扎卢胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾比特思(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶菊欧文氏菌)、氨磷汀(Ethyol)(氨磷汀(Amifostine))、凡毕复(磷酸依托泊甙)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、阿霉素脂质体(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-外用的)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、弗隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluoroplex)(氟尿嘧啶-外用的)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-外用的、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、佳达修(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、佳达修9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉姆单抗奥佐米星、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、阿法替尼(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel晶片(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸高锡林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(盐酸拓扑替康)、羟基脲(Hydrea)(羟基脲(Hydroxyurea))、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(Ibrance)(哌柏西利(Palbociclib))、替伊莫单抗、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、lclusig(盐酸帕纳替尼(PonatinibHydrochloride))、依达比星(Idamycin)(盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸伊达比星、艾德拉尼(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、伊布替尼(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(度伐利尤单抗)、咪喹莫德、Imlygic(TalimogeneLaherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、伊珠单抗奥加米星、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组体干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、Istodax(罗米地新)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米(Ixazomib Citrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凯望斯(帕利夫明)、可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺、甲磺酸仑伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸仑伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、留可然(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、克拉屈滨(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、果聚糖(Levulan)(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、醋酸亮丙瑞林贮库型(Lupron Depot)(醋酸亮丙瑞林)、醋酸亮丙瑞林贮库型悬液(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、盐酸丙卡巴肼(Matulane)(盐酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride))、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、美司钠(Mesnex)(美司钠(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴甲钠曲酮、氨甲喋呤钠(Mexate)(甲氨蝶呤)、氨甲喋呤钠-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、氮芥(盐酸氮芥)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、麦罗塔(吉姆单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米粒子(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈昔木单抗、奈拉滨、环磷酰胺(Neosar)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦和盐酸帕洛司琼、Neulasta(培非司亭)、优保津(非格司亭)、多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武利尤单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉(Sonidegib))、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、培门冬酶(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸依立替康脂质体)、Ontak(Denileukin Diftitox)、欧狄沃(Opdivo)(纳武利尤单抗)、OPPA、奥西替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、PAD、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、盐酸帕洛司琼和奈妥匹坦、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇天冬酰胺酶(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(培妥珠单抗)、培妥珠单抗、顺铂(Platinol)(顺铂(Cisplatin))、顺铂-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(奈昔木单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、阿地白介素(Proleukin)(阿地白介素(Aldesleukin))、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕(Eltrombopag Olamine))、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(Provenge)(Sipuleucel-T)、巯嘌呤(Purinethol)(巯嘌呤(Mercaptopurine))、Purixan(巯嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴甲钠曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、立博昔利布(Ribociclib)、R-ICE、利妥昔单抗(Rituxan)(利妥昔单抗(Rituximab))、RituxanHycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶(Hyaluronidase Human))、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地新、罗米司亭、柔红霉素(Rubidomycin)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、Rubraca(樟磺酸瑞卡帕布(Rucaparib Camsylate))、樟磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林贮库型(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(美琥他辛)、硫鸟嘌呤(Tabloid)(硫鸟嘌呤(Thioguanine))、TAC、Tafinlar(达拉非尼(Dabrafenib))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥西替尼(Osimertinib))、滑石、Talimogene Laherparepvec、醋酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(Tarceva)(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰索帝(Taxotere)(多西他赛)、特善奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦西莫司、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺(Thalomid)(沙利度胺(Thalidomide))、硫鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-外用的)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel(坦西莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右丙亚胺)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶(Tipiracil Hydrochloride)、三氧化二砷(Trisenox)(三氧化二砷(Arsenic Trioxide))、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替)、Unituxin(达妥昔单抗(Dinutuximab))、三醋酸尿苷、VAC、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉匹坦)、Vectibix(帕木单抗)、VelP、长春碱(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西尼)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、阿扎胞苷(Vidaza)(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸长春碱、硫酸长春新碱注射剂(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate))、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三醋酸鸟苷)、Voraxaze(谷卡匹酶)、伏林司他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、亚叶酸钙(Wellcovorin)(亚叶酸钙(Leucovorin Calcium))、Xalkori(克唑替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右丙亚胺)、阿柏西普(Ziv-Aflibercept)、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(唑来膦酸(Goserelin Acetate))、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏林司他)、择泰(Zometa)(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(色瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。因此，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的癌症；癌症的增殖；癌症的转移；和/或治疗、减少、抑制或预防肿瘤手术切除之后癌症的复发、增殖或转移，其包括向受试者施用编码一个或多个外源性蛋白受体的工程化纳米囊泡、工程化巨核细胞或工程化血小板，其(或包括其的药物组合物)可在癌症免疫治疗中用作检查点阻断剂，其中所述一个或多个外源性蛋白受体可包括PD-1、TIGIT、LAG3或TIM3；其进一步包括单独或以相同组合物向所述受试者施用本领域已知的任何化疗药物，包括但不限于阿贝西尼(Abemaciclib)、乙酸阿比特龙(Abiraterone Acetate)、Abitrexate(甲氨蝶呤(Methotrexate))、Abraxane(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、本妥昔单抗(Adcetris(Brentuximab Vedotin))、ADE、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-Trastuzumab Emtansine)、阿霉素(盐酸多柔比星)、马来酸氢阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、Afinitor(依维莫司(Everolimus))、Akynzeo(奈妥匹坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼(Palonosetron Hydrochloride))、艾特乐(Aldara)(咪喹莫德(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾乐替尼(Alecensa)(阿来替尼(Alectinib))、阿来替尼、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、力比泰(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(Copanlisib Hydrochloride)、用于注射的爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑(Melphalan Hydrochloride))、爱克兰片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布吉替尼(Brigatinib))、Ambochlorin(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀(Amifostine)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞匹坦(Acrepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、门冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、卡莫司汀(Becenum)(卡莫司汀(Carmustine))、Beleodaq(贝林司他)、贝林司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(伊珠单抗奥加米星)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗(Tositummomab)和碘I131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、兰妥莫单抗、Blincyto(兰妥莫单抗)、硼替佐米、Bosulif(波舒替尼)、波舒替尼、本妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、白消安(Busulfex)(白消安(Busulfan))、卡巴他赛、卡博替尼(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑珠单抗)、Camptosar(盐酸依立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX、氟尿嘧啶(Carac)(氟尿嘧啶-外用的)、卡铂、卡铂-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米、卡莫司汀(Carmubris)(卡莫司汀(Carmustine))、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼(Ceritinib)、柔红霉素(Cerubidine)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞适(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、克拉立滨、环磷酰胺(Clafen)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、Copanlisib Hydrochloride、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposome)、赛德萨-U(阿糖胞苷)、环磷酰胺(Cytoxan)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素2、地舒单抗、脂质体阿糖胞苷(DepoCyt)(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右丙亚胺、达妥昔单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、氟尿嘧啶(Efudex)(氟尿嘧啶-外用的)、Elitek(拉布立酶)、盐酸表柔比星(Ellence)(盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride))、依洛珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕(EltrombopagOlamine)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平(EnasidenibMesylate)、恩扎卢胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾比特思(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin Mesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶菊欧文氏菌)、氨磷汀(Ethyol)(氨磷汀(Amifostine))、凡毕复(磷酸依托泊甙)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、阿霉素脂质体(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、易维特(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-外用的)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、弗隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluoroplex)(氟尿嘧啶-外用的)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-外用的、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、佳达修(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、佳达修9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉姆单抗奥佐米星、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(马来酸阿法替尼)、阿法替尼(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel晶片(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸高锡林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(盐酸拓扑替康)、羟基脲(Hydrea)(羟基脲(Hydroxyurea))、羟基脲、Hyper-CVAD、爱博新(Ibrance)(哌柏西利(Palbociclib))、替伊莫单抗、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、lclusig(盐酸帕纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、依达比星(Idamycin)(盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸伊达比星、艾德拉尼(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、匹服平(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、伊布替尼(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(度伐利尤单抗)、咪喹莫德、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、伊珠单抗奥加米星、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组体干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、Istodax(罗米地新)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米(IxazomibCitrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凯望斯(帕利夫明)、可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah(Tisagenlecleucel)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺、甲磺酸仑伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸仑伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、留可然(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、克拉屈滨(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、果聚糖(Levulan)(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、醋酸亮丙瑞林(Lupron)(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、醋酸亮丙瑞林贮库型(Lupron Depot)(醋酸亮丙瑞林)、醋酸亮丙瑞林贮库型悬液(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、盐酸丙卡巴肼(Matulane)(盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride))、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、美司钠(Mesnex)(美司钠(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴甲钠曲酮、氨甲喋呤钠(Mexate)(甲氨蝶呤)、氨甲喋呤钠-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、氮芥(盐酸氮芥)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、麦罗塔(吉姆单抗奥佐米星)、紫杉醇纳米粒子(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈昔木单抗、奈拉滨、环磷酰胺(Neosar)(环磷酰胺(Cyclophosphamide))、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦和盐酸帕洛司琼、Neulasta(培非司亭)、优保津(非格司亭)、多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武利尤单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗、Odomzo(索尼德吉(Sonidegib))、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、培门冬酶(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸依立替康脂质体)、Ontak(Denileukin Diftitox)、欧狄沃(Opdivo)(纳武利尤单抗)、OPPA、奥西替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、PAD、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、盐酸帕洛司琼和奈妥匹坦、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、聚乙二醇天冬酰胺酶(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(培妥珠单抗)、培妥珠单抗、顺铂(Platinol)(顺铂(Cisplatin))、顺铂-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(奈昔木单抗)、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、阿地白介素(Proleukin)(阿地白介素(Aldesleukin))、Prolia(地舒单抗)、Promacta(艾曲泊帕(EltrombopagOlamine))、盐酸普萘洛尔、普罗文奇(Provenge)(Sipuleucel-T)、巯嘌呤(Purinethol)(巯嘌呤(Mercaptopurine))、Purixan(巯嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴甲钠曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、甲氨蝶呤(Rheumatrex)(甲氨蝶呤(Methotrexate))、立博昔利布(Ribociclib)、R-ICE、利妥昔单抗(Rituxan)(利妥昔单抗(Rituximab))、Rituxan Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶(Hyaluronidase Human))、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地新、罗米司亭、柔红霉素(Rubidomycin)(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、Rubraca(樟磺酸瑞卡帕布(RucaparibCamsylate))、樟磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、SclerosolIntrapleural Aerosol(滑石)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林贮库型(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(美琥他辛)、硫鸟嘌呤(Tabloid)(硫鸟嘌呤(Thioguanine))、TAC、Tafinlar(达拉非尼(Dabrafenib))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥西替尼(Osimertinib))、滑石、Talimogene Laherparepvec、醋酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(Tarceva)(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰索帝(Taxotere)(多西他赛)、特善奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦西莫司、沙利度胺(Thalidomide)、沙利度胺(Thalomid)(沙利度胺(Thalidomide))、硫鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、Tisagenlecleucel、Tolak(氟尿嘧啶-外用的)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel(坦西莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右丙亚胺)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶(Tipiracil Hydrochloride)、三氧化二砷(Trisenox)(三氧化二砷(Arsenic Trioxide))、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替)、Unituxin(达妥昔单抗(Dinutuximab))、三醋酸尿苷、VAC、凡德他尼、VAMP、Varubi(盐酸罗拉匹坦)、Vectibix(帕木单抗)、VelP、长春碱(硫酸长春碱)、万珂(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西尼)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、阿扎胞苷(Vidaza)(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸长春碱、硫酸长春新碱注射剂(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate))、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三醋酸鸟苷)、Voraxaze(谷卡匹酶)、伏林司他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、亚叶酸钙(Wellcovorin)(亚叶酸钙(Leucovorin Calcium))、Xalkori(克唑替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地舒单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右丙亚胺)、阿柏西普(Ziv-Aflibercept)、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(唑来膦酸(Goserelin Acetate))、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏林司他)、择泰(Zometa)(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(色瑞替尼)和/或Zytiga(醋酸阿比特龙)。所述方法还可包括施用本文所公开的任何治疗剂，包括但不限于小分子(包括但不限于1-甲基-色氨酸(1-MT)、去甲基哈尔明碱、迷迭香酸、epacadostat、navooximod、阿霉素、三苯氧胺、紫杉醇、长春碱、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶)、siRNA、肽、模拟肽或抗体(诸如例如，和抗PDL-1抗体，包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、阿巴伏单抗、BMS-936559、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。
如上所述，所公开的方法或在治疗癌症中有用。所公开的组合物可用于治疗的代表性但不限于以下的癌症列表：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金病、髓系白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肾脏癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤，卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、咽鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌，以及上皮癌、肾癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血癌、睾丸癌、结直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。
在一个方面中，所公开包括向受试者施用本文所公开的任何工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的治疗癌症的方法可包括以适合治疗受试者特定癌症的任何频率施用所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物。例如，所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物至少每12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、44小时、46小时、48小时一次，每3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天一次，每2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月一次施用给所述患者。在一个方面中，所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物每周施用至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。
在一个方面中，施用给所述受试者以供所公开的方法中使用的工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的量可包括医师所确定的适于治疗所述受试者的特定癌症的任何量。例如，所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的量可在约10mg/kg至约100mg/kg。例如，施用的所述工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的量可为至少10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、21mg/kg、22mg/kg、23mg/kg、24mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg。因此，在一个方面中，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，其中施用的工程化纳米囊泡、工程化血小板或药物组合物的剂量为约10mg/kg至约100mg/kg。
C.实例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在纯粹地示范并且非旨在限制公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度为℃或处于环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。
1.实例1：用于癌症免疫治疗的PD-1阻断剂细胞囊泡
天然细胞膜衍生囊泡，诸如外泌体、微囊泡和细胞膜排斥囊泡等，在生物医学上具有广阔的应用前景。相似地，生物工程策略作为增强抗肿瘤免疫的有希望的方法。在此，细胞膜衍生纳米囊泡(NV)被设计成显示PD-1受体，其通过破坏PD-1/PD-L1免疫抑制轴来增强癌症免疫治疗(图1A)。所述PD-1 NV可与肿瘤细胞表面结合并实现PD-L1阻断剂(图1A、1B和1C)。此阻断剂有望有效地使耗尽的肿瘤抗原特异性CD8+恢复以攻击肿瘤细胞。此外，所述NV还可作为其他治疗药物的载体来进行联合递送。吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是一种被肿瘤过度表达以限制效应T细胞增殖和功能的免疫抑制分子。这里，1-甲基-色氨酸(1-MT)是IDO的小分子抑制剂，被封装到PD-1 NV中，以同时阻断PD-1/PD-L1轴，并克服肿瘤相关IDO对肿瘤微环境(TME)内效应T细胞的抑制作用(图1C)。
为制备PD-1 Nv，建立了在细胞膜上稳定表达小鼠PD-1受体的HEK 293T细胞。HEK293T细胞系因其转染能力强、能产生大量重组蛋白而被广泛应用于细胞生物学研究和生物技术产业。DsRed蛋白标签被包含在PD-1受体蛋白的C端部分，这使得所述蛋白标签靠近细胞膜的内部小叶，而受体的功能域在细胞外(图1a)。因此，将小鼠PD-1受体cDNA克隆到哺乳动物表达载体中。用潮霉素B选择转染的HEK 293T细胞，建立稳定的细胞系。值得注意的是，死亡受体PD-1主要在细胞膜上表达和定位(图1d)。在潮霉素B的选择压力下，细胞系继续表达DsRed PD-1受体20代以上。用Alexa-Fluor 488缀合物麦胚凝集素(WGA)标记细胞膜，以确定PD-1受体的定位。正如预期的那样，DsRed蛋白的红色荧光与WGA Alexa-Fluor 488染料的绿色荧光共同定位在细胞膜上(图1d)。
接下来，培养和裂解HEK 293T细胞，分离细胞膜。通过0.8μm和0.22μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器连续挤出制备表达PD-1受体的细胞膜囊泡。通过0.8μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出，得到主要的细胞膜囊泡(MV)。共焦图像中的红光点表明MV上存在DsRed-PD-1(图2a)。通过动态光散射(DLS)分析测量MV的大小分布(图2b)。然后通过0.22μm孔径的聚碳酸酯膜过滤器挤出MV。用两步OptiPrep密度梯度超速离心法进一步纯化收获的NV。接下来，用电子显微镜对NV的形态进行表征。用透射电子显微镜(TEM)负染色NV显示它们是封闭的囊泡(图1e)。通过冷冻扫描电子显微镜(SEM)也对NV进行了扫描，显示NV呈球形(图1f)。NV的电动电势被确定为-10mV(图2c)。此外，用共焦成像和蛋白质印迹检测PD-1受体在NV上的表达。共焦图像显示红色点，表明存在DsRed-PD-1 Nv(图1g)。DLS分析显示NV的平均直径为约90-100nm(图1h)。此外，蛋白质印迹分析表明纯化的NV显示PD-1受体(图1i)。为了验证PD-1受体在NV表面是否保持了外侧向外的取向，我们进行了免疫沉淀测定(IP)。测定显示PD-1抗体可下拉大部分PD-1 NV，表明PD-1受体在大多数PD-1 NV上具有正确的外侧向外的取向。
癌细胞通过过度表达与PD-1受体相互作用的PD-L1配体，排出抗原特异性CD8+ T细胞。为研究PD-1 NV是否与黑色素瘤细胞结合，将PD-1NV与B16F10黑色素瘤细胞体外孵育。DsRed蛋白与PD-1受体融合后产生红色荧光，其作为PD-1 NV的荧光信号标记。用WGAAlexa-Fluor 488染料对B16F10黑色素瘤细胞的细胞膜染色。值得注意的是，在孵育2h后，观察到PD-1 NV有效地结合在B16F10细胞的细胞膜表面(图3a)。相反，Cy5.5标记的游离NV具有较低的膜结合亲和力(图3a)。此外，还检测了PD-1 NV与树突状细胞(DC)之间的相互作用。PD-1 NV与骨髓衍生DC(BMDC)孵育2h。共焦图像显示，2h后，DsRed-PD-1 NV能有效结合并被BMDC内化(图3b)。为探讨PD-1 NV与B16F10细胞的结合是否是通过PD-1与PD-L1之间的相互作用，首次检测了NV上的PD-1受体与B16F10细胞上的PD-L1之间的共定位。PD-1 NV与表达EGFP-PD-L1的B16F10细胞孵育5h。值得注意的是，PD-1 NV与EGFP-PD-L1共定位在B16F10黑色素瘤细胞上(图3c)。为证实NV上的PD-1受体与B16F10细胞上的PD-L1之间的分子结合，加入抗PD-L1抗体阻断B16F10细胞上的PD-L1。共焦图像显示，当PD-L1抗体(aPD-L1)与细胞预孵育时，PD-1 NV结合显著降低。此外，流式细胞术数据还显示，当PD-L1抗体与细胞预孵育时，PD-1 NV与B16F10细胞结合的数量显著减少(图3d)。用免疫共沉淀(CO-IP)测定检测PD-1受体与PD-L1之间的分子相互作用。PD-1 NV与B16F10黑色素瘤细胞孵育20h后，收获细胞。用PD-1一级抗体下拉NV上的PD-1受体。值得注意的是，PD-1抗体将PD-L1与PD-1受体一起下拉(图3e)，表明PD-1 NV与B16F10细胞表达的PD-L1发生物理相互作用。这些结果共同证实了表面呈现PD-1的NV可以通过PD-1受体与PD-L1之间的结合与肿瘤细胞有效地相互作用。
为了研究PD-1 NV的全身生物分布和动力学，用Cy5.5标记游离NV和PD-1 NV。通过尾静脉向小鼠注射游离NV和PD-1 NV。如图3f所示，与游离NV相比，PD-1 NV具有更高的血液潴留。PD-1 NV显示29％和13％总潴留，而游离NV分别在8h和24h显示12％和1.7％潴留。接下来，检测PD-1 NV的体内组织分布。经尾静脉注射使B16F10荷瘤小鼠接受Cy5.5标记的PD-1 NV。值得注意的是，据观察PD-1 NV的Cy5.5荧光主要在肝脏、肾脏和肿瘤部位积聚(图3g和3h)。为了进一步评估PD-1 NV的生物分布，用共焦成像对Cy5.5标记的NV在器官和肿瘤的切片中的生物分布进行了定量。用WGA Alexa-Fluor 488染料对组织切片的细胞膜染色。PD-1 NV的分布与显示PD-1 NV在肿瘤组织切片中密集积聚的成像数据平行(图3i)。
为了确定PD-1 NV是否促进小鼠对黑色素瘤的免疫应答，建立了B16F10-luc细胞皮下接种C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。肿瘤接种后五天，通过尾静脉注射向小鼠接种25mg/kg游离NV和20-30mg/kg PD-1 NV。通过测量生物发光信号和肿瘤大小来监测肿瘤生长。值得注意的是，用20mg/kg、25mg/kg和30mg/kg剂量的PD-1 NV治疗的小鼠中，B16F10肿瘤生长明显延缓(图4)。PD-L1抗体是一种用于黑色素瘤治疗的阻断PD-L1的临床治疗性抗体。为了证实PD-1 NV的体内抗肿瘤作用，采用了将施用抗PD-L1抗体作为阳性对照的治疗。将小鼠分为三组：通过尾静脉向小鼠注射25mg/kg游离NV(第1组)和PD-1 NV(第2组)，每三天注射一次，共五个周期。还将抗PD-L1抗体(aPD-L1，第3组)以2mg/kg注射给小鼠作为阳性对照组。利用生物发光信号和肿瘤大小监测肿瘤生长。值得注意的是，与aPD-L1治疗相比，PD-1NV显著延缓B16F10黑色素瘤生长。(图5a、5b和5c)。因此，PD-1 NV提高了小鼠的生存(图5d)，并且在PD-1 NV治疗后，20％的小鼠生存超过60天。此外，在治疗期间没有明显的体重减轻(图5e)。在用游离NV治疗的小鼠中没观察到明显的抗肿瘤作用。
耗尽的CD8+ T细胞表达抑制性受体蛋白，包括PD-1、TIGIT、LAG3和TIM3，其产生免疫细胞因子(诸如IFN-γ和TNF-α)的能力降低。为了评估PD-1 NV治疗是否能减少T细胞耗尽并维持其抗肿瘤功能，在第5个周期结束时测量治疗的小鼠血清中IFN-γ和TNF-α水平。用PD-1 NV或aPD-L1治疗的小鼠血清中IFN-γ水平显著升高(图5f)，而TNF-α水平保持不变。通过流式细胞术分析收获的肿瘤中CD8+ T细胞的浸润。与对照组相比，从用PD-1 NV或aPD-L1组治疗的小鼠收集的肿瘤中活化的CD8+T细胞的百分比和数量显著增加(图5g和5h)。相似地，通过免疫荧光法在用PD-1 NV或aPD-L1治疗的小鼠收集的肿瘤中检测到更高密度的CD8+T细胞(图5i和5j)。最后，对PD-1 NV导致的潜在毒性进行了评价。五个治疗周期后，血细胞计数(CBC)显示，用PD-1 NV治疗的小鼠中淋巴细胞和单核细胞含量略有下降，而淋巴细胞比例不受影响。此外，由免疫系统对过敏原过度反应而产生的免疫球蛋白E(IgE)抗体的血浆水平在用PD-1 NV治疗五个周期后没有明显升高。
接下来，将IDO抑制剂1-MT负载到PD-1 NV中，研究IDO抑制剂与免疫检查点阻断剂的联合疗法。与传统孵育方法(16.5％)相比，采用电击法可获得较高的1-MT负载效率(24.5％)。还测试了PD-1 NV中1-MT的释放。1-MT在体外可在24小时内迅速从NV释放。此外，为了确定负载1-MT的PD-1 NV释放的1-MT的抑制作用，用IFN-γ刺激后表达IDO的HeLa细胞进行IDO抑制实验。值得注意的是，与游离1-MT和负载1-MT的游离NV相比，负载PD-1的1-MT具有更好的抑制作用(图6)。为了评价肿瘤体内药物释放，检测PD-1 NV在肿瘤内的积聚。Cy5.5标记的PD-1 NV在注射后30分钟内在肿瘤中积聚，并且随着时间的推移，积聚逐渐增加，这表明1-MT可以在肿瘤中有效释放(图7)。
为了证明负载1-MT的PD-1 NV同时提供的IDO抑制和PD-L1阻断剂增强抗肿瘤活性，B16F10-luc荷瘤小鼠分别用PBS(第1组)、游离NV(第2组)、游离1-MT(第3组)、PD-1 NV(第4组)、负载1-MT的游离NV(第5组)、1-MT加aPD-L1(第6组)或负载1-MT的PD-1 NV(第7组)治疗，每3天一次，共五个周期。通过测量生物发光信号和肿瘤大小来监测肿瘤生长。在用游离1-MT和负载1-MT的游离NV(60％)治疗的小鼠中，发现有较高的应答率(>80％)，但是观察到肿瘤生长受到有限的抑制(图8a和8b)。这种不理想的疗效可能是因为TME中存在多种免疫抑制机制。值得注意的是，与1-MT相比，PD-1 NV具有更好的抗肿瘤作用(图8a和8b)。用1-MT加aPD-L1治疗的小鼠表现出显著延迟黑色素瘤肿瘤的进展(图8a和8b)。重要的是，用负载1-MT的PD-1 NV治疗对黑色素瘤显示大于80％的应答率，这比单独使用1-MT或PD-1 NV的治疗更有效(图8a和8b)，并且与1-MT加aPD-L1的治疗相当(图8a和8b)。此外，负载1-MT的PD-1 NV对IDO和PD-L1的双重抑制提高了治疗小鼠的生存，而没有明显的体重减轻(图8c)。检测不同治疗组肿瘤边缘CD8+ T细胞的密度。从所有治疗组均收获肿瘤浸润的CD8+ T细胞，并用流式细胞术和免疫荧光法进行分析。结果表明，与PBS治疗组相比，使用游离1-MT和负载1-MT的NV治疗可使浸润的CD8+ T细胞数量增加约15-20％(图8d和8e)。免疫荧光染色证实PD-1和负载1-MT的PD-1 NV显著增强肿瘤浸润CD8+ T的密度(图8f)。联合治疗的疗效优于单独治疗。还研究了CD4+ FoxP3+ T细胞的浸润。值得注意的是，与对照组相比，负载1-MT的PD-1 NV组中CD4+FoxP3+ T细胞减少。最后，收集肝、脾、肾、心脏、肺等主要脏器并通过免疫组化评估，未见明显的器官损伤体征。这些数据显示IDO抑制结合PD-L1阻断剂PD-1 NV可显著破坏TME的免疫抑制，增强宿主免疫系统对癌细胞的清除。
综上所述，显示PD-1受体的细胞纳米载体被设计成能有效结合肿瘤细胞上的PD-L1并破坏PD-1/PD-L1抑制轴。用PD-1 NV的PD-L1阻断剂可显著增强对黑色素瘤肿瘤的体内免疫应答。此外，PD-1 NV还可用于携带多种治疗药物以实现协同疗效。负载1-MT的PD-1 NV可实现IDO抑制和PD-L1阻断剂。肿瘤双重免疫耐受机制的同时破坏显著抑制了体内黑色素瘤生长。因此，用PD-1细胞NV的PD-L1阻断剂提供了一种很有前途的策略，其利用递送载体和封装药物的功能来增强免疫治疗。
a)方法和材料
(1)化学品和试剂：
1-MT、潮霉素B、磷酸酶抑制剂混合物、Optiprep溶液订购自Sigma-Aldrich。mGMSF、mIL-4和mTNF-α订购自Thermo Fisher Scientific。PD-L1抗体来自ThermoScientific。蛋白质印迹用抗PD-1抗体来自Sigma-Aldrich。免疫荧光染色用小鼠CD4和CD8抗体订购自Abcam。体内使用的抗PD-L1抗体(aPD-L1)购自Biolegend公司。蛋白A/G-琼脂糖珠购自Santa Cruz。麦胚凝集素(WGA)Alexa Fluor 488和594染料购自ThermoScientific。用于FACS分析的包括CD3、CD4和CD8的染色抗体订购自Biolegend公司。
(2)质粒和细胞系：
将小鼠PD-1克隆到pCMV6哺乳动物表达载体中。质粒经自动DNA测序证实。小鼠EGFP-PD-L1质粒购自义翘神州生物技术有限公司。根据制造商的说明，通过lipofectamine2000(Invitrogen)利用质粒瞬时转染HEK293T细胞。为了建立稳定的细胞，用pCMV6-OFR-PD-1转染HEK293T细胞，并用潮霉素B进一步选择。通过LipofectamineTM转染试剂(Invitrogen,18324012)利用EGFP-PD-L1质粒转染B16F10细胞。
(3)细胞培养：
将HEK293T细胞在添加10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。小鼠黑色素瘤细胞系B16F10购自美国典型培养物保藏中心。对于体内生物发光肿瘤成像，B16F10-luc细胞是来自UNC的黄叶博士的馈赠。HeLa细胞获自北卡罗来纳大学莱恩伯格综合癌症中心的组织培养设施(Tissue Culture Facility of UNC LinebergerComprehensive Cancer Center)。将从C57BL/6小鼠骨髓中分离的细胞用具有10％FBS并补充了20ng mGM-CSF和10ng IL-4的RPMI 1640培养，获得骨髓衍生DC。
(4)制备细胞膜纳米囊泡：
将稳定表达DsRed-PD-1的HEK293T细胞培养在含10％FBS的DMEM培养基中。用胰蛋白酶收获细胞。通过1000rpm离心，将细胞用冷PBS洗涤3次。然后，用含有0.25M蔗糖、1mMEDTA、20mM Hepes-NaOH pH 7.4和蛋白酶抑制剂混合物的均质培养基(HM)悬浮细胞。之后，在冰上用杜恩斯均质器破坏细胞至少50次。将整个溶液在1000×g下旋转5分钟。然后丢弃沉淀物，并将上清液以100,000×g离心1h。将含有质膜材料的沉淀物用HM缓冲液洗涤3次。为了制备细胞膜纳米囊泡，将HM缓冲液中的细胞膜通过0.8μm过滤器至少10次，然后再通过0.22μm过滤器10次。为了进一步纯化所述纳米囊泡，将挤出样品施加50％碘克沙醇(Optiprep)的阶跃梯度，然后在4℃下以100,000×g超速离心2h。
(5)从小鼠骨髓中分离DC细胞：
从骨髓中分离出骨髓衍生DC。总之，从C57BL/6小鼠分离股骨和胫骨，在冰上置于RPMI 1640培养基中。用剪刀切断每根骨头的末端，并通过注射器用2mL RPMI 1640培养基冲洗骨髓。将含有细胞的培养基通过Nytex网去除大颗粒。以1000rpm离心5分钟，丢弃上清液。将细胞悬浮在红细胞裂解缓冲液(Thermo Scientific)中，在室温下裂解红细胞5分钟。用RPMI 1640洗涤骨髓细胞两次，每次在室温下以1000rpm离心10分钟。在具有RPMI 1640培养基的培养皿中接种细胞，并添加小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(mGM-CSF,50ng/mL)和IL-4(10ng/mL)。在第5天与第8天之间可以观察到细胞的聚集物。去除聚集物用RPMI1640培养基轻轻分散，并将细胞接种在具有添加了mGM-CSF、50ng/mL和IL-4的RPMI 1640的6孔板中，以供进一步使用。
(6)1-MT负载：
为了将1-MT负载到PD-1 NV中，将1mg纯化的囊泡和500μg 1-MT(100mg/mL在pH 10的PBS中稀释)在4℃下轻轻混合到1mL电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾pH 7.2，25mM氯化钾，21％Optiprep)中。使用微脉冲电穿孔器(美国Bio-Rad)，在0.4cm电穿孔杯中以300V和150μF对样品进行电穿孔。然后，将含有样品的电穿孔杯在冰上孵育30分钟，进行膜回收。然后将NV用冷PBS以100,000×g超离心洗涤3次。对于将1-MT负载到纳米囊泡中的另一种方法，将1mg纯化的囊泡和500μg的1-MT轻轻混合到1ml PBS中，并在37℃下孵育2h。然后将纳米囊泡用PBS洗涤三次。
(7)蛋白质印迹:
进行免疫印迹分析。简而言之，用RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)裂解稳定表达DsRed-PD1的HEK293T细胞。然后，用12％SDS-PAGE对细胞裂解物和纯化的膜囊泡样品进行分离，用PD-1和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析，然后用增强化学发光(ECL)检测(Thermo Scientific)。
(8)CO-IP测定：
为了检测纳米囊泡(NV)上的PD-1与B16F10细胞上的PD-L1的相互作用，进行了Co-IP测定。简单地说，添加1mL(700μg/mL)PD-1 NV并与B16F10细胞(10cm培养皿)孵育20h。然后将细胞用PBS洗涤三次，去除未结合的NV。然后，在含有磷酸酶抑制剂混合物的1ml RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)中裂解细胞。通过在4℃下以15000×g离心10分钟来澄清细胞裂解。用蛋白G-琼脂糖珠(Santa Cruz)在4℃下轻轻旋转澄清的裂解物1h来将其预先清除。然后将细胞裂解用PD-1一级抗体在4℃下振荡过夜孵育。第二天用10μL蛋白质G-琼脂糖珠在4℃下放置2h。将珠子用冰冷的RIPA缓冲液轻轻洗涤5次。用12％SDS-PAGE将结合蛋白分开，用所示抗体进行免疫印迹分析。
(9)免疫沉淀测定(IP测定)：
进行免疫沉淀(IP)测定来检测PD-1受体的取向。简单地说，将1mL(500μg/mL)PD-1NV与蛋白A/G珠在室温下预孵育1h，以去除非特异性结合蛋白。然后，将PD-1 NV与2μg PD-1一级抗体在4℃下孵育5h。之后添加10μL蛋白A/G-琼脂糖珠，并在室温下孵育2h。将珠子用PBS轻轻洗涤3次。用12％SDS-PAGE将结合蛋白分开，用所示抗体进行免疫印迹分析。
(10)纳米囊泡细胞结合测定：
将B16F10细胞接种于共焦培养皿中。如所示将DsRed-PD-1 NVs(50μg/mL)或标有Cy5.5的PD-1游离NV(50μg/mL)添加到培养基中并孵育20h。将aPD-L1抗体(20μg/mL)与细胞孵育4h，然后将所述PD-1 NV添加到培养基中。然后添加麦胚凝集素(WGA)、Alexa Fluor488缀合物标记细胞膜10分钟。将BMDC(从骨髓分离后7天)接种在共焦孔中，并添加10UTNF-α刺激DC细胞成熟。然后添加DsRed-PD-1 NV(50μg/mL)并与DC细胞孵育20h。然后添加麦胚凝集素(WGA)、Alexa Fluor 488缀合物标记细胞膜10分钟。然后将细胞核用Hoechst染色10分钟。将细胞用PBS洗涤三次。在共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63×物镜进行共聚焦显微镜检查。对于与B16F10细胞结合的PD-1 NV的流式细胞术分析，如所示将PD-1 NV(50μg/mL)与B16F10细胞孵育2h。或将aPD-L1抗体(20μg/mL)与细胞孵育4h，然后将PD-1 NV添加到培养基中。门控于DsRed+。
(11)药物释放：
在37℃的PBS(pH7.2)中分析NV(1mg/mL)的1-MT释放。通过HPLC检测1-MT的释放量。在乙腈梯度增加的醋酸钠缓冲液(50mM,pH 4.2)中以1.0mL/min的流速进行分离。在280nm处监测柱流出物的吸光度。
(12)IDO活性的细胞测定：
为了检测1-MT对IDO的抑制作用，对于IDO酶活性测定，将HeLa人肿瘤细胞以4.0×104细胞/孔接种于添加80μM L-色氨酸、10％FBS(Hyclone)和青霉素链霉素(Gibco)的DMEM/无酚红培养基中。第二天，将1-MT或1-MT@PD-1 NV在DMSO/0.1N Hcl中溶解并在测定孔中连续稀释，同时保持DMSO/HCl稀释常数为1:1000。然后每孔添加100ng/mL重组人IFN-γ(目录号#570206，BioLegend Inc.San Diego,Ca)刺激IDO表达。在285nm的激发波长和365nm的发射波长下通过荧光检测器鉴定色氨酸，或者在280nm处通过HPLC鉴定色氨酸。
(13)循环
在PBS缓冲液中用NHS-Cy5.5标记游离NV和PD-1 NV。在4℃下孵育过夜之后，将Cy5.5标记的PD-1 NV用PBS洗涤3次。通过尾静脉分别向C57BL/6小鼠注射200μL(2mg/mL)Cy5.5标记的游离NV和PD-1 NV。分别于注射后不同时间点(分别在2分钟、2h、4h、8h、24h和48h)从眼窝采集小鼠的血。然后，测量血清的荧光信号。
(14)生物分布：
在PBS缓冲液中用NHS-Cy5.5标记PD-1 NV。在4℃下孵育过夜之后，将Cy5.5标记的PD-1 NV用PBS洗涤三次。通过尾静脉向黑色素瘤荷瘤C57BL/6小鼠注射200μL(2mg/mL)Cy5.5标记的PD-1 NV。给对照组注射PBS。24h和48h后，收获小鼠主要器官和肿瘤。最后，利用Xenogen IVIS光谱成像系统记录荧光成像和平均荧光强度。
(15)体内抗肿瘤疗效研究：
雌性C57BL/6小鼠购自美国Jackson实验室。所有的小鼠研究都是在北卡罗来纳州立大学机构动物护理和使用委员会以及北卡罗来纳大学教堂山分校批准的动物方案的背景下进行的。将小鼠称重，并随机分为不同组。小鼠腹腔(肿瘤体积达到40-50mm3)皮下移植1×106B16F10肿瘤细胞5d后，通过尾静脉注射向小鼠施用PBS、游离纳米囊泡(25mg/kg)、PD-1纳米囊泡(25mg/kg)、1-MT(2.5mg/kg)、负载1-MT的PD-1纳米囊泡(25mg/kg)、抗PD-L1抗体(2mg/kg)。通过体检监测肿瘤的发生率，并且随着时间的推移用数字卡尺测量大小。用游标卡尺测量肿瘤，体积(V)计算为V＝d2×D/2，其中d为肿瘤最短直径，D为肿瘤最长直径，单位为mm。为了评估潜在的毒性，每天监测小鼠的体重减轻。对于生存测定，分别进行实验。
(16)体内生物发光和成像：
用Xenogen IVIS光谱成像系统收集生物发光图像。在将DPBS(15mg/mL)中的d-荧光素(Pierce)腹腔内注射入动物(10μL/g体重)后10分钟，使用活体图像软件(Xenogen)获取数据。
(17)组织免疫荧光测定：
将肿瘤从小鼠体内解剖出并在最佳切割介质(O.C.T.)中速冻。将若干微米切片用冷冻切片机切割并安装在载玻片上。将冷冻的器官(肺、肝、心脏、肾、脾)和肿瘤切片在PBS中孵育15分钟，以移除包埋介质。用含有3％BSA和0.5％Triton X-100的缓冲液封闭样本30分钟。对于器官，将样本用WGA Alexa Fluor 488孵育10分钟。对于肿瘤样本，随后将肿瘤切片用CD4和CD8一级抗体(1.5％BSA中1:50)孵育过夜，然后用PBS洗涤三次，每次5分钟。然后将它们用在1.5％BSA中稀释的TRITC二级抗体(KPL)在室温下在黑暗中孵育1小时。最后，用DAPI对细胞核染色，并且将组织用PBS洗涤3次，每次5分钟。共聚焦显微镜使用40倍物镜在FLUO-VIEW激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)上以连续扫描模式执行。
(18)细胞因子检测：
在各种处理后，从小鼠中分离出血浆样品，并稀释以进行分析。根据制造商的方案，用ELISA试剂盒分析肿瘤坏死因子(TNF-a，Invitrogen)，干扰素γ(IFN-γ，eBioscience)。
(19)苏木精-曙红染色：
收集接受不同处理的小鼠的主要器官(肝、脾、肾、心脏和肺)并在10％中性缓冲福尔马林中固定。然后将器官常规处理到石蜡中，切成8μm切片，用苏木精和曙红染色，并且最后用数字显微镜检查。
(20)统计分析：
如图所示，所有结果均表示为平均值±标准偏差，或平均值±标准误差。除非另有说明，否则所有实验中都使用生物平行测定。当如所指示比较两组以上(多重比较)时，使用单向或双向方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验。使用对数秩检验确定生存益处。所有统计分析都使用IBM SPSS统计19执行。统计显著性的阈值为P<0.05。
2.实例2：用于癌症免疫治疗的表达PD-1的血小板
目前，除PD-L1以外，存在许多对免疫治疗有抗性的内在和外在机制，包括肿瘤抗原表达、CTLA-4和其他免疫检查点以及免疫抑制性细胞群体(Treg、MDSC、II型巨噬细胞)的丢失。在这些免疫阻断剂中，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg细胞)在肿瘤微环境中竞争IL-2的消耗，这抑制了肿瘤浸润的CD8+ T细胞的增殖。此外，活化的Treg细胞还可以通过穿孔素直接杀死T细胞。因此，肿瘤组织中大量的Treg细胞是成功的癌症免疫治疗的关键障碍。Treg细胞的耗尽显著提高了PD-1/PD-L1阻断的应答率。
作为血管损伤、血流中的侵入性微生物和循环肿瘤细胞(CTC)的监测物，血小板最近被用来设计纳米载体。与抗PD-L1偶联的血小板可以靶向肿瘤手术伤口，使耗尽的CD8+ T细胞恢复活力，从而减少术后肿瘤复发和转移。然而，由于治疗期间需要大量与宿主匹配的血小板，因此血液来源的血小板存在生物安全性和不足的挑战。此外，血小板是无核的，其不能增殖或不能被遗传操纵。另选地，从巨核细胞(MK)的体外生产可提供大规模的血小板源。在本文中，对巨核细胞进行了基因工程改造以稳定表达小鼠PD-1，并且随后在体外产生了呈现PD-1的血小板。然后通过使耗尽的CD8+ T细胞恢复活力来将这些细胞应用于手术伤口(图9A、图6B和图9C)。除PD-L1阻断剂以外，表达PD-1的血小板还可以携带和转运环磷酰胺，这允许肿瘤微环境内的Treg耗尽，并进一步增强手术肿瘤微环境内CD8+ T淋巴细胞的抗肿瘤效应。
除了阻断PD-L1之外，PD-1血小板还可以充当平台并与其他免疫阻断抑制剂结合以提高应答率。因此，将环磷酰胺同时加载到血小板中以耗尽Treg细胞。负载环磷酰胺的PD-1血小板制剂破坏了PD-L1和Treg细胞的免疫阻断，其显著增加了手术肿瘤微环境中恢复活力的CD8+Ki67+GrzmB+淋巴细胞的频率。因此，作为细胞平台的PD-1血小板与其他免疫阻断抑制剂组合可以提高应答率并降低手术后肿瘤复发率。
(1)稳定表达PD-1的MK细胞系的产生
血小板从骨髓和肺驻留MK中释放。为了大规模产生血小板，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)处理小鼠MK祖细胞L8057。刺激后，细胞体积显著增加，并伴有前血小板扩展和血小板释放。具有较大细胞体积的MK包含多个核，表明成熟并准备释放血小板。为了产生PD-1血小板，通过用慢病毒转导和用嘌呤霉素后筛选来建立稳定表达小鼠EGFP-PD-1的L8057细胞系。显著的是，PD-1受体在细胞膜上表达和定位，这通过来自EGFP的荧光和细胞膜染料Alexa Fluor 594缀合物麦胚凝集素(WGA594)的共定位来指示(图10A)。通过蛋白质印迹证实了EGFP-PD-1L8057细胞上的PD-1表达(图10B)。MK的标志物CD41a在PD-1L8057细胞系上集中表达。在用PMA刺激后，表达PD-1的L8057细胞经历成熟，并且在形态上显示出典型的外周核并增加了细胞质体积。MK成熟的标志物CD42a在细胞膜上表达(图10C)。此外，血小板表面受体GPVI(胶原受体)和P-选择素在成熟的PD-1L8057细胞中表达。Wright-Giemsa染色显示成熟的PD-1L8057细胞含有多倍体核(图10D)。
(2)从MK体外生产PD-1血小板
成熟的MK通常驻留在骨髓和肺出芽的伪足小体中，并延长以形成血小板。前血小板横穿窦内皮并将血小板释放到血流中。类似地，成熟的表达PD-1的L8057细胞具有出芽的伪足小体，其延长以形成前血小板(图10E)。值得注意的是，前血小板出芽并从细胞膜延伸以形成珍珠样结构(图10F)。前血小板最终解体并释放血小板。含有EGFP-PD-1+膜囊泡的MK细胞质作为前血小板形成的膜储库存在(图10F)。这些表达PD-1的膜囊泡融合以形成管状结构并从细胞表面出芽(图10F)。来自培养基的纯化血小板显示绿色荧光，这表明PD-1存在于血小板中(图10G)。包括GPVI和P-选择素的结合受体也在从L8057细胞释放的血小板中表达。此外，DLS分析显示血小板的平均直径为约2μm并且具有-10±2.6mV的电动电势(图10H)。如通过低温扫描电子显微镜(CSEM)和透射电子显微镜(TEM)所表明的，纯化的血小板显示球形形态(图10I和图10J)。此外，定量测量来自PD-1L8057细胞的血小板产量，在用PMA刺激后的第6天血小板的产量显著增加(图10K)。
(3)PD-1血小板的生物学行为
血小板可以实现止血，募集其他白细胞用于宿主防御反应，并释放若干种免疫活性分子。血小板激活在粘附到血管病变之后发生。胶原是活性血小板结合的主要内皮下组分。因此，测试了PD-1血小板的胶原结合特性。实际上，WGA Alexa-Fluor 594染料标记的游离和PD-1血小板具有强的胶原粘附能力(图11a和图11b)。相比之下，用抗GPVI抗体阻断胶原受体GPVI强烈地降低了血小板的胶原粘附能力。通过血小板凝集进行的血栓形成是止血反应的另一个关键事件。响应于凝血酶的激动剂刺激，游离和PD-1血小板响应于凝血酶的激动性刺激而在它们自身之间有效地聚集。此外，从携带趋化因子和粘附分子的活化血小板中产生血小板微粒(PMP)，从而促进炎症和动脉粥样硬化部位中的单核细胞。为了检查在刺激时是否能够从活化的PD-1血小板产生PMP，在体外用凝血酶处理血小板。CLSM、SEM和TEM图像表明从活化的血小板产生了PMP(图11c)。还观察到，在用凝血酶处理后，血小板形态变得更加树枝状和膨胀(图11c)。此外，DLS分析检测到较小颗粒的产生，表明PMP从活化的血小板中释放(图11d)。
PD-L1在肿瘤细胞上的表达升高使T细胞耗尽(Tex)。为了研究PD-1血小板是否能够结合到黑素瘤癌细胞的表面并阻断PD-L1，将PD-1血小板用B16F10黑素瘤癌细胞进行体外孵育。值得注意的是，PD-1血小板有效地结合到B16F10细胞，然后被癌细胞内化(图11e)。相比之下，游离血小板显示出有限的与B16F10细胞结合的能力(图11e)。为了检测PD-L1/PD-1相互作用是否介导血小板的内化，添加抗PD-L1抗体以阻断B16F10细胞上的PD-L1。共焦图像显示出当PD-L1抗体用细胞预孵育时，PD-1血小板结合显著降低。此外，EGFP-PD-1血小板与B16F10黑素瘤细胞上的PD-L1配体共定位，表明PD-1与PD-L1之间存在相互作用(图11f)。为了研究游离和PD-1血小板的系统体内循环时间，将血小板用Cy5.5标记，随后通过尾静脉注射将其注射到小鼠体内。与PD-1血小板(8％，24小时)相比，游离血小板具有稍长(14％，24小时)的血液保留特性(图11g)。当在B16F10荷瘤小鼠中切除肿瘤后静脉接种Cy5.5标记的血小板时，游离和PD-1血小板均可在残余肿瘤床中积聚(图11H和图11I)。同时，血小板在肝和脾中集中积聚(图11H和图11I)。糖蛋白VI(GPVI)是血小板上的胶原受体，并且负责使血小板靶向伤口。PD-1血小板和游离血小板显示出相似的胶原结合能力(图11A)。因此，外科肿瘤中的积聚能力在游离血小板与PD-1血小板之间是相似的(图11H)。
(4)PD-1血小板的体内抗肿瘤效应
黑素瘤细胞上PD-L1的上调使T细胞耗尽，表现出T细胞增殖和活性方面的功能障碍。为了研究PD-1血小板是否能够阻断PD-L1以使手术后的残余肿瘤消退，使用B16F10黑素瘤不完全肿瘤切除模型来模拟术后局部复发(图12a)。当肿瘤体积生长到100mm3左右时，向小鼠静脉注射单剂量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、游离血小板(1×108)、PD-1血小板(1×108)。在小鼠接受血小板注射之后，立即进行肿瘤手术以移除大部分肿瘤(约90％)。手术后，小鼠在伤口愈合期间接受附加治疗(图12a)。值得注意的是，如通过监测肿瘤生物发光和测量肿瘤大小所评估的，在接受PD-1血小板的小鼠中实现了高应答率。(图12b和图12c)。通过监测B16F10细胞的生物发光信号和测量肿瘤大小，在接受PD-1血小板的小鼠中，残余肿瘤的进展显著延迟(图12b和图12c)。相比之下，残余黑素瘤肿瘤在接受游离血小板或PBS的小鼠中迅速发展(图12b和图12c)。得益于PD-1血小板治疗，25％的小鼠存活超过60天，而没有明显的体重减轻或其他毒性迹象(图12d)。在血小板治疗的小鼠中没有观察到明显的器官损伤迹象。为了检查CD8+ TIL的积聚，收集肿瘤并通过荧光激活细胞分选术(FACS)和免疫荧光进行分析。显著的是，PD-1血小板治疗的小鼠的肿瘤中CD8+ TIL的频率强烈增加(图12E、图12F和图12G)，并且T细胞表现出增加的细胞毒性蛋白颗粒酶B(GzmB)表达，这表明表达PD-1的血小板能够在肿瘤微环境内恢复T细胞耗尽(图12H和图12I)。
(5)负载有环磷酰胺的PD-1血小板的体内抗肿瘤效应
低剂量的环磷酰胺能够改善各种小鼠肿瘤模型和患者的免疫应答，这通常归因于Treg的选择性耗尽。为了对抗肿瘤部位处的Treg，我们将环磷酰胺负载到血小板中。发现血小板能够在体外在24小时内内化并释放环磷酰胺。为了研究PD-L1阻断和环磷酰胺诱导的Treg耗尽的同时抗肿瘤效应，使用具有不完全肿瘤切除的相同B16F10黑素瘤模型。在该模型中，虽然环磷酰胺和表达PD-1的血小板在用作单一试剂时显示有限的结果(图13A和图14A)，但是在用负载有环磷酰胺的表达PD-1的血小板治疗的小鼠中肿瘤进展被显著抑制(P<0.001)(图13A和图14A)。环磷酰胺和PD-L1同时阻断导致的Treg耗尽改善了受治疗小鼠的存活(图13B)。
还研究了治疗后肿瘤中CD4+ Treg和CD8+ TIL的频率。游离的环磷酰胺和负载有环磷酰胺的血小板选择性地耗尽了肿瘤内的Treg(图13C和图14B)，并增加了Ki67+ T细胞的频率(图13D、图13E)。值得注意的是，尽管表达PD-1的血小板在减少Treg方面具有有限的效应，但它们仍会增加Ki67+ T细胞的频率(图13D、图13E)。显著的是，在从用负载有环磷酰胺的表达PD-1的血小板治疗的小鼠收集的肿瘤中，CD8+ TIL的频率显著增加(图13F、图13G)，并且这些细胞显示出GzmB表达(图13H、图13I)。免疫荧光染色还显示了与对照小鼠相比，在用负载有环磷酰胺的表达PD-1的血小板治疗的小鼠中，浸润的CD8+ T细胞的密度增加(图13J、图13K)。用低剂量环磷酰胺和载有环磷酰胺的血小板治疗的小鼠表现出延迟的腹部毛发生长和轻微的体重减轻(图14A、图14C)。这些结果表明，表达PD-1的血小板和环磷酰胺的组合利用有效地破坏了对PD-L1的免疫阻断并耗尽了Treg，从而导致了降低的手术后肿瘤复发率。
b)结论
综上所述，呈现PD-1的血小板是经过基因工程改造的，其可以在手术伤口部位积聚，并阻断残留肿瘤细胞上的PD-L1，使耗尽的CD8+ T细胞强烈恢复，从而消灭残留的肿瘤细胞。将巨核细胞祖细胞工程化表达小鼠Pd-1，并诱导其产生呈现PD-1的血小板。除了阻断PD-L1之外，PD-1血小板还可以充当平台并与其他免疫阻断抑制剂结合以提高应答率。负载环磷酰胺的PD-1血小板制剂破坏了PD-L1和Treg细胞的免疫阻断，其显著增加了手术肿瘤微环境中恢复活力的CD8+Ki67+GrzmB+淋巴细胞的频率。恢复活力的CD8+清除残留肿瘤细胞，降低术后肿瘤复发率。
c)方法
(1)化学品和试剂
环磷酰胺、凝血酶、Wright-Giemsa溶液和磷酸酶抑制剂混合物订购自Sigma-Aldrich。PD-1抗体来自Thermo Scientific。PD-L1抗体来自Sigma-Aldrich。小鼠CD41a(ab63983)和CD42a(ab173503)抗体来自Abcam。P选择素(sc-8419)来自Santa Cruz生物技术公司。小鼠GPVI(MAB6758)抗体来自R&D Systems。免疫荧光用小鼠CD4和CD8抗体购自Abcam。FACS分析用包括CD3、CD4、CD8、Ki67、Foxp3的染色抗体订购自Biolegend公司。麦胚凝集素(WGA)Alexa Fluor 488和594染料订购自Thermo Scientific。
(2)细胞培养
将HEK293T细胞在添加10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。小鼠巨核细胞系L8057由波士顿儿童医院和Dana-Farber癌症研究所的AlanCantor教授提供，并在含有20％FBS的RPMI 1640中培养。小鼠黑色素瘤细胞系B16F10购自美国典型培养物保藏中心。对于生物发光体内肿瘤成像，B16F10-luc细胞是来自UNC的黄叶博士的馈赠。将B16F10细胞在添加10％FBS的DMEM中培养。
(3)质粒和稳定细胞系
含有C-端单体GFP标签的小鼠PD-1的Lenti载体(pLenti-C-mGFP-PD-1-puro)和含有包装质粒和转染试剂的Lenti-vpak包装试剂盒购自Origene。根据制造商的说明，通过来自lenti-vpak包装试剂盒的转染试剂利用质粒瞬时转染HEK293T细胞。用自HEK293T细胞包装的lenti-virus感染L8057细胞，并与6μg/ml聚凝胺孵育。感染96h后，将L8057细胞在具有辅以1μg/ml嘌呤霉素的20％FBS的RPMI-1640中培养，筛选稳定表达小鼠PD-1的细胞系。然后，将建立的L8057细胞稳定表达小鼠EGFP-PD-1保存在辅以0.5-1μg/ml嘌呤霉素的20％FBS中。
(4)自L8057细胞制备血小板
在具有20％FBS的RPMI 1640中培养L8057细胞和PD-1L8057细胞。为了成熟和分化，将L8057细胞用100-500nM PMA刺激3天。然后将细胞培养6天以上，产生前血小板和血小板。为了分离血小板，将培养基以1500rpm离心20分钟以去除细胞。然后将上清液在室温下以12,000rpm离心20分钟。将血小板沉淀物小心地重新悬浮在台罗德氏缓冲液(134mMNaCl、12mM NaHCO3、2.9mM KCl、0.34mM Na2HPO4、1mM MgCl2、10mM HEPES、pH 7.4)或具有1μM PGE1的PBS中。对于活性血小板，向血小板悬液中添加0.5U凝血酶ml-1。在血小板活化前去除PGE1。
(5)Wright-Giemsa染色
用100-500nM PMA刺激L8057细胞3天。然后收获细胞，并用PBS缓冲液洗涤三次。然后，用无水甲醇固定细胞5分钟。将细胞在Wright-Giemsa染色液中染色5分钟。然后将染色细胞用PBS缓冲液洗涤三次。最后，在显微镜下用40×物镜观察染色细胞。
(6)细胞免疫荧光测定
将稳定表达EGFP-PD-1的L8057细胞用PBS洗涤三次。然后将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟。将细胞用PBS洗涤两次，然后用0.2％Triton X-100孵育5分钟。然后用含有3％BSA的缓冲液封闭细胞1h。然后将CD41a、CD42a和p-选择素一级抗体分别与L8057细胞在4℃下孵育过夜。将细胞用PBS洗涤三次。然后将细胞在室温下、黑暗中用在1.5％BSA中稀释的罗丹明偶联二级抗体(KPL)孵育1h。最后，将细胞核用DAPI染色10分钟。最后，将细胞用PBS洗涤三次，持续5分钟。在FLUO-VIEW激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63×物镜进行共聚焦显微镜检查。
(7)蛋白质印迹
进行免疫印迹分析。简而言之，用RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific)裂解L8057细胞和稳定表达EGFP-PD1的L8057细胞。然后，用12％SDS-PAGE对细胞裂解物进行分离，用PD-1、CD41a、CD42a、p-选择素、GPVI和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析，然后用增强化学发光(ECL)检测(Thermo Scientific)。
(8)B16F10细胞结合测定
将B16F10细胞接种在共焦孔中。将表达EGFP-PD-1的血小板(～0.5×108)或用cy5.5标记的游离血小板(～0.5×108)加入培养基中，并与B16F10细胞孵育过夜。然后加入麦胚凝集素(WGA)、Alexa Fluor 594缀合物对B16F10细胞膜染色10分钟。然后，将细胞核用Hoechst染色10分钟。将细胞用PBS洗涤三次。在共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63×物镜进行共聚焦显微镜检查。
(9)胶原结合测定
将衍生自小鼠(Bio-Rad)的I/III型胶原在0.25％乙酸中重构至2.0mg ml的浓度。然后将200μl胶原溶液添加到96孔测定板的每个孔中，并在4℃下孵育过夜。在胶原结合研究之前，用2％BSA封闭板，并用PBS洗涤三次。对于胶原结合研究，将血小板用WGA AlexaFluor 594染色30分钟，然后用PBS洗涤三次。加入标记的血小板(～1×107)复制胶原涂层或非胶原涂层板。孵育30s后，将板洗涤三次。然后用100μl DMSO溶解保留的纳米粒，使用Tecan Infinite M200读取器进行荧光定量。
对于共焦成像，将胶原溶液添加到共焦孔中，并在4℃下孵育过夜。(～1×108)。用2％BSA封闭孔，并将WGA Alexa Fluor 594标记的血小板与胶原孵育2分钟，然后用PBS洗涤三次。在共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63×物镜进行共聚焦显微镜检查。
(10)聚集测定
用分光光度法评估血小板聚集。将PBS中的血小板负载到比色皿中。如所示将0.5IU-1凝血酶(Sigma Aldrich)添加到血小板中。将比色皿立即放置在Tecan InfiniteM200读取器中，并监测650nm时吸光度随时间的变化。对于共焦成像，将血小板用WGA AlexaFluor 594标记。然后将血小板负载到共焦孔中，并加入0.5IU-1的凝血酶30分钟。在共聚焦显微镜(Zeiss)上以顺序扫描模式用63×物镜进行共聚焦显微镜检查。
(11)药物负载和释放
为了将环磷酰胺负载到血小板中，将100μg纯化的血小板(～1×108)和100μg环磷酰胺轻轻混合在1ml PBS中，并在37℃下孵育2h。然后将血小板用PBS以12,000rpm离心洗涤三次。对于电穿孔休克法，在室温下将100μg纯化的血小板(～1×108)和100μg环磷酰胺轻轻混合在1ml电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾、pH 7.2，25mM氯化钾、21％Optiprep)中。使用微脉冲电穿孔器(美国Bio-Rad)，在0.4cm电穿孔杯中以300V和150μF对样品进行电穿孔。然后，将含有样品的电穿孔杯孵育30分钟，进行膜回收。然后将血小板用PBS以1,2000rpm离心洗涤3次。在PBS(pH7.2)中分析37℃下不同时间点(分别在1h、2h、4h、8h、24h和48h)血小板(100μg/mL)释放的环磷酰胺。使用Uv-vis分光光度计在最大k值202nm下分析释放的环磷酰胺的量。
(12)循环
用NHS-Cy5.5标记PD-1血小板和L8057细胞产生的游离血小板。然后将血小板用PBS洗涤3次。通过尾静脉分别向C57BL/6小鼠注射200μL标记的游离血小板(～2×108)或PD-1血小板(～2×108)。分别于注射后不同时间点(分别在2分钟、30分钟、1h、2h、4h、8h、24h和48h)从眼窝采集小鼠的血。然后测量血清的荧光。
(13)生物分布
在PBS缓冲液中用NHS-Cy5.5标记游离血小板和L8057细胞产生的PD-1血小板。在4℃下孵育过夜之后，用PBS洗涤Cy5.5标记的血小板三次。通过尾静脉向黑色素瘤荷瘤C57BL/6小鼠注射200μL Cy5.5标记的PD-1血小板(～2×108)。给对照组注射PBS。24h后，处死小鼠，并收获癌症和主要器官。最后，利用Xenogen IVIS光谱成像系统记录荧光成像结果和平均无线强度。
(14)体内抗肿瘤疗效研究。
将B16F10荧光素酶标记的B16F10(1×106)黑色素瘤细胞移植到C57BL/6小鼠右侧。肿瘤接种后八天，肿瘤体积达到约150mm3。然后切除这些肿瘤，留下约15mm3(10％)的肿瘤体积，以模拟手术床上残留的肿瘤。简单地说，将动物在诱导室中用异氟烷麻醉(高达5％用于诱导；1-3％用于维持)，并通过鼻锥维持麻醉。切除肿瘤区域并进行无菌准备。使用无菌器械去除约90％的肿瘤。将伤口用自动伤口闭合系统闭合。如所示将小鼠随机分为几组，每组八只(n＝8)。首先给小鼠静脉注射不同的治疗制剂：PBS、游离血小板(～2×108)、PD-1血小板(～2×108)、环磷酰胺(20mg/kg)、负载环磷酰胺的游离血小板(～2×108)或负载环磷酰胺的PD-1血小板(～2×108)。注射后，立即在10分钟内对一个接一个的小鼠进行手术。通过癌细胞的生物发光监测肿瘤负荷。在成像前，用脱毛膏对小鼠进行修剪和刮毛。使用IVIS Lumina成像系统(Perkin Elmer)拍摄图像。用数字卡尺测量肿瘤大小。按(长径×短径2)/2计算肿瘤体积(mm3)。当出现健康受损的迹象或肿瘤体积超过2cm3时，对动物实施安乐死。
(15)组织免疫荧光测定。
将肿瘤从小鼠体内解剖出并在最佳切割介质(O.C.T.)中速冻。将若干微米切片用冷冻切片机切割并安装在载玻片上。将冰冻肿瘤切片在PBS中孵育15分钟，去除包埋介质。用含3％BSA的缓冲液封闭标本。随后，将标本用CD4和CD8一级抗体(在3％BSA中1:50)孵育过夜，然后用PBS洗涤三次，每次5分钟。然后将标本在室温下、黑暗中用在3％BSA中稀释的TRITC二级抗体(KPL)孵育1h。最后，将细胞核用DAPI染色，将组织用PBS洗涤三次，每次5分钟。共聚焦显微镜使用40倍物镜在FLUO-VIEW激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)上以连续扫描模式执行。
(16)统计分析。
如图所示，所有结果均表示为平均值±标准偏差，或平均值±标准误差。除非另有说明，否则所有实验中都使用生物平行测定。当两组以上进行比较(多重比较)时，采用单因素或双因素方差分析(ANOVA)和图基事后检验。通过对数秩检验确定生存益处。所有统计分析都使用IBM SPSS统计19执行。统计显著性的阈值为P<0.05。
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