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一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液

2020-12-30 19:07:16

一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液

  技术领域

  本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液。

  背景技术

  核酸提取方法包括传统的酚—氯仿法、盐析法、滤膜离心柱法等。传统的核酸提取法各有其优缺点,但提取效果欠佳。当前主流的核酸提取方法有硅胶膜吸附柱法、抗DNA单克隆抗体的免疫亲和法、自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法等等。

  磁珠法核酸提取是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠( 以下简称磁珠) 为载体,通过磁珠在高离液盐溶液中吸附核酸而在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。其中磁珠具有的特点,如良好的表面效应和体积效应、良好的选择性磁响应性、物理化学性质稳定等,使磁珠法核酸提取得到广泛的应用。然而不同的磁珠法核酸提取方法,又因其所选用的裂解液、结合液、洗涤液等组分和含量的不同而导致最终核酸提取效率差别很大。另一方面,基于待测样品的多样性,包括细胞、细菌、血清、血浆、精液、毛发、唾液、尿液或胸腹水等,不同的待测样品采用同一种磁珠法核酸提取方法所得的提取效果和提取效率也存在很大差异。

  其中唾液属于较容易获取的核酸提取待测样品,其成分与血清、血浆中的成分存在巨大差异,唾液是无色、无味、无嗅的液体,偏酸性,PH值6~7,粘度比水大18~35倍。唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物质。而粘蛋白、粘多糖是使唾液粘稠主要物质,及其与他样本类型最大的不同。而现有的磁珠法提取方法普遍针对血清、血浆,其直接用于唾液的核酸提取时所得核酸浓度欠佳,限制了磁珠法提取方法在唾液核酸提取中的高效应用。

  发明内容

  本发明的目的在于,针对上述现有技术的不足,提供一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液。

  本发明所采取的技术方案是:一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液,其由10~150mM的Tris-HCl、1~10M的高离液盐、0.1~10%的阴离子表面活性剂、1~20%的非离子表面活性剂、0.1~4%的CTAB和1~100mM的螯合剂组成。

  作为上述方案的进一步改进,所述裂解液优选由50~100mM的Tris-HCl、3~8M的高离液盐、0.1~5%的阴离子表面活性剂、1~10%的非离子表面活性剂、0.5~2%的CTAB和20~70mM的螯合剂组成。

  唾液为粘稠状液体,其含有较多的粘多糖、粘蛋白及食物残渣。其中粘多糖是含氮的不均一多糖,是一种具有特定顺序的重复单位的线型分子,亦是构成细胞间结缔组织的主要成分,化学组成为糖醛酸和酪氨基己糖交替出现,有时含硫键,也称为糖胺聚糖。而粘蛋白主要由粘多糖组成,是一种高度糖基化修饰的高分子量蛋白家族,具有复杂的生物大分子结构,其可以聚集形成凝胶状,起到组织的润滑及细胞信号的传导等多种功能,可以形成化学屏障。因而唾液中的粘多糖、粘蛋白及食物残渣均较大程度地影响唾液核酸提取效率,是造成唾液提取核酸效率低,纯度低的重要因素。

  在本发明技术方案中,创造性地添加特定量的CTAB以有效增加粘多糖、粘蛋白等的溶解度,同时通过特定量的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的复配,使粘多糖、粘蛋白及其它蛋白质等杂质可充分解离、沉降、稳定等,且使核酸分子间静电排斥力降低而易于被醇类沉淀,从而达到去除蛋白质和其他杂质的目的。

  作为上述方案的进一步改进,所述高离液盐选自异硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钾、氯化锂、高氯酸钠中的其中一种。

  作为上述方案的进一步改进,所述阴离子表面活性剂选自SDS、月桂酸钠、十二烷基苯磺酸中的其中一种。

  作为上述方案的进一步改进,所述非离子表面活性剂选自NP-40、吐温20、Triton-X-100中的其中一种。

  具体地,高离液盐可打开舒展蛋白质的一级结构,使得核酸蛋白复合物中的蛋白质更易于被表面活性剂解离。而阴离子表面活性剂能中和核酸的负电荷,使核酸分子间静电排斥力降低,使核酸易于被醇类沉淀及能有效的去除蛋白质和其他杂质;CTAB能增加粘多糖和粘蛋白等的溶解度,从而达到去除杂质的目的,而且CTAB与阴离子表面活性剂有较好的复配性;非离子表面活性剂具有乳化、扩散、增溶、降阻、稳定等作用,其不易受强电解质存在的影响,也不易受酸、碱的影响,与其他类型表面活性剂有良好的相容性,其溶解度随温度升高而降低,同时具有一定的去蛋白能力。本发明中裂解液具有阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和CTAB的复配体系,能使生物样本的裂解和杂质的解离沉降更充分,进一步提高核酸提取效率和核酸提取纯度。进一步地,当阴离子表面活性剂选自SDS、月桂酸钠、十二烷基苯磺酸中的其中一种、非离子表面活性剂选自NP-40、吐温20、Triton-X-100中的其中一种时,其与CTAB复配对生物样本的裂解和杂质的沉降解离具有优异的效果,特别是对具有粘稠特性的生物样本,特别是唾液样本,从而有效提高提取的核酸纯度。

  作为上述方案的进一步改进,所述螯合剂选自乙二胺四乙酸,氨基三乙酸,柠檬酸钠中的其中一种。

  本发明还提供了一种试剂盒,其包括如上所述的裂解液、结合液和蛋白酶K。进一步地,所述结合液选自乙醇或异丙醇。具体地,裂解液、结合液和蛋白酶K复配成混合体系,该混合体系含有 “N”ul的裂解液(50≤“N”≤300)、“0.1N”ul的蛋白酶K和“N”ul的结合液。其中“N”值的选定可根据实际操作所需,“N”值过小或过大都不利于生物样本的核酸提取,本发明中“N”值取200,其能有利于机械设备的自动化操作。

  本发明的另一个方面是提供一种如上所述的磁珠法提取唾液核酸的裂解液的应用。所述裂解液特别适用于提取唾液样品中的核酸,其同时也适用于全血、细胞培养物、细菌培养物,拭子、组织等生物样本的核酸提取。

  作为上述方案的进一步改进,所述经裂解液提取后的生物样本的核酸可用于PCR、酶切、分子杂交、文库构建。

  本发明的有益效果是:本发明中磁珠法核酸提取的裂解液在充分、有效地裂解细胞的同时可有效去除唾液中粘多糖、粘蛋白、食物残渣等特殊杂质及其他蛋白质、脂脂、碳水化合物、盐等常规杂质,从而使核酸提取效果更好、核酸纯度更高,保证后期的检测更高效,检测结果更准确。本发明的裂解液同时适用于全血、细胞培养物、细菌培养物,拭子、组织等生物样本的核酸提取。

  附图说明

  图1为实施例1各样本Real-time PCR检测(检测基因RNaseP)的检测结果图。

  具体实施方式

  下面结合实施例对本发明进行具体描述,以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是,实施例只是用于对本发明做进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,所属领域技术熟练人员,根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整,应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的,均为市售产品;未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

  实施例1:以唾液作为生物样本进行核酸提取及检测

  1、唾液样本处理:唾液收集管为广东国盛医学科技股份有限公司的唾液保存管。取12份唾液样本,不用进行前处理,上下颠倒数次混合均匀后,直接加到裂解液体系中进行裂解消化。

  2、试剂:

  a、按原料组分配比配制12份裂解液,如下表所示:

  b、磁珠-结合液:将20ul的磁珠均匀分散于200ul异丙醇中所得的混合液;

  c、洗涤液A:由50mM的Tris-HCl、3M的硫氰酸钾、0.5%的CTAB、2%的PVP和40%的乙醇组成;

  d、洗涤液B:70%的乙醇。

  3、用上述试剂分别对12份唾液样本进行磁珠法核酸提取,步骤如下:

  分别将200ul的唾液样本、200ul的与样本对应序号的裂解液、20ul的蛋白酶K分装到1号核酸提取板中,在温度为70℃裂解反应20min,再加入220ul的磁珠-结合液,快速混合5min,吸磁3次;将500ul的洗涤液A分装到2号核酸提取板中;将500ul的洗涤液B分装到3号核酸提取板中;将50ul的TE溶液分装到4号核酸提取板中;在磁力作用下,磁棒吸附1号核酸提取板中的磁珠转移至2号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次;后磁棒吸附磁珠转移至3号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次;后磁棒吸附磁珠转移至4号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次,即得提取好的核酸。

  4、核酸检测:

  分别对实施例1中12份已提取好的唾液样本进行核酸浓度检测,检测结果如下表1所示;分别对实施例1各唾液样本Real-time PCR检测(检测人管家基因RNasep)的检测结果图如图1所示,由图1数据可得出,本发明的裂解液用于磁珠法核酸提取后的核酸样本没有抑制物,PCR效果好。

  实施例2:以血液作为生物样本进行核酸提取及检测

  1、血液样本处理:血液收集于广东国盛医学科技股份有限公司的血液保鲜管中。收集10人体血液样本,上下颠倒混合均匀后,直接加到裂解液体系中进行裂解消化。

  2、试剂:

  a、裂解液:由100mM的Tris-HCl、5M的氯化锂、3%的月桂酸钠、5%的Triton-X-100、1%的CTAB和50mM的氨基三乙酸混合而成;

  b、磁珠-结合液:将10ul的磁珠均匀分散于100ul乙醇中所得的混合液;

  c、洗涤液A:由100mM的Tris-HCl、5M的氯化锂、1%的CTAB、0.2%的PVP和40%的乙醇组成;

  d、洗涤液B:70%的乙醇。

  3、用上述试剂分别对10份人体血液样本进行磁珠法核酸提取,步骤如下:

  分别将200ul的血液样本、200ul的裂解液、20ul的蛋白酶K分装到1号核酸提取板中,在温度为70℃裂解反应20min,再加入220ul的磁珠-结合液,快速混合5min,吸磁3次;将500ul的洗涤液A分装到2号核酸提取板中;将500ul的洗涤液B分装到3号核酸提取板中;将100ul的TE溶液分装到4号核酸提取板中;在磁力作用下,磁棒吸附1号核酸提取板中的磁珠转移至2号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次;后磁棒吸附磁珠转移至3号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次;后磁棒吸附磁珠转移至4号核酸提取板中,释放磁珠,快速混合2min,吸磁3次,即得提取好的核酸。

  4、核酸检测:

  对上述提取后的10份人体血液样本进行核酸浓度检测和通过Rael-time PCR检测人管家基因RNasep,并与对比例,即采用进口试剂盒invitrogen对所述10份人体血液样本进行核酸提取的结果进行比较,检测结果如下表2所示。由表2可得本发明的裂解液的核酸提取效果对比进口试剂盒invitrogen的效果要好。

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