一种抗肝纤维化的化合物、制剂、制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是涉及到一种抗肝纤维化的化合物、制剂、制备方法和用途。
背景技术
肝纤维化是各种致病因素引起肝脏细胞外基质(ECM)弥漫性过多沉积的过程，是多数慢性肝脏疾病共有的病理途径。肝纤维化进一步发展可引起肝硬化，甚至可能进一步引起肝细胞癌。研究证实肝纤维化是可以逆转的，目前临床上还没有发现明确抗肝纤维化的治疗药物，因此寻找能够有效逆转肝纤维化的治疗药物具有重要的临床意义。自分泌运动因子(autotaxin,ATX)是一种分泌型糖蛋白，具有磷酸二酯酶和溶血磷脂酶D活性，临床病例报告发现，血清中ATX与肝纤维化程度呈正相关，临床研究也发现，病毒性感染(HBV和HCV) 患者血清ATX水平升高者，肝硬化和肝癌发病率升高；初步机制研究发现，ATX活性产物 LPA可激活肝星状细胞，促进胶原分泌。因此，ATX也被认为是肝纤维化的有效血清标志物，同时也是研发抗肝纤维化药物的靶点。
自分泌运动因子抑制剂的研究进展，迟雨萌等，中南药学2016年9月第14卷第9期，介绍了多种ATX抑制剂，1、脂肪醇磷脂酸结构的ATX抑制剂，包括基于肠素(darmstoff)、环磷脂酸(cPA)、α-卤代亚甲基膦酸、烷基芳香亚甲基膦酸以及酪氨酸骨架结构的抑制剂，这类抑制剂均由1个富电子的极性磷酸部分和1个疏水链组成；2、小分子ATX抑制剂，包括具有长直链或柔性结构的ATX抑制剂、刚性结构分子的ATX抑制剂和金属离子螯合分子 ATX抑制剂；3、其他结构的ATX抑制剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种抗肝纤维化的化合物、制剂、制备方法和用途，本发明药物可明显改善肝纤维化，使肝功能指标得到改善，减少胶原等细胞外基质在细胞外间质堆积，减轻肝纤维化程度，抑制肝纤维化的形成和发展。
本发明的内容包括一种抗肝纤维化的化合物，名称为2-({5-[1-(4-氯苯氧基)乙基]-4- 苯基-4H-1,2,4-三唑-3-基}硫基)-N-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-基)乙酰胺，结构式如下：
本发明提供一种抗肝纤维化的制剂，包括有抗肝纤维化的化合物，剂型为片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬和软明胶胶囊、溶液剂、乳剂、混悬剂、鼻喷雾剂、栓剂、软膏、凝胶剂或注射剂。
本发明的抗肝纤维化的制剂，可以是抗肝纤维化的化合物的药用盐，也可以用作药物制剂的形式。药物制剂可以以下列方式内部给药：如经口(例如以片剂，包衣片剂，糖衣丸，硬和软明胶胶囊，溶液剂，乳剂或混悬剂的形式)，经鼻(例如以鼻喷雾的形式)或经直肠(例如以栓剂的形式)或局部经眼部(例如以溶液，软膏，凝胶或水溶性聚合物插入物的形式)。给药也可以在肠胃外实现，如肌肉内、静脉内或眼内(例如以无菌注射液的形式)。
抗肝纤维化的制剂可以用药物惰性的、无机或有机辅料处理，用于制备片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬明胶胶囊、注射液或局部制剂。例如可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等作为这样的用于片剂、糖衣丸和硬明胶胶囊的辅料。
合适的用于软明胶胶囊的辅料是例如植物油、蜡、脂肪、半固体物质和液体多元醇等。合适的用于制备溶液剂和糖浆剂的辅料是例如水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖等。合适的用于注射液的辅料是例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。合适的用于栓剂的辅料是例如天然或硬化油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。合适的用于局部眼部制剂的辅料是例如环糊精、甘露醇或本领域中已知的许多其他载体和赋形剂。此外，药物制剂可以含有防腐剂、增溶剂、增粘物质、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、香料、用于调节渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂或抗氧化剂；它们还可以含有其它有治疗价值的物质。
本发明提供一种抗肝纤维化的化合物的制备方法，包括如下步骤：
将4-氯乙酰氨基安替比林、5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇和碳酸钾加入到丙酮中，回流，过滤，滤液蒸发至干燥，残渣重结晶，得到抗肝纤维化的化合物。
所述4-氯乙酰氨基安替比林的制备方法为，将氯乙酰氯和三乙胺加入到含有4-氨基安替比林的二氯甲烷溶液中，在室温下搅拌；然后向溶液中加入冰水萃取，取有机层，将有机层先用盐酸溶液洗涤，再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后再用盐水洗涤；干燥后，除去溶剂，得到粗产物；将粗产物重结晶，得到4-氯乙酰氨基安替比林。
所述5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇的制备方法为，将2-(2- (4-氯苯氧基)丙酰基)-N-苯基肼硫代甲酰胺溶解于氢氧化钠溶液中，加热回流，冷却，调 pH值至2-3，过滤，干燥后得到5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇。
所述2-(2-(4-氯苯氧基)丙酰基)-N-苯基肼硫代甲酰胺的制备方法为，将2-(4-氯苯氧基)丙酰肼和异硫氰酸苯酯加入在无水乙醇中，回流，将混合物冷却至室温，然后过滤，浓缩滤液，得到2-(2-(4-氯苯氧基)丙酰基)-N-苯基肼硫代甲酰胺。
所述2-(4-氯苯氧基)丙酰肼的制备方法为，将2-(4-氯苯氧基)丙酸酯溶于乙醇中，然后加入肼的水溶液；然后将混合物在回流下搅拌，真空浓缩，洗涤，得到2-(4-氯苯氧基) 丙酰肼。
所述2-(4-氯苯氧基)丙酸酯的制备方法为，将2-(4-氯苯氧基)丙酸溶于甲醇中，然后缓慢加入98％的浓硫酸；在回流下搅拌，冷却至室温后，真空浓缩，并将残余物溶解在二氯甲烷中，洗涤，干燥，除去溶剂，得到2-(4-氯苯氧基)丙酸酯。
具体的反应路线图如图6所示。
本发明提供一种抗肝纤维化的化合物在制备ATX抑制剂、抗肝纤维化制剂或者治疗肝癌药物方面的用途。抗肝纤维化的化合物在作为ATX抑制剂、抗肝纤维化制剂或者治疗肝癌药物时，剂量可以在宽范围内变化，并且当然将适合每种特定情况下的个体需求。通常，在经口给药的情况下，每kg体重为约0.1mg至20mg、优选每kg体重为约0.5mg至4mg(例如每人约300mg)的每日剂量，优选分成1-3个可以例如由相同量组成的单个剂量，这应当是适合的。在局部给药的情况中，制剂可以包含0.001重量％至15重量％的药物，并且所需剂量(可以为0.1-25mg)可以通过每天或每周单次剂量给药，或通过每天多次剂量(2至4)给药，或通过每周多次剂量给药。然而，将清楚的是，当明确指示时，可以超过本文给出的上限或下限。
本发明的有益效果是，本发明化合物为专门针对人体ATX酶的抑制剂，可以很好的对目标酶ATX起作用，通过抑制ATX来调节体内LPA水平，从而起到预防或治疗肝纤维化的作用，通过免疫荧光的检测确定本发明化合物的IC50值为43.05μM，通过图3-5表明本化合物具有更好的抗肝纤维化的效果。
本发明为ATX抑制剂，可以通过抑制溶血溶血磷脂酶D的活性，抑制其以溶血磷脂酰胆碱(LPC)为底物催化生成溶血磷脂酸LPA，可以作为LPA水平和相关信号传导的调节剂，本发明化合物为ATX的特异性的的抑制剂，可以通过抑制ATX的活性起到抑制肝纤维的发生或进一步加重，具有良好的临床应用前景。
本发明化合物通过小鼠抗纤维化药效试验，本发明化合物可以很好的改善小鼠的肝纤维化，未来用于开发治疗肝纤维化的药物很有前景。
附图说明
图1为本化合物质谱图。
图2为本化合物的1H-NMR的图谱。
图3为单独采用CC14致小鼠肝损伤模型的小鼠肝脏组织切片天狼星红染色图。
图4为采用高剂量(30mg·kg-1·d-1)的本发明药物处理CC14致小鼠肝损伤模型的小鼠肝脏组织切片天狼星红染色图。
图5为采用低剂量(15mg·kg-1·d-1)的本发明药物处理CC14致小鼠肝损伤模型的小鼠肝脏组织切片天狼星红染色图。
图6为本发明的具体的反应路线图。
具体实施方式
实施例1制备工艺条件：
1. 2-(4-氯苯氧基)丙酸的制备(2)
将4-氯苯酚(12.80g，100.0mmol)溶解在150mL乙腈中，然后加入碳酸钾(41.40g，300.0mmol)。将混合物在50℃下搅拌30分钟，然后加入2-溴丙酸(15.20g，100.0mmol)。将混合物在回流下搅拌过夜。冷却至室温后，混合物为过滤，滤液真空浓缩。将残余物加入水中，并用1N HCl调节pH＝3，用DCM(3×100mL)萃取所得混合物。有机层是用盐水(100mL) 洗涤，用MgSO4干燥，然后真空浓缩，得到17.10g无色油。收率为85％。
2. 2-(4-氯苯氧基)丙酸甲酯的制备(3)
将2-(4-氯苯氧基)丙酸溶于150mL甲醇中，然后缓慢加入10ml浓硫酸(98wt％)。然后将混合物在回流下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物真空浓缩，并将残余物溶解在DCM，并用水(3×100mL)洗涤残余物再用，饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤，再用盐水(100 毫升)洗涤。用MgSO4进行干燥后，除去溶剂，得到17.30g无色油状物，无需进一步纯化即可用于下一步。收率为95％。
3. 2-(4-氯苯氧基)丙酰肼(4)的制备
将2-(4-氯苯氧基)丙酸酯溶于150mL乙醇中，然后加入15mL肼的水溶液(浓度80wt％，在水中)。然后将混合物在回流下搅拌3小时。然后将混合物真空浓缩，残余物用乙醇洗涤。得到的干燥白色固体，得到13.05g 2-(4-氯苯氧基)丙酰肼。收率为75％。
4. 2-(2-(4-氯苯氧基)丙酰基)-N-苯基肼硫代甲酰胺(5)的制备
将2-(4-氯苯氧基)丙酰肼(13.05g，60.9mmol)和异硫氰酸苯酯(8.22g，60.9mmol)放在120mL无水乙醇中，在蒸汽浴上回流5小时。将混合物冷却至室温，然后过滤。浓缩滤液，得到18.15g浅棕色油状物，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
5. 5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇(6)的制备将18.15克2-(2-(4-氯苯氧基)丙酰基)-N-苯基肼硫代甲酰胺溶解于100ml 2N氢氧化钠溶液中，加热回流3小时。冷却，用1N HCl并酸化至pH2-3，过滤收集白色固体。干燥后得到 13.80g白色固体。收率为76％。
6. 2-氯-N-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-基)乙酰胺的制备(8)
将氯乙酰氯(9.04g，80mmol)和三乙胺(8.08g，80mmol)加入到150mL含有4-氨基安替比林(16.24g，80mmol)DCM溶液中，在室温下搅拌过夜。然后向溶液中加入一定体积的冰水萃取，取有机层，将有机层先用1N HCl溶液(3×100mL)洗涤，再用饱和NaHCO3水溶液(100mL)洗涤，然后再用盐水(100mL)洗涤。用MgSO4干燥后，除去溶剂，得到25.15g 绿色固体。将粗产物用DCM/MTBE重结晶，得到13.83g白色固体。收率为62％。
7.制备2-((5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫代)-N-(1,5- 二甲基-3)氧代-2-苯基-2,3-二氢-1H-吡唑-4-基)乙酰胺(9)
将4-氯乙酰氨基安替比林(8.42g，30.2mmol)，5-(1-(4-氯苯氧基)乙基)-4-苯基-4H-1,2,4- 三唑-3-硫醇(10.00g，30.2mmol)的混合物与无水碳酸钾(8.33g，60.4mmol)一起加入到150mL 丙酮中的，回流4小时，过滤，滤液蒸发至干燥。残渣用MeOH/MTBE重结晶，得到7.05g 白色固体。收率为40％。
如图1-2所示，图1为本化合物质谱图，图2为本化合物的1H-NMR的图谱。
核磁图谱数据为1H-NMR(400MHz，DMSO-d6):δ＝1.58(3H,d,J＝6.0Hz),2.07(3H,s), 3.04(3H,s),4.10(2H,s),5.54(1H,q),6.76(3H,d,J＝8.8Hz),7.24(3H,d,J＝9.2Hz),7.23–7.53 (10H,m),9.48(1H,s)。
实验例1人ATX酶抑制测定
1、使用特别标记的底物Amplex Red试剂，通过荧光猝灭测定，测量ATX抑制，此试剂通过购买试剂盒获得。
2、测定工作溶液按如下制备：
2.1测定缓冲液(50mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01％Triton-X-100、pH8.0；
2.2 ATX溶液：ATX(来自Sino Biological的小鼠ATX-β)储备溶液(48nM，用测定缓冲液稀释)，测定时用测定缓冲液中稀释至2nM最终浓度；
2.3 LPC底物溶液：称取LPC(16:0)底物固体，测定缓冲液中稀释至250nM最终浓度。
2.4检测方法：使用Amplex Red试剂盒检测ATX，每个反应含有50μM Amplex Red试剂，1U/mL HRP，0.1U/mL胆碱氧化酶，250nM LPC和用1X反应缓冲液稀释的ATX的量，将反应在37℃下孵育1小时。使用荧光酶标仪测定荧光值，激发波长为530±12.5nm，发射波长为590±17.5nm。
2.5将本发明化合物用DMSO稀释成10mM、8mM、6.4mM、5.12mM、4.10mM、3.28mM、2.62mM、2.10mM、1.68mM、1.34mM、1.07mM的一系列溶液，分别加入2μL至2.4的试剂盒溶液中，按2.4的方法测定加入本化合物后荧光值得变化，且从这些数据计算本化合物的IC50值为43.05μM。
实施例2药效实验研究
1、实验材料与动物
1.1药物和试剂：谷丙转氨酶测定试剂盒(R1、R2)(MIVDRAY试剂盒)、谷草转氨酶测定试剂盒R1、R2)(MIVDRAY试剂盒)，四氯化碳(分析纯)，临用前用菜籽油配制成20％的菜籽油溶液。
1.2实验动物：清洁级昆明小鼠，体重18-22g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.3实验仪器：MIVDRAY BS-380型全自动生化分析仪，EX 125DZH型电子分析天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)，HC30L8R型高速冷含冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。
1.4受试药物及处理方法：取实施例1制条得到的化合物，高剂量组用5％吐温80(用 0.01mol/L PBS稀释)溶液稀释成1.5mg/ml的混悬液，低剂量组用5％吐温80(用0.01mol/L PBS 稀释)溶液稀释成0.75mg/ml的混悬液。
2、实验方法
2.1对CC14致小鼠肝纤维化的影响
2.1.1小鼠CCl4诱导肝纤维化损伤模型的建立，除正常组外，其余各组腹腔注射20％CC14菜籽油溶液(5μL/g体重)，每周注射两次。
2.2.2取ICR雄性小鼠48只，随机分成4组:正常组、模型组、高剂量组(30mg·kg-1·d-1)、低剂量组(15mg·kg-1·d-1)。
2.2.3正常组：不给药、不造模，正常饮食饮水；模型组：单独腹腔注射20％CC14菜籽油溶液；给药组(高、低)：除造模外，还应腹腔注射1.4项下配制的相应的试药溶液。本实验给药组为从造模的第14天开始给药，每天给药一次，一周给药6次，于造模的第34天对正常组、模型组及给药组进行眼眶取血并处死小鼠，造模时间总计33天，给药时间总计20天。取血后，以3000r/min离心10min，取上清液，按试剂盒操作方法测定CC14致肝损伤小鼠血清中 ALT、AST含量。取血后处死小鼠，迅速取下肝脏，将周围结缔组织剔除后放入4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片并进行天狼星红染色，在光学显微镜下观察肝组织胶原纤维情况。
3、实验结果
3.1、本化合物对小鼠肝功能的影响
本化合物对CC14致小鼠肝功能影响试验的血清指标的结果见下表
表1本化合物对小鼠肝功能影响试验的血清指标数据表
以上结果表明，四氯化碳造模组中的小鼠肝脏功能明显下降，血谷丙转氨酶和谷草转氨酶检测结果显示显著升高，本化合物可降低血清转氨酶水平，提示本化合物对肝功能有保护作用。
3.2、本化合物对CCL4诱导的小鼠肝组织形态学的影响
如图3-5所示，为模型组及不同剂量的本化合物对小鼠肝组织的染色图，模型组出现明显的网状纤维化。给药的高剂量组和低剂量组较模型组小鼠肝脏病理情况明显改善，肝纤维结缔组织增生明显减少。组织切片的金标准说明该化合物对小鼠的肝纤维化的形成具有确切预防效果。
