BRCA1/2突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体地，涉及一种BRCA1/2基因突变检测组合物、试剂盒及文库构建方法。
背景技术
乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。BRCA1/2是目前研究较为普遍与乳腺癌和卵巢癌发生有密切关联的两个易感基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。研究表明，约2％-6％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1/2 基因突变。BRCA1/2这两个基因的突变状态与家族性乳腺癌、卵巢癌的发病关系十分密切。与无突变者/普通人群相比，携带BRCA1/2基因突变的个体发展成为乳腺癌和卵巢癌的患病风险和复发风险均显著增加。携带有BRCA1/2基因突变的女性在其一生中最高有87％的可能性发生乳腺癌。BRCA1/2有害突变还可能增加患胰腺癌，胃癌，胆囊和胆管细胞癌，黑色素瘤和前列腺癌等其它风险。因此，对乳腺癌/卵巢癌高风险人群进行BRCA1/2基因检测很有必要。据乳腺癌信息中心(Breast CancerInformation Core,BIC)报道：BRCA1、BRCA2 的基因突变已达3000多种，这些突变分布于整个编码区。最常见的致病突变为移码突变、无义突变等，没有明显的突变热点。大多数突变导致截短蛋白的生成，使得BRCA1、BRCA2蛋白质正常功能的丧失，从而导致肿瘤发生。
携带有BRCA1/2基因致病突变的患者可使用PARP抑制剂杀死肿瘤细胞。阿斯利康的PARP抑制剂奥拉帕尼在美国、欧盟、中国澳门已上市。作为全球第一个口服的卵巢癌靶向抑制剂，铂敏感复发的BRCA1/2突变亚组卵巢癌人群维持治疗的PFS较复用安慰剂组可提高6.9个月。此外，目前还有不少于5种的类似PARP抑制剂也在积极研发当中。检测BRCA可指导含铂化疗方案的疗效：携带BRCA致病突变的上皮卵巢癌患者对铂类为基础的化疗反应显著优于非突变者。携带BRCA致病突变的患者可考虑进一步鉴别其一级亲属罹患卵巢癌(或乳腺癌)的风险，提前制定随访和预防策略。
传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1/2基因突变的主要检测手段。从检测灵敏度上讲，Sanger测序一般只能检测20％以上突变率的变异，对 BRCA1/2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样品检测费用也较高。另外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。随着高通量测序技术的普及，该技术被应用于越来越多的基因检测项目。常见的靶向高通量测序方法主要包括多重扩增子测序和杂交捕获测序。多重扩增子文库制备方法简单，时间短，成本低，但其扩增子长度限制了测序仪和测序试剂盒的选择，并且其还需要考虑引物的多重性(即PCR 的反应体系)以及引物的对数。
中国发明专利CN107267600A公开了一种多重扩增BRCA基因的方法，其需要26对引物即可以扩增全部外显子区域和部分内含子区域，但是其26对引物需要5个PCR反应体系，方法非常复杂且耗费时间，并且其样品起始量要求高，至少需要60ng DNA。发明专利WO2018036176A1虽然只需要两个PCR反应体系就能完成多重扩增BRCA基因，但是其一共需要117对引物，并且仅能覆盖内含子边界的10个碱基，方法非常复杂且引物成本很高，以及其样品起始量要求较高，需要20ng DNA。中国发明专利CN 110129414A采用多重扩增后连接接头测序，所述方法简单，但其采用单管中短片段多重扩增，其公布的特异性引物显示靶区域限定在BRCA1/2基因的部分外显子片段，不能覆盖 BRCA1/2基因分布的所有外显子编码区。
因此，本领域需求一种尽量少的PCR反应体系，尽量少的引物对数，覆盖全部外显子并尽量多的覆盖内含子并且样品起始量要求低的多重扩增BRCA基因的产品。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一方面在于提供一种BRCA1/2基因突变的检测的组合物，所述组合物包括：
如SEQ ID NO:1～92所示的寡核苷酸。
进一步地，所述组合物包括进一步包括根据测序接头设计的引物对。
上述根据测序接头设计(即，第二轮PCR扩增引物对)根据不同的测序平台可以由本领域技术人员按照本领域常规方法确定。
在一个具体的实施方案中，所述引物对为：p5引物序列 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATCT；p7引物序列 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGAC GTGTGCTCTTCCGATCT。其中，NNNNNNNN为序列标签，用来标记不同样品。
本发明的组合物一方面可用于构建BRCA基因文库，另一方面可用于检测 BRCA1/2基因的突变。
进一步地，SEQ ID NO:1～46所示的寡核苷酸用于检测BRCA2基因，SEQ ID NO:47～92所示的寡核苷酸用于检测BRCA1基因。
一方面，不同于通常的BRCA检测，本发明的组合所针对的区域至少涵盖 BRCA1/2基因的全部外显子和内含子边界的±20bp的区域。如“基于下一代测序技术的BRCA基因检测流程中国专家共识”(中华病理学杂志,2018,47(6):401-406.)和“基于下一代测序技术的BRCA1_2基因检测指南 (2019版)”(中华病理学杂志.2019,48(9):670-677.)所提及的，涵盖范围至少包括BRCA1/2基因的整个外显子编码区和外显子和内含子交界的±20bp的区域。使得突变检测更为完全、准确，灵敏度高。
另一方面，通过使用本发明的组合物，仅需2个PCR反应体系(即两管) 就能对扩增BRCA1/2基因的全部外显子和内含子边界的±20bp的区域，因此成本低，操作简单。
再一方面，第一轮PCR的高特异性保证了DNA模板的高效利用，第二轮 PCR提高文库序列浓度，因此，在使用本发明的组合物进行突变检测时，样品起始量仅需10ng。
第二方面，提供了一种使用本发明的组合物制备BRCA1/2基因突变检测的试剂盒的用途。
第三方面，本发明提供一种BRCA1/2基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括：如上所述的组合物。
进一步地，上述试剂盒中还具有提取所需试剂、扩增所需试剂以及测序所需试剂。
提取所需试剂是指从样品中提取所需核酸所需的试剂，例如商业化核酸提取试剂盒(可使用天根石蜡基因组DNA提取试剂盒，天根全血基因组DNA提取试剂盒等)。
扩增所需试剂包括第一轮PCR扩增所需的试剂，例如包括聚合酶、缓冲液、 dNTP等。
所述聚合酶优选为适合于长片段扩增的聚合酶，例如，FastStart High FidelityEnzyme热启动酶。
测序所需试剂包括片段化试剂、选择片段试剂、末端修复和加腺嘌呤试剂、接头连接试剂和第二轮PCR扩增所需试剂。
所述片段化试剂为可以将扩增产物(即扩增子)片段化的试剂，在一个具体实施方案中，所述片段化试剂为双链DNA片段化酶。
所述选择片段试剂为可以根据特定需求选择特定长度的片段的试剂，在一个具体实施方案中，所述选择片段试剂为磁珠。
末端修复和加腺嘌呤试剂包括：dNTP、T4 PNK、T4 DNA聚合酶、Klenow 片段等。
接头连接试剂包括接头和DNA连接酶。接头可以根据不同的测序平台而通过常规方法确定。在一个具体的实施方案中，接头序列为：正向接头为 GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC，反向接头为TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，在一个具体的实施方案中，DNA连接酶为T4连接酶。
第二轮PCR扩增所需试剂包括：缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、扩增所需引物对。在一个具体的实施方案中，扩增所需引物对为接头正向引物，例如， AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATCT；以及接头负向引物，例如 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGAC GTGTGCTCTTCCGATCT。
第四方面，本发明提供一种BRCA1/2基因文库的构建方法，所述方法包括：
1)使本发明的组合物或试剂盒扩增样品中的BRCA1/2基因，得到扩增子；
2)将所述扩增子片段化；
3)选择片段，并进行末端修复和加腺苷酸；
4)连接接头；以及
5)第二轮PCR扩增。
本发明的文库构建方法结合了多重PCR扩增和片段化连接建库方法，采用长片段扩增技术，既减少了捕获BRCA1/2基因全编码序列及邻近±20bp内含子区所需的引物数，降低多重PCR间的干扰，提高扩增效率，又避免了捕获探针设计的复杂过程和高额成本，缩短捕获时间。
检测所适用的样品不限制于外周血，可以是新鲜组织、唾液和FFPE切片等可获得人基因组DNA样品的材料均可。
在一个具体的实施方案中，步骤1)中的第一轮PCR扩增将上述组合物或试剂盒分两管进行，一管扩增BRCA1基因，另一管扩增BRCA2基因。
在一个具体的实施方案中，步骤2)中所述片段化可以为化学片段化，所述化学片段化为使用可以使DNA片段化的化学物质。在一个具体的实施方案中，所述化学片段化为酶切片段化，在一个具体的实施方案中，所述酶切片段化所用的酶为dsDNA片段化酶。
在一个具体的实施方案中，步骤2)中所述片段化可以为物理片段化，所述物理片段化为使用物理手段使DNA片段化。在一个具体的实施方案中，所述物理片段化为物理超声打断。
在一个具体的实施方案中，将文库片段化为主峰在300bp，范围在 200～400bp的片段。上述片段范围属最适测序长度，能更好的兼容不同长度的测序模式。
在一个具体的实施方案中，步骤3)中的选择片段可以通过调整磁珠液的用量进行，所述的磁珠来源没有特别限定，本领域常规市售产品均可。
在一个具体的实施方案中，所述磁珠选自Beckman Agencurt AMPure XP(规格450ml，No.A63882，购自Beckman公司)。
在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用dNTP、T4 PNK、T4 DNA 聚合酶、Klenow片段进行步骤3)中的末端修复和加腺嘌呤。
在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用接头和DNA连接酶进行步骤4)。
在一个具体的实施方案中，包括但不限于使用缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶、扩增所需引物对进行步骤5)。
第五方面，本发明提供了一种根据上述任一项所述的方法获得的BRCA基因文库。
进一步地，在建库完成之后，对文库进行测序，以进行突变检测。
在一个具体的实施方案中，测序为第二代测序。在一个具体的实施方案中，所述第二代测序的测序平台不限制于Illumina、ABI-SOLiD或Ion Torrent相关测序平台测序，测序试剂盒读长不限制于75cycles、150cycles，适用于目前上市的各类型读长测序试剂盒。
本发明后端采用打断连接建库方法能适应不同读长测序试剂盒。而常规的 PCR扩增建库，其选用的测序试剂盒读长必须不短于最长扩增子长度。本发明所述的方法所建文库有更好的测序平台和测序试剂盒的兼容性，也便于搭载其它文库进行测序，降低测序成本。
附图说明
图1为BRCA1基因编码区扩增子全覆盖示意图；
图2为BRCA2基因编码区扩增子全覆盖示意图；
图3为文库构建和样品检测的流程图；
图4为扩增片段打断后磁珠选择的片段大小分布图；
图5为文库片段分布质检结果图；
图6为各扩增片段平均深度分布图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、引物设计
针对BRCA1/2基因的全长进行多重引物设计，全部46对引物如表1所示。
表1、BRCA 1/2基因特异性扩增引物对
BRCA1和BRCA2基因编码区扩增子全覆盖如图1和图2所示。
实施例2、文库构建以及样品检测
整个文库构建和样品检测的流程如图3所示。
1、样品处理
使用商业化核酸提取试剂盒(可使用天根石蜡基因组DNA提取试剂盒，天根全血基因组DNA提取试剂盒等)提取DNA。
2、第一轮PCR
取样品不少于10ng(根据样品实际浓度确定取样体积)，均分为两等份分别加入到两管(G1、G2管)中，构成第一轮PCR试剂组分，盖好管盖。
第一轮PCR反应
其中，聚合酶混合物和引物混合物总体积为7.4μl，DNA模板量不少5ng，再加ddH2O至总体积为20μl。聚合酶混合物中含有dNTP、FastStart High Fidelity Enzyme热启动酶和反应所需的缓冲体系，热启动酶选购自Roche公司。多重 PCR扩增程序为：95℃，10m(分钟)；95℃，30s，60℃，1m，72℃，2m，25 个循环；72℃，4m。
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
3、合并和扩增子片段化
将两管(G1、G2)初始文库合并后用1.0X磁珠液(40μl)进行纯化，用 20μl ddH2O洗脱。取150ng纯化后的扩增产物，加入2μl的10*buffer V2试剂和1.5μl dsDNA片段化酶，并加ddH2O至总体积为20μl，在37℃条件下20m 进行酶切打断，反应结束后立即加入5μl 0.5M的EDTA终止酶切反应。
4、片段选择、末端修复和加A碱基
向上一步反应产物中加入0.7X(17.5μl)磁珠液，取上清加至1.8X磁珠液 (27.5μl)进行片段选择，用28μl ddH2O洗脱。经磁珠选择后的片段大小分布见图4。取23.5μl洗脱液，加入总量为4.1μl的末端修复和加A体系，反应体系包含组分如下：
上述末端修复和加A试剂均采购自Enzymatics公司，反应条件为：20℃， 30min；65℃，30min；4℃保存。
5、在DNA两端加上接头
在加A反应体系中添加20μl的2xRapid ligae、0.4μl的20μM DNA两端接头和T4DNA连接酶在产物两端加上接头，反应条件为；20℃，20min。
6、第二轮PCR扩增
在5所述的反应体系中加入1x磁珠液(50μl)进行纯化，80％乙醇洗涤后用38μlddH2O洗脱；取36μl加上接头的后的DNA样品库进行第二轮PCR扩增反应，扩增反应体系组分如下：
第二轮PCR反应
上述反应体系中的Pfx DNA polymerase采购自Invitrogen公司，PCR反应条件为：94℃，2m预变性；94℃，15s变性，60℃，30s退火，72℃，30s延伸， 13个循环；72℃，2m延伸。
使用1.0x磁珠液(50μl)对扩增产物进行纯化，22μl ddH2O洗脱后即获得样品BRCA高通量测序文库。
8、文库质检
使用QUBIT或QPCR检测文库的浓度，使用caliper或Agilent 2100进行片段分布检测，具体操作参见相关产品说明书。文库片段分布质检结果见图5。本实例提供的BRCA高通量测序文库的构建方法整体用时小于24小时。
9、采用二代测序技术检测BRCA1/2基因的突变
本实例使用Illumina测序仪NextSeq 500配套75cycles的测序试剂盒进行测序。根据提供的索引标签序列信息，将测序数据进行拆分。使用 Trimmomatic-0.36软件对下机数据进行质量过滤和接头序列切除。用的比对程序BWA软件，将每个样品的测序序列比对到人类参考基因组，并根据比对上基因组的测序序列进行目标区域(即BRCA1和BRCA2全部编码序列和相邻±20bp内含子区)覆盖率及均一性评估，结果如图6所示。
实施例3临床样品检测
采用本发明提供的建库试剂盒对60例乳腺癌/卵巢癌患者白细胞进行 BRCA1/2基因突变检测，其中，乳腺癌2例，卵巢癌患者58例。样品平均reads 量为5M，目标区域覆盖率为100％，最低深度大于500X，扩增子测序深度不低于1/5平均测序深度的覆盖率为100％。突变检测结果见表2。对于分析所得到的突变结果，经Sanger测序全部得到验证，表明本发明方法及试剂盒可以用于乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1/2全编码序列的突变检测。
表2、突变检测结果
本案覆盖BRCA整个外显子编码区及外显子与内含子交界区至少±20个碱基，总目标区段长度17.77kb。基于Illumina测序仪SE75测序模式下，对上述样品的部分测序结果统计如表3所示。单样品测序reads数约5M左右，测序数据中90％以上reads比对到目标基因，证明多重PCR扩增的高度特异性，目标区域100％覆盖，且样品目标区中大于0.2倍平均深度的碱基比例大于95％，反应本案具有良好的均一性。
表3、样品的部分测序结果
