动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及动员后造血干细胞血浆外泌体制备方法及其应用。
背景技术
目前，促进造血损伤修复主要通过两种方式进行：1)造血生长因子：粒细胞集落刺激因子、巨核细胞生长因子、促红细胞生成素、促血小板生成素等，这些促造血生长因子的作用主要是促进骨髓内造血细胞的增生，恢复正常造血，但对于严重辐射损伤导致的造血抑制，则难以发挥促造血恢复的作用；2)造血干细胞移植：造血干细胞能够向下分化为各种成熟血细胞及免疫细胞，如红细胞，血小板，淋巴细胞等，在受者体内完全重建整个造血系统，因此造血干细胞移植为各类血液系统的恶性病和免疫及基因异常的疾病提供了可能的治疗方法。目前，异基因造血干细胞移植是公认的治疗恶性血液病的最有效手段之一，其细胞来源主要有三个途径，即骨髓，外周血和脐血。通过药物动员将骨髓中的干细胞释放到外周血中，再通过单采分离的方法将外周血中的造血干细胞富集提取，是一种便于采集，侵入性小并且可短期多次获取细胞的方法。目前，动员后的外周血已经逐渐取代骨髓造血干细胞，成为异基因造血干细胞移植首选的细胞来源，然而相当一部分需要进行移植的患者仍然缺乏人白细胞抗原(HLA)相合的供者，HLA配型是限制异基因造血干细胞移植发展的最大阻碍。虽然半相合移植方案也已相对成熟，但移植后的移植物抗宿主病以及免疫抑制后的各种感染发病率高及严重性高，是制约移植技术发展的重要因素。
微泡(microvesicles，MV)是细胞分泌的亚微米双层膜结构，微泡可由多种细胞分泌，并广泛分布于血浆、唾液、乳汁、汗液等各种体液中，含有母体细胞的蛋白质、脂质、mRNA以及microRNA等成分，通过与其它细胞融合，将其内容物释放到靶细胞，影响其功能，从而在不同细胞间信息传递过程中发挥重要作用。微泡随着细胞的来源、数量、大小和抗原成分的变化而不同。循环中的微泡大多数来自血小板，少部分来自其他血细胞和内皮细胞等，分泌的微泡既可储留在母细胞附近的组织液内，也可随体液循环到达远处，随细胞的起源、数量、大小、细胞状态及刺激条件的不同，细胞分泌的微泡具有异质性，根据形成机理和物理特性将微泡分为两群：外泌体和微粒。外泌体是目前定义最明确的微泡，直径在20nm-100nm之间，密度在1.13～1.19g/ml之间，它的分泌依赖细胞骨架激活和P53蛋白调控的胞吐方式，不依赖细胞内的钙离子浓度，起源于内涵体，先储存在由单层膜构成的多囊体内，当与细胞膜融合时分泌。
微泡的提取方法多种多样：超速离心法，目前提取微泡应用最广泛的技术手段，线性蔗糖梯度离心法也应用于分离微泡，但是这两种方法都比较耗时。免疫磁珠分离法比较简单快速，但是由于提取的微泡功能不完全及抗体的应用会造成分析偏差，限制了进行后续的功能研究实验。过滤法与超速离心法结合法能获得更多的微泡量，且简便、耗时短，但是依旧存在提取纯度不足问题。色谱法提取的微泡量进一步增加，且纯度高，但对提取设备要求高。当前主要是利用微泡的提取方法为将采集的造血干细胞提取单个核细胞在体外进行培养，从培养上清液中提取外泌体，主要缺点如下：培养过程长、有细胞死亡并释放内容物的问题；培养条件并非适于干细胞和免疫细胞同时生长的，因此造成上清中所含外泌体和采集物中外泌体之间的差异；培养细胞量少，提取外泌体量不足以应用所需；培养后细胞不能再次使用，造成浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、简便的从动员后外周血造血干细胞采集物中提取出高浓度外泌体及其应用价值，造血干细胞外泌体能够促进放化疗后造血损伤的修复和/或外周血单个核细胞增殖，并且避免了外周血造血干细胞输注后植入所带来的移植物抗宿主病风险。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种外泌体的提取方法。
本发明所提供的外泌体的提取方法，包括采用动员剂对外周血造血干细胞进行动员的步骤。
上述提取方法中，所述动员剂可为重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
上述提取方法中，所述动员的时间可为4-5天，如4.5天。
上述提取方法还可包括收集动员后的外周血造血干细胞得到外周血造血干细胞采集物，将所述外周血造血干细胞采集物22℃放置3小时，以使外周血造血干细胞采集物中的外泌体分泌到血浆。
上述提取方法还可包括对放置后的外周血造血干细胞采集物进行离心，收集血浆，从所述血浆中收集得到外泌体，该外泌体为外周血造血干细胞采集物血浆外泌体。
上述提取方法，所述对放置后的外周血造血干细胞采集物进行离心，收集血浆，从所述血浆中收集得到外泌体可为：
1)将放置后的外周血造血干细胞采集物在22℃以400g离心15min，得到血浆转移至离心管(第一批离心管)中，4℃300g水平离心10min，留取上清弃沉淀；
2)将步骤1)的上清缓慢加入离心管中，PBS缓冲液配平，4℃水平离心2000g离心10min，留取上清弃沉淀；
3)将步骤2)的上清转移至另外新的离心管(第二批离心管)中，PBS缓冲液配平，4℃水平离心10000g离心30min，留取上清弃沉淀；
4)将步骤3)的上清转移至另外新的专用离心管(第三批离心管)中，PBS缓冲液配平，4℃水平离心100000g离心2h，留取沉淀弃上清；所述沉淀即为外周血造血干细胞采集物血浆外泌体。
上述提取方法，还包括用PBS缓冲液轻柔重悬步骤4)的沉淀，放入4℃冰箱中备用的步骤。
上述提取方法还包括将放置后的外周血造血干细胞采集物在22℃以400g离心15min，抽取部分血浆备用后，余外周血造血干细胞采集物根据临床需求回输给患者或冻存。
上述提取方法获得的外泌体也在本发明的保护范围之内。
为解决上述技术问题，本发明进一步提供了一种外泌体制剂。
本发明所提供的外泌体制剂包括：外周血造血干细胞采集物血浆外泌体及医学上可接受的溶剂；所述外周血造血干细胞采集物血浆外泌体为按照上述提取方法获得的外泌体。
在本发明中，所述溶剂可为PBS缓冲液。如所述外泌体制剂由上述外泌体和PBS缓冲液组成。
在本发明中，所述外泌体制剂可以用于自体、同种异体、异体的个体。
为解决上述技术问题，本发明进一步还提供了上述提取方法获得的外泌体或上述外泌体制剂的用途：
上述提取方法获得的外泌体或上述外泌体制剂在制备促进造血损伤的恢复的药物组合物中的用途；
和/或，上述提取方法获得的外泌体或上述外泌体制剂在制备促进外周血单个核细胞增殖的药物组合物中的用途。
上述用途中，所述造血损伤是各种原因引起的造血功能受损，例如辐射、放疗或化疗(骨髓移植)引起的造血功能受损。
上述用途中，外泌体受者为未进行移植物抗宿主病的预防和/或治疗的人。
本发明将取自经过外周血造血干细胞动员剂处理的人的外周血利用血细胞分离机进行外周血造血干细胞的采集，得到外周血造血干细胞采集物，从外周血造血干细胞采集物收集血浆，从血浆中提取外泌体，提取方法简单，易于操作，且得到的外泌体浓度高、质量好。血浆是废弃物，从中提取外泌体能够增加其可用性，且不影响外周血造血干细胞采集物其他组分的使用。将本发明获得的外周血造血干细胞采集物血浆外泌体输注造血损伤的机体内，能促进造血损伤恢复，避免了外周血造血干细胞输注后植入所带来的并发症风险，且外泌体能够发挥母体细胞作用，避免母体细胞的不良反应，另外，体外实验证实本发明获得的外周血造血干细胞采集物血浆外泌体促进外周血单个核细胞增殖的作用。
附图说明
图1中A和B均为人外周血造血干细胞采集物血浆外泌体的透射电镜结果。
图2为Micro-BCA蛋白分析标准曲线。
图3为外周血造血干细胞采集物血浆外泌体促进放疗后造血损伤快速恢复试验的流程图。
图4为小鼠外周血造血干细胞采集物血浆外泌体的透射电镜结果。
图5为辐射小鼠输注造血干细胞外泌体后白细胞、血红蛋白和血小板变化。
图6为造血干细细胞生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明下述实施例中用到的PBS缓冲液的配制方法如下：
称取氯化钠4g，磷酸二氢钠0.71g，氯化钾0.1g，磷酸二氢钾0.135g，加入400毫升蒸馏水溶解，滴加氯化氢调节pH为7.4，定容到500毫升，高压灭菌，4℃冰箱保存。
实施例1外周血造血干细胞采集物血浆外泌体的提取
1.供者外周血造血干细胞采集物的获得
采用人健康供者捐献的外周血造血干细胞采集物，作为研究对象。给予人健康供者rhG-CSF 5ug/(kg.d)q 12h皮下注射4.5天(即每12小时皮下注射1次rhG-CSF，每次剂量为rhG-CSF 5ug/kg体重，连续给药4.5天)进行动员外周血造血干细胞，于第5天采集外周血，对外周血采用血细胞分离机(购自德国费森尤斯，型号为Amicus)进行外周血造血干细胞的采集(采集参数根据血细胞分离机推荐采集干细胞程序设置)，一般循环全血量为10000ml，得到200-300mL的外周血造血干细胞采集物。
2.收集外周血造血干细胞采集物的富外泌体血浆成分
1)将步骤1采集的外周血造血干细胞采集物22℃放置3小时，以使外周血造血干细胞采集物中的外泌体分泌到血浆中。
2)放置后的外周血造血干细胞采集物放入低速离心机22℃以400g离心15min，分离出血浆，注射器抽取5-10毫升血浆备用，余外周血造血干细胞采集物根据临床需求回输给患者或冻存。
3.外周血造血干细胞采集物血浆外泌体的分离
1)将步骤2的血浆转移至15ml离心管中，4℃300g水平离心10min，留取上清弃沉淀。
2)将步骤1)的上清缓慢加入专用离心管(第一批离心管)中，PBS缓冲液配平(误差在0.05g内)，置入超速离心机(赛默飞公司，型号为Thermofisher WX100+)中4℃水平离心2000g离心10min，留取上清弃沉淀。
3)将步骤2)的上清转移至另外新的专用离心管(第二批离心管)中，PBS缓冲液配平，超速离心机中4℃水平离心10000g离心30min，留取上清弃沉淀。
4)将步骤3)的上清转移至另外新的专用离心管(第三批离心管)中，PBS缓冲液配平，超速离心机中4℃水平离心100000g离心2h，留取沉淀弃上清。
5)用100ul PBS缓冲液轻柔重悬步骤4)的沉淀，放入4℃冰箱中备用，即得外周血造血干细胞采集物血浆外泌体。
4.应用透射电镜鉴定外周血造血干细胞采集物血浆外泌体
1)微量移液器吸取10ul步骤3中得到的外周血造血干细胞采集物血浆外泌体至铜网状栅中上，静置5min。
2)沿铜网的边缘用滤纸轻柔将水吸干。
3)向铜网状栅中上加20ul的2％磷钨酸钠进行负染，室温放置5min。
4)沿铜网的边缘用滤纸轻柔吸干水分。
5)白炽灯轻柔地烤干铜网。
6)将处理好的铜网状栅放入电镜中，调整电镜，进行观察。
外周血造血干细胞采集物血浆外泌体透射电镜结果如图1中A和B所示：外周血造血干细胞采集物血浆外泌体形态呈类圆形，大小不均一，直径在100nm左右。
5.外周血造血干细胞采集物血浆外泌体的定量检测
应用Micro-BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher，美国，货号23235)进行检测，具体步骤如下
1)打开水浴箱，设定温度为37℃，取一个泡沫箱，加入一定液氮。
2)取出30ul外泌体放入一EP管中，用止血掐夹住EP管上端，将盛装液体部分浸入液氮，使其迅速冻结，快速取出放于水浴箱中，轻轻晃动使液体融化。重复上述步骤，反复冻融5-7次，将外泌体充分裂解，制作成待检测外泌体样品。
3)按照A液：B液：C液于25:24:1的比例配置工作液(MR)/标品。
4)取96孔板，空出最边缘一圈的孔，以防读数时造成误差。选取两排，1排标记1-7号孔，2排标记1-2号孔。向1排1号孔中加入150μL已配置好的标品，浓度为40μg/mL，2-7号孔中加入150μL PBS缓冲液。
5)向1排2号孔中加入150ul标品如上，从3号至6号孔用倍比稀释法加入待检测外泌体样品。剩余的一个孔中间加入150μL的PBS缓冲液。
6)将裂解好的外泌体用PBS缓冲液稀释100倍，终体积为300ul。向2排1-2号孔中各加入150μL待检测外泌体样本。
7)向各孔中均加入150μL配置好的工作液，放入37℃培养箱中避光孵育2h。
8)2h后将96孔板放入酶标仪中，调整激光波长562nm，读取吸光度值。
由标品的浓度与吸光度OD值绘制浓度-OD值的标准曲线，获得线性公式，再根据R2值判断此次标准曲线的拟合度与可靠性，一般认为R2值高于0.99时，拟合度与可靠性都较好。结果如图2所示，根据样本孔测出的OD值，代入公式计算外泌体中蛋白浓度。每份造血干细胞采集物血浆外泌体浓度约为1mg/ml。计算所得平均每ml血浆中获取外泌体1000μg。
实施例2外周血造血干细胞采集物外泌体促进放疗后造血损伤快速恢复
外周血造血干细胞采集物外泌体促进放疗后造血损伤快速恢复的方法如图3所示，具体步骤如下：
1、给予健康的雄性C57小鼠(6～8W龄，SPF级，购自北京维通利华动物技术有限公司)皮下注射G-CSF(购自北京双鹭药业有限公司，货号87189190000087272782)5ug/(kg.d)q 12h皮下注射4.5天(即每12小时皮下注射1次G-CSF，每次剂量为G-CSF 5ug/kg体重，连续给药4.5天)进行动员，制作脾细胞悬液(即小鼠外周血造血干细胞采集物)，以模拟实施例1的人动员后获得人外周血造血干细胞采集物的方法，具体方法为：动员5天后处死小鼠，于75％乙醇中浸泡3分钟。用消毒后的剪刀和镊子将小鼠左下腹剖开，取出脾脏；在RPMI-1640培养液(Gibico公司，货号C11875500BT)中，用2毫升注射器内芯与400目筛网轻轻研磨脾脏，研磨后用RPMI-1640培养液冲洗筛网，并用筛网再次过滤得到细胞悬液；在50毫升corning尖底离心管中加入sigma细胞分离液(购自Histopaque，货号为1083)15毫升，用移液器小心在分离液面上加入上述细胞悬液15毫升，保证界面清晰；于水平离心机20℃400g离心20分钟(缓慢加速，缓慢减速)；离心完成后，轻拿轻放，用移液器小心吸出中间白色细胞层。加入10倍体积PBS缓冲液溶液洗一遍，400g离心5分钟，离心后去掉上清液，加入3倍体积红细胞裂解液(购自BD公司，货号为349202)，小心混匀；静置5分钟后加入PBS缓冲液至40毫升，400g离心5分钟，去上清；PBS缓冲液30毫升洗两遍，400g离心5分钟，去上清得细胞悬液，台盼蓝计数活细胞数，并用50um细胞筛过滤细胞悬液，调整细胞浓度至1×108个/L，得到脾细胞悬液(即小鼠外周血造血干细胞采集物)，相当于实施例1中人外周血造血干细胞采集物)。将小鼠外周血造血干细胞采集物置PBS缓冲液中37℃孵育4小时，离心取上清液按照实施例1中步骤3的方法分离获得小鼠外周血造血干细胞采集物外泌体，经实施例1中步骤4所述的应用透射电镜鉴定小鼠外周血造血干细胞采集物外泌体的方法观察小鼠外周血造血干细胞采集物外泌体形态如图4所示，结果显示应用此方法能够制备出外泌体，直径约50-100nm。
2、将24只体重为20g的雌性CB6F1小鼠(6～8W龄，SPF级，购自北京维通利华动物技术有限公司)分为三组，即移植组、外泌体组和G-CSF组，每组8只。三组小鼠经过8Gy全身照射(TBI)建立小鼠辐射造血损伤模型(以下简称为辐射损伤小鼠)。造模成功后，移植组小鼠经尾静脉输注步骤1得到小鼠外周血造血干细胞采集物，每只的剂量为3×107个脾细胞，外泌体组小鼠经尾静脉输注步骤1得到的小鼠外周血造血干细胞采集物外泌体，溶剂为PBS缓冲液，每只的剂量为3×107个脾细胞提取的外泌体总量，G-CSF组小鼠经尾静脉注射等体积的PBS缓冲液，皮下注射G-CSF，观察三组辐射损伤小鼠的造血恢复情况、供者细胞嵌合体检测(PCR方法检测Y染色体sry基因)及有无移植物抗宿主病表现。
对辐射损伤小鼠造血恢复的影响结果如图5所示，图5中分别给出了三组辐射损伤小鼠的白细胞(图中以“WBC”表示)、血红蛋白(图中以“Hb”表示)和血小板(图中以“PLT”表示)变化，相比单纯应用刺激因子恢复造血的G-CSF组(图中以“G-CSF”表示)，外泌体组(图中以“G-CSF-MV+G-CSF”表示)能够升高辐射损伤小鼠的白细胞、血红蛋白、血小板的最低值，加快造血恢复速度。移植组(图中以“TBI”表示)虽然也能够快速恢复造血，但因供鼠细胞完全植入，出现移植物抗宿主病。外泌体组则能够快速恢复造血且未观察到移植物抗宿主病等不良反应。
实施例3外周血造血干细胞采集物血浆外泌体促进外周血单个核细胞增殖
体外实验验证外周血造血干细胞采集物血浆外泌体是否对外周血单个核细胞有促进增殖的作用，具体步骤如下：
给予人健康供者rhG-CSF 5ug/(kg.d)q 12h皮下注射4.5天(即每12小时皮下注射1次rhG-CSF，每次剂量为rhG-CSF 5ug/kg体重，连续给药4.5天)进行动员外周血造血干细胞，于第5天采用血细胞分离机分离外周血造血干细胞采集物，循环全血量为10L。取分离造血干细胞采集物1mL经人淋巴细胞分离液(购自ficoll，GE公司，货号17-1440-02-1)分离出外周血单个核细胞，清洗并重悬于2ml PBS中，得到单个核细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，分为两组，即外泌体组和对照组，接种于24孔培养板中，每组3个复孔，每孔加入1ml单个核细胞悬液和10mg外泌体，对照组加入等体积的PBS，培养条件为37℃，5％CO2，95％湿度孵育，每隔两个小时测定一次每组的外周血造血干细胞单个核细胞数。
结果如图6所示，外泌体组(图中以“MV”表示)的细胞数量随共培养的时间延长而增加，共培养2d时外泌体组细胞数是对照组(图中以“CC”表示)的1.5倍(P>0.05)；共培养4d时外泌体组细胞数是对照组细胞数的2.2倍(P<0.05)，共培养6d时外泌体组细胞是对照组细胞数的2.4倍(P<0.05)，说明外周血造血干细胞采集物血浆外泌体有明显的促进外周血单个核细胞扩增的作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
