一种细菌的检测方法
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种细菌的检测方法。
背景技术
病原细菌是病原微生物的一种，存在于食品、水和环境中的病原细菌能够引起多种疾病的爆发，它能够引起细菌的感染并导致许多严重并发症。例如一些常见的致病菌：沙门氏菌(食物中毒)，幽门螺杆菌(胃炎和肝炎)，淋病奈瑟菌(性传播疾病)，奈瑟菌(脑膜炎)，金黄色葡萄球菌(烧伤，蜂窝织炎，脓肿，伤口感染，毒物综合征，肺炎和食物中毒)和链球菌属(肺炎、脑膜炎、耳部感染和咽炎)等。每年有超过3亿例由细菌感染引起的严重的甚至致命的疾病，死亡人数超过200万人，特别是随着细菌耐药性的增强，抗生素耐药性已经成为一个威胁全球健康的问题，到2050年估计除非采取行动，否则AMR导致死亡的人数每年可以增加到1000万人，到2050年对全球经济产生的累计成本达100万亿美元。在此基础上，到2050年，死亡人数惊人的达到每三秒钟就会有一个人死亡，人均治疗费用会达到一万美元。
传统的细菌检测方法包括微生物培养法、免疫学方法、分子生物学方法等。细菌培养方法是临床细菌检测的标准方法，但是检测过程繁琐，耗时较长，不适用于细菌的快速检测。免疫学方法是以抗原抗体反应为基础，通过免疫反应识别靶标分子，该方法具有灵敏度高、特异性好、检测速度快等优点，但是在实际样品检测中获取相应抗体耗时较长，而且其特异性易受到来自抗体的干扰，影响其检测灵敏度。分子生物学方法是以细菌核酸检测分析为基础，通过预先设计的分子探针对细菌内特定序列的DNA或miRNA核酸分子等进行特异性识别分析，例如酶联免疫测定(ELISA)、DNA微阵列(DNA Microarrays)和聚合酶链式反应(PCR)，这些方法灵敏度高、特异性好，可达到痕量级检测，针对低含量细菌检测具有重大意义。但是前期引物设计较为复杂，检索过程繁琐，对技术人员的要求较高。这些常规的细菌检测方法在灵敏度、特异性、检测速度、耗费、以及细菌高通量检测分析方面都有一定的局限性。荧光成像技术作为生物研究的有力工具，广泛应用于细菌高通量分析，它具有快速、直接、普适性和高通量检测等优势，但是不同的荧光物质之间存在光谱干扰等因素，大大限制了其高通量分析。
发明内容
针对上述的不足之处，本发明的目的在于提供了一种快速、准确、超灵敏、高通量的细菌检测方法。
本发明将不同的荧光探针按照一定的摩尔比例封装在液滴中，每种探针与特定细菌一一对应，通过对每种细菌进行荧光编码构建一个标准的液滴条形码文库，在核酸机器人(DNA walker)的信号循环放大作用下，通过测定液滴中的荧光强度可实现细菌混合物的快速、准确、超灵敏和高通量检测。
具体而言分别将标记荧光素的ssDNA2修饰在13nm的金球上，制备成不同种类的探针。将不同种类的探针按照一定的摩尔比例和反应物混合加入到待测菌液中，然后封装在液滴中恒温孵化，此时aptamer从双链中解离下来结合在细菌表面，ssDNA1会结合到与之部分互补的ssDNA2上，在核酸机器人的作用下，ssDNA1会在探针上发生酶切反应，把探针上的荧光素剪切下来并释放到待测溶液中，使得溶液的整体荧光强度增强，通过检测液滴中的待测溶液产生的荧光强度，并与标准文库条形码进行比对，每种荧光强度对应不同种类的细菌，可以快速区分不同种类的细菌。从而实现细菌的超灵敏和高通量检测。
本发明提出了一种细菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)构建标准液滴条形码文库
(1.1)荧光素修饰ssDNA2
将荧光素与ssDNA2混合，得到荧光素修饰的ssDNA2。
(1.2)构建细菌特异性响应的探针
将荧光素修饰的ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料混合，调节pH，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的探针(荧光编码的探针)，然后测定探针的浓度，构建标准液滴条形码文库。
(2)制备标准文库溶液
将细菌特异性响应的探针与反应混合物封装在液滴中，制备标准文库溶液；其中，所述反应混合物包括双链DNA以及EXOIII。
(3)检测细菌
将待测菌液与步骤(2)制备的标准文库溶液封装在液滴中，进行孵化反应，将荧光强度与标准液滴条形码文库进行比对，确定细菌种类。
步骤(1.1)中，所述荧光素选自AMCA、FAM、Texas Red等中的一种。
步骤(1.1)中，所述ssDNA2的基因序列如SEQ ID NO.1-9所示：
MRSA：HS-TTTTTTTTTTTTAACCGAGTCGGGGT-FAM(SEQ ID NO.1)
P.aeruginosa：HS-TTTTTTTTTTCCTGCTTCCTTTCTTG-FAM(SEQ ID NO.2)
E.coli:HS-TTTTTTTTTTAGTGCACCTGCGGTCC-FAM(SEQ ID NO.3)
S.epidermidis:HS-TTTTTTTTTTGGAAGTTCTGCGTTAT-AMCA(SEQ ID NO.4)
Listeria:HS-TTTTTTTTTTCTGTGTTTTCGGGTGC-AMCA(SEQ ID NO.5)
S.typhimurim:HS-TTTTTTTTTTCTTGACATTATGACTG-AMCA(SEQ ID NO.6)
L.acidophilus:HS-TTTTTTTTTTCTCTGCATTCTGTGTG-TEXAD RED(SEQ ID NO.7)
Bacillus:HS-TTTTTTTTTTTGGTGTTGGCTCCCGTATC-TEXAD RED(SEQ ID NO.8)
Shigella:HS-TTTTTTTTTTTGTATAGTCCTGTGTGC-TEXAD RED(SEQ ID NO.9)
步骤(1.1)中，所述ssDNA2与荧光素的用量比根据实际情况确定。
步骤(1.2)中，所述pH＝3-4；优选地，为pH＝3.4。
步骤(1.2)中，所述pH用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐等中的一种或多种进行调节；优选地，为柠檬酸盐。
步骤(1.2)中，所述ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料的摩尔比为(100-150):1；优选地，为150:1。
步骤(1.2)中，所述对荧光基团起猝灭作用的材料选自金球(AuNPs)、碳纳米管、石墨烯二维材料等中的一种或多种；优选地，为金球(AuNPs)。
其中，所述金球的直径为10-18nm；优选地，为13nm。
步骤(1.2)中，所述静置优选为避光静置。
其中，所述静置的时间为12-18min；优选地，为15min。
步骤(1.2)中，所述离心机的转速为9000-12000r；优选地，为10000r。
步骤(1.2)中，所述离心的时间为13-18min；优选地，为15min。
步骤(2)中，所述双链DNA和EXOIII的体积比为(25-35)：(1-5)；优选地，为30:2。
步骤(2)中，所述细菌特异性响应的探针与反应混合物的体积比为(80-120)：50；优选地，为100:50。
步骤(2)中，所述双链DNA(aptamer+ssDNA1)的制备过程为：将细菌特异性响应的aptamer和与其互补的ssDNA1混合，然后置于水浴锅中加热至90-98℃，得到双链DNA(aptamer+ssDNA1)。
其中，所述ssDNA1的基因序列如SEQ ID NO.10-18所示：
MRSA：AGCAATCCCTTTCTTTGTATTAACCGAGTCGGGGTTTTTT(SEQ ID NO.10)
P.aeruginosa：
CAAGAAAGGAAGCAGGGACGAAACGAACAAAAGCGAAAGGAAAAGCGAAAGCAACGGGGGTTTTT(SEQID NO.11)
E.coli:CCTGGCGTCCACGTGACCCGCTGCAGAGACCCACACCACATTTTT(SEQ ID NO.12)
S.epidermidis:ATAACGCAGAACTTCCGGCACTCTGAGTGCCACGTGAGAGGGCGCTTTTT(SEQID NO.13)
Listeria:GCACCCGAAAACACAGTAAGAATCGAAAACGGAACACAGA(SEQ ID NO.14)
S.typhimurim:GCACCGCCAAGGATGTTCCCGCCTTGTATTGATTAACTCTTTTT(SEQ IDNO.15)
L.acidophilus:CACACAGAATGCAGAGATATTACTATGTTGAAGGGCTATTTTT(SEQ IDNO.16)
Bacillus:GATACGGGAGCCAACACCACCTGGTCCCCATGTTAGTGGCCAGAGCAGGTGTGACGGATTTTT(SEQ ID NO.17)
Shigella:GGCACACAGGACTATACAGTGTTGCAGTGTTGCTGTTCGACATGAGGGGGCCCATTTTT(SEQ ID NO.18)
其中，所述aptamer和ssDNA1按照摩尔比(2:1)-(4:1)；优选地，为3:1。
其中，所述aptamer的基因序列如SEQ ID NO.19-27所示：
MRSA：ACCCCGACTCGGTTAATACAAATAAAGGGATTGCTTTTTT(SEQ ID NO.19)
P.aeruginosa：CCCCCGTTGCTTTCGCTTTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTTCTTGTTTTT(SEQ ID NO.20)
E.coli:GGACCGCAGGTGCACTGGGCGACGTCTCTGGGTGTGGTGTTTTTT(SEQ ID NO.21)
S.epidermidis:GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTATTTTTT(SEQID NO.22)
Listeria:TCTGTGTTCCGTTTTCGATTCTTACTGTGTTTTCGGGTGC(SEQ ID NO.23)
S.typhimurim:GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAACATCCTTGGCGGTGCTTTTT(SEQ IDNO.24)
L.acidophilus:TAGCCCTTCAACATAGTAATATCTCTGCATTCTGTGTGTTTTT(SEQ IDNO.25)
Bacillus:CATCCGTCACACCTGCTCTGGCCACTAACATGGGGACCAGGTGGTGTTGGCTCCCGTATTTTT(SEQ ID NO.26)
Shigella:TGGGCCCCCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCCTGTGTGCCTTTTT(SEQ ID NO.27)
其中，所述双链DNA(aptamer+ssDNA1)的基因序列如SEQ ID NO.28-36所示：
MRSA：ACCCCGACTCGGTTAATACAAATAAAGGGATTGCTTTTTTAGCAATCCCTTTCTTTGTATTAACCGAGTCGGGGTTTTTT(SEQ ID NO.28)
P.aeruginosa：CCCCCGTTGCTTTCGCTTTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTTCTTGTTTTTCAAGAAAGGAAGCAGGGACGAAACGAACAAAAGCGAAAGGAAAAGCGAAAGCAACGGGGGTTTTT(SEQ ID NO.29)
E.coli:GGACCGCAGGTGCACTGGGCGACGTCTCTGGGTGTGGTGTTTTTTCCTGGCGTCCACGTGACCCGCTGCAGAGACCCACACCACATTTTT(SEQ ID NO.30)
S.epidermidis:GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTATTTTTTATAACGCAGAACTTCCGGCACTCTGAGTGCCACGTGAGAGGGCGCTTTTT(SEQ ID NO.31)
Listeria:TCTGTGTTCCGTTTTCGATTCTTACTGTGTTTTCGGGTGCGCACCCGAAAACACAGTAAGAATCGAAAACGGAACACAGA(SEQ ID NO.32)
S.typhimurim:
GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAACATCCTTGGCGGTGCTTTTTGCACCGCCAAGGATGTTCCCGCCTTGTATTGATTAACTCTTTTT(SEQ ID NO.33)
L.acidophilus:TAGCCCTTCAACATAGTAATATCTCTGCATTCTGTGTGTTTTTCACACAGAATGCAGAGATATTACTATGTTGAAGGGCTATTTTT(SEQ ID NO.34)
Bacillus:CATCCGTCACACCTGCTCTGGCCACTAACATGGGGACCAGGTGGTGTTGGCTCCCGTATTTTTGATACGGGAGCCAACACCACCTGGTCCCCATGTTAGTGGCCAGAGCAGGTGTGACGGATTTTT(SEQ IDNO.35)
Shigella:
TGGGCCCCCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCCTGTGTGCCTTTTTGGCACACAGGACTATACAGTGTTGCAGTGTTGCTGTTCGACATGAGGGGGCCCATTTTT(SEQ ID NO.36)
其中，所述加热的温度优选为95℃。
其中，所述加热的时间为2-10min；优选地，为5min。
其中，在加热之后还包括冷却的步骤，所述冷却优选至室温。
步骤(2)中，所述双链DNA(aptamer+ssDNA1)的作用为起到一种抑制酶切反应的作用，这样才能保证只有加入细菌，才会触发酶切反应。
步骤(2)中，所述EXOⅢ的作用为它可以在平末端双链的3’端开始剪切碱基，使得DNA链上的荧光素释放到溶液中去。
本发明标准文库溶液的制备还可以在脂类物质包裹小分子中进行，其中脂类物质包裹小分子如荧光脂质包裹的DNA纳米材料，阳离子脂类包裹的药物小分子等。
步骤(3)中，所述细菌选自MRSA、P.aeru、E.coli、S.epidermidis、Listeria、S.typhimurim、L.acidophilus、Bacillus、Shigella中的一种或多种。
步骤(3)中，所述待测菌液与标准文库溶液的体积比为50:(80-120)；优选地，为50:100。
步骤(3)中，所述孵化反应的温度36-38℃；优选地，为37℃。
步骤(3)中，所述孵化反应的时间为3-6h；优选地，为4h。
本发明孵化反应还可以在脂类物质包裹小分子中进行，其中脂类物质包裹小分子如荧光脂质包裹的DNA纳米材料，阳离子脂类包裹的药物小分子等。
具体地，一种细菌的检测方法包括如下步骤：
(a)构建标准液滴条形码文库
将双修饰的ssDNA2(5’端修饰巯基、3’端修饰荧光素FAM)与对荧光基团起猝灭作用的材料混合，加入柠檬酸盐调pH，然后避光静置、离心，除去未反应的单链DNA并用磷酸缓冲液重新分散，清洗得到细菌特异性响应的的探针，最后用紫外分光光度计测定探针的浓度，构建标准液滴条形码文库。
(b)制备标准文库溶液
制备双链DNA(aptamer+ssDNA1)
将细菌特异性响应的aptamer和与其互补的ssDNA1混合，然后置于水浴锅中加热，然后冷却，得到双链DNA(aptamer+ssDNA1)。
将细菌特异性响应的探针与双链DNA(aptamer+ssDNA1)、EXOⅢ按照一定的摩尔比依次通过液滴微流控装置封装在50μm的液滴中，制备标准文库溶液。
(c)将待测菌液与步骤(b)制备的标准文库溶液中，然后封装在液滴中，置于恒温箱中孵化反应，并控制EXOⅢ的终浓度，最后用共聚焦荧光显微镜测定液滴中的荧光强度并与标准液滴条形码文库进行比对，确定液滴中的细菌混合物种类。
步骤(a)中，将巯基修饰的ssDNA2固定在对荧光基团起猝灭作用的材料表面，具体为通过快速加入柠檬酸盐调控溶液PH值，来增加ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料表面的结合几率。
步骤(a)中，所述ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料的摩尔比为(100-150):1；优选地，为150:1。
步骤(a)中，所述对荧光基团起猝灭作用的材料选自金球(AuNPs)、碳纳米管、石墨烯二维材料等；优选地，为金球(AuNPs)。
其中，所述金球(AuNPs)的直径为10-18nm；优选地，为13nm。
步骤(a)中，所述避光静置的时间为12-18min；优选地，为15min。
步骤(a)中，所述离心机的转速为9000-12000r；优选地，为10000r。
步骤(a)中，所述离心的时间为13-18min；优选地，为15min。
步骤(a)中，所述清洗的次数为2-4次；优选地，为3次。
步骤(a)中，所述pH＝3-4；优选地，为3.4。
步骤(a)中，所述ssDNA2的基因序列如SEQ ID NO.1-9所示：
MRSA：HS-TTTTTTTTTTTTAACCGAGTCGGGGT-FAM(SEQ ID NO.1)
P.aeruginosa：HS-TTTTTTTTTTCCTGCTTCCTTTCTTG-FAM(SEQ ID NO.2)
E.coli:HS-TTTTTTTTTTAGTGCACCTGCGGTCC-FAM(SEQ ID NO.3)
S.epidermidis:HS-TTTTTTTTTTGGAAGTTCTGCGTTAT-AMCA(SEQ ID NO.4)
Listeria:HS-TTTTTTTTTTCTGTGTTTTCGGGTGC-AMCA(SEQ ID NO.5)
S.typhimurim:HS-TTTTTTTTTTCTTGACATTATGACTG-AMCA(SEQ ID NO.6)
L.acidophilus:HS-TTTTTTTTTTCTCTGCATTCTGTGTG-TEXAD RED(SEQ ID NO.7)
Bacillus:HS-TTTTTTTTTTTGGTGTTGGCTCCCGTATC-TEXAD RED(SEQ ID NO.8)
Shigella:HS-TTTTTTTTTTTGTATAGTCCTGTGTGC-TEXAD RED(SEQ ID NO.9)
在一个具体实施方式中，将荧光素修饰的ssDNA2连接到13nm的金球表面的具体步骤为：将4μl巯基修饰的ssDNA2与40μl的AuNPs(60nM)混合，加入4.88μl的柠檬酸盐(500mM,PH＝3)并快速涡旋。并使得柠檬酸盐的终浓度为50mM。避光静置15min后，在转速10000r下离心十分钟，弃去上清液，用磷酸缓冲液(PH＝7.4)清洗三次。最后用磷酸缓冲液重新分散，至于4℃冰箱中储存。后取少量溶液用紫外分光光度计测定探针的浓度。
步骤(b)中，所述ssDNA1与aptamer的3’端延伸出5个胸腺嘧啶，这样它们通过碱基互补形成的双链DNA不是平末端，可避免EXOⅢ对双链DNA(ssDNA1+aptamer)发生剪切作用(EXOⅢ的作用为从双链DNA平末端的3’端开始剪切)。
步骤(b)中，所述ssDNA1的基因序列如SEQ ID NO.10-18所示：
MRSA：AGCAATCCCTTTCTTTGTATTAACCGAGTCGGGGTTTTTT(SEQ ID NO.10)
P.aeruginosa：
CAAGAAAGGAAGCAGGGACGAAACGAACAAAAGCGAAAGGAAAAGCGAAAGCAACGGGGGTTTTT(SEQID NO.11)
E.coli:CCTGGCGTCCACGTGACCCGCTGCAGAGACCCACACCACATTTTT(SEQ ID NO.12)
S.epidermidis:ATAACGCAGAACTTCCGGCACTCTGAGTGCCACGTGAGAGGGCGCTTTTT(SEQID NO.13)
Listeria:GCACCCGAAAACACAGTAAGAATCGAAAACGGAACACAGA(SEQ ID NO.14)
S.typhimurim:GCACCGCCAAGGATGTTCCCGCCTTGTATTGATTAACTCTTTTT(SEQ IDNO.15)
L.acidophilus:CACACAGAATGCAGAGATATTACTATGTTGAAGGGCTATTTTT(SEQ IDNO.16)
Bacillus:GATACGGGAGCCAACACCACCTGGTCCCCATGTTAGTGGCCAGAGCAGGTGTGACGGATTTTT(SEQ ID NO.17)
Shigella:GGCACACAGGACTATACAGTGTTGCAGTGTTGCTGTTCGACATGAGGGGGCCCATTTTT(SEQ ID NO.18)
步骤(b)中，所述aptamer和ssDNA1按照摩尔比(2:1)-(4:1)；优选地，为3:1。
步骤(b)中，所述aptamer的基因序列如SEQ ID NO.19-27所示：
MRSA：ACCCCGACTCGGTTAATACAAATAAAGGGATTGCTTTTTT(SEQ ID NO.19)
P.aeruginosa：CCCCCGTTGCTTTCGCTTTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTTCTTGTTTTT(SEQID NO.20)
E.coli:GGACCGCAGGTGCACTGGGCGACGTCTCTGGGTGTGGTGTTTTTT(SEQ ID NO.21)
S.epidermidis:GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTATTTTTT(SEQID NO.22)
Listeria:TCTGTGTTCCGTTTTCGATTCTTACTGTGTTTTCGGGTGC(SEQ ID NO.23)
S.typhimurim:GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAACATCCTTGGCGGTGCTTTTT(SEQ IDNO.24)
L.acidophilus:TAGCCCTTCAACATAGTAATATCTCTGCATTCTGTGTGTTTTT(SEQ IDNO.25)
Bacillus:CATCCGTCACACCTGCTCTGGCCACTAACATGGGGACCAGGTGGTGTTGGCTCCCGTATTTTT(SEQ ID NO.26)
Shigella:TGGGCCCCCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCCTGTGTGCCTTTTT(SEQ ID NO.27)
步骤(b)中，所述双链DNA(aptamer+ssDNA1)的基因序列如SEQ ID NO.28-36所示：
MRSA：ACCCCGACTCGGTTAATACAAATAAAGGGATTGCTTTTTTAGCAATCCCTTTCTTTGTATTAACCGAGTCGGGGTTTTTT(SEQ ID NO.28)
P.aeruginosa：CCCCCGTTGCTTTCGCTTTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTTCTTGTTTTTCAAGAAAGGAAGCAGGGACGAAACGAACAAAAGCGAAAGGAAAAGCGAAAGCAACGGGGGTTTTT(SEQ ID NO.29)
E.coli:GGACCGCAGGTGCACTGGGCGACGTCTCTGGGTGTGGTGTTTTTTCCTGGCGTCCACGTGACCCGCTGCAGAGACCCACACCACATTTTT(SEQ ID NO.30)
S.epidermidis:GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGCCGGAAGTTCTGCGTTATTTTTTATAACGCAGAACTTCCGGCACTCTGAGTGCCACGTGAGAGGGCGCTTTTT(SEQ ID NO.31)
Listeria:TCTGTGTTCCGTTTTCGATTCTTACTGTGTTTTCGGGTGCGCACCCGAAAACACAGTAAGAATCGAAAACGGAACACAGA(SEQ ID NO.32)
S.typhimurim:
GAGTTAATCAATACAAGGCGGGAACATCCTTGGCGGTGCTTTTTGCACCGCCAAGGATGTTCCCGCCTTGTATTGATTAACTCTTTTT(SEQ ID NO.33)
L.acidophilus:TAGCCCTTCAACATAGTAATATCTCTGCATTCTGTGTGTTTTTCACACAGAATGCAGAGATATTACTATGTTGAAGGGCTATTTTT(SEQ ID NO.34)
Bacillus:CATCCGTCACACCTGCTCTGGCCACTAACATGGGGACCAGGTGGTGTTGGCTCCCGTATTTTTGATACGGGAGCCAACACCACCTGGTCCCCATGTTAGTGGCCAGAGCAGGTGTGACGGATTTTT(SEQ IDNO.35)
Shigella:
TGGGCCCCCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCCTGTGTGCCTTTTTGGCACACAGGACTATACAGTGTTGCAGTGTTGCTGTTCGACATGAGGGGGCCCATTTTT(SEQ ID NO.36)
步骤(b)中，所述细菌特异性响应的探针与双链DNA(aptamer+ssDNA1)的摩尔比为1:(100-200)；优选地，为1:200。
步骤(b)中，所述加热的温度为90-98℃；优选地，为95℃。
步骤(b)中，所述加热的时间为2-10min；优选地，为5min。
步骤(b)中，所述冷却优选至室温。
本发明标准文库溶液的制备还可以在脂类物质包裹小分子中进行，其中脂类物质包裹小分子如荧光脂质包裹的DNA纳米材料，阳离子脂类包裹的药物小分子等。
步骤(c)中，所述反应的温度35-38℃；优选地，为37℃。
步骤(c)中，所述反应的时间为3-6h；优选地，为4h。
步骤(c)中，所述EXOⅢ从双链DNA(aptamer+ssDNA1)的3’平末端开始剪切DNA链。
步骤(c)中，所述EXOⅢ的最终反应浓度为15-20U/L；优选地，为15U/L。此时EXOⅢ酶浓度为当前体系下的已经饱和，过量的添加酶数量，会造成不必要的浪费。
步骤(c)中，所述待测菌液的制备过程如下：在超净台中从样品中分离细菌并置于培养基中，在恒温摇床中培养，然后取菌液并置于离心机中离心，然后弃去上层培养液，用磷酸缓冲液重新分散，重复清洗得到待测菌液。
其中，所述恒温摇床的条件为37℃、150r。
其中，所述在恒温摇床中培养的时间为12-48h；优选地，为24h。
其中，所述离心机的转速为3000-4500r；优选地，为3500r。
其中，所述离心的时间为5-10min；优选地，为6min。
其中，所述磷酸缓冲液优选为pH＝7.4的缓冲液。
其中，所述清洗的次数为2-4次；优选地，为3次。
本发明孵化反应还可以在脂类物质包裹小分子中进行，其中脂类物质包裹小分子如荧光脂质包裹的DNA纳米材料，阳离子脂类包裹的药物小分子等。
在一个具体实施方式中，待测菌液的制备：在超净台中从样品中分离细菌置于30ml LB培养基中，在37℃、转速150r的恒温摇床培养24h，用离心管取1000μl菌液，置于离心机中，转速3500r，弃去上层培养液，用磷酸缓冲液重新分散，重复清洗三次得到待测菌液。
本发明中，所述ssDNA1与ssDNA2部分互补形成双链，且在ssDNA2的3’端形成平末端。
在一个具体实施方式中，标准液滴条形码的构建如下：将不同种类的细菌和其特异性的探针、双链DNA(aptamer+ssDNA1)以及EXOⅢ(其中，每种细菌分别做了红、绿、蓝三种颜色的探针，且这三种颜色探针的摩尔比均为1:2:4，如标记FAM的三种探针的浓度比为15nM:30nM:60nM)依次通过液滴微流控装置封装在50μm的液滴中，置于恒温箱中反应，用荧光共聚焦显微镜检测空白对照组(加入等体积的磷酸缓冲液代替菌液)以及反应前后液滴中单种菌液荧光强度的变化用于构建标准液滴条形码。
其中，所述恒温箱的温度36-38℃；优选地，为37℃。
其中，所述反应的时间为3-6h；优选地，为4h。
其中，将混合反应溶液封装在液滴中，具体为：将200μl的不同种类的细菌和其特异性的探针以及反应混合物(双链DNA(aptamer+ssDNA1)、EXOⅢ)和油相分别置于注射器中，在哈弗泵的推动作用下，按照1:1的流速比通过液滴微流控芯片制备成直径50μm的液滴。
其中，所述油相优选为二甲基硅油。
其中，所述水相与油相的流速摩尔比为1:0.5-1:3；优选地，为1:2。
其中，将不同种类的细菌和其特异性的探针依次封装在液滴中，具体步骤为：以MRSA、P.aeru和E.coli三种细菌为例，将MRSA和其特异性的探针(终浓度为15nM)以及反应混合物(双链DNA(aptamer+ssDNA1)、EXOⅢ)混合然后封装在直径50μm的液滴中。基于相似的原理将P.aeru和其特异性的探针(终浓度为15nM)以及反应混合物混合然后封装在直径50μm的液滴中。将E.coli和其特异性的探针(终浓度为60nM)以及反应混合物混合然后封装在直径50μm的液滴中。
本发明构建标准的液滴条形码目的在于提前建立一个标准液滴条形码文库，这样后期用本发明的方法采集到的荧光信号，与提前制备好的标准液滴条形码文库进行比对，可以快速确定细菌的种类。
在一个具体实施方式中，标准液滴条形码文库的构建如下：将不同种类的细菌混合物及其特异性的探针、双链DNA(aptamer+ssDNA1)和EXOⅢ(其中，每种细菌分别做了红、绿、蓝三种颜色的探针，且这三种颜色探针的摩尔比均为1:2:4，如标记FAM的三种探针的浓度比为15nM:30nM:60nM)依次通过液滴微流控装置封装在50μm的液滴中，置于恒温箱中反应，用荧光共聚焦显微镜检测空白对照组(加入等体积的磷酸缓冲液代替菌液)以及反应前后液滴中混合菌液荧光强度的变化用于构建标准液滴条形码文库。
九种细菌特异性的探针的序列与所述ssDNA2的基因序列一致，如SEQ ID NO.1-9所示：
MRSA：HS-TTTTTTTTTTTTAACCGAGTCGGGGT-FAM(SEQ ID NO.1)
P.aeruginosa：HS-TTTTTTTTTTCCTGCTTCCTTTCTTG-FAM(SEQ ID NO.2)
E.coli:HS-TTTTTTTTTTAGTGCACCTGCGGTCC-FAM(SEQ ID NO.3)
Listeria:HS-TTTTTTTTTTCTGTGTTTTCGGGTGC-AMCA(SEQ ID NO.4)
S.epidermidis:HS-TTTTTTTTTTGGAAGTTCTGCGTTAT-AMCA(SEQ ID NO.5)
S.typhimurim:HS-TTTTTTTTTTCTTGACATTATGACTG-AMCA(SEQ ID NO.6)
L.acidophilus:HS-TTTTTTTTTTCTCTGCATTCTGTGTG-TEXAD RED(SEQ ID NO.7)
Bacillus:HS-TTTTTTTTTTTGGTGTTGGCTCCCGTATC-TEXAD RED(SEQ ID NO.8)
Shigella:HS-TTTTTTTTTTTGTATAGTCCTGTGTGC-TEXAD RED(SEQ ID NO.9)
其中，所述恒温箱的温度36-38℃；优选地，为37℃。
其中，所述反应的时间为3-6h；优选地，为4h。
其中，将不同种类的细菌混合物和其特异性的探针依次封装在液滴中，具体为：以MRSA、P.aeru和E.coli三种细菌为例，将MRSA+P.aeru,P.aeru+E.coli,MRSA+E.coli,和MRSA+P.aeru+E.coli和其特异性的探针以及反应混合物混合依次封装在直径50μm的液滴中(液滴中MRSA终浓度为15nM，P.aeru终浓度为30nM，E.coli终浓度为60nM)。
本发明中，用荧光共聚焦检测液滴中的荧光强度，具体为：将10μl的液滴滴于载玻片上，并敷在其表面覆盖一个新的载玻片，使得观测到的液滴为单层液滴，通过切换三种滤光片(红、绿、蓝)，分别记录三种通道下的荧光强度，并与标准文库条形码比对，确定液滴中待测菌液的荧光强度。
本发明中，所述目标细菌为MRSA、P.aeru、E.coli、S.epidermidis、Listeria、S.typhimurim、L.acidophilus、Bacillus和Shigella。
本发明还提出了一种标准液滴条形码文库的制备方法，包括如下步骤：
(1)荧光素修饰ssDNA2
将荧光素与ssDNA2混合，得到荧光素修饰的ssDNA2；
(2)构建细菌特异性响应的探针
将荧光素修饰的ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料混合，调节pH，然后静置、离心，得到细菌特异性响应的探针，然后测定探针的浓度，构建标准液滴条形码文库。
步骤(1)中，所述荧光素选自AMCA、FAM、Texas Red等中的一种。
步骤(1)中，所述ssDNA2的基因序列如SEQ ID NO.1-9所示：
MRSA：HS-TTTTTTTTTTTTAACCGAGTCGGGGT-FAM(SEQ ID NO.1)
P.aeruginosa：HS-TTTTTTTTTTCCTGCTTCCTTTCTTG-FAM(SEQ ID NO.2)
E.coli:HS-TTTTTTTTTTAGTGCACCTGCGGTCC-FAM(SEQ ID NO.3)
S.epidermidis:HS-TTTTTTTTTTGGAAGTTCTGCGTTAT-AMCA(SEQ ID NO.4)
Listeria:HS-TTTTTTTTTTCTGTGTTTTCGGGTGC-AMCA(SEQ ID NO.5)
S.typhimurim:HS-TTTTTTTTTTCTTGACATTATGACTG-AMCA(SEQ ID NO.6)
L.acidophilus:HS-TTTTTTTTTTCTCTGCATTCTGTGTG-TEXAD RED(SEQ ID NO.7)
Bacillus:HS-TTTTTTTTTTTGGTGTTGGCTCCCGTATC-TEXAD RED(SEQ ID NO.8)
Shigella:HS-TTTTTTTTTTTGTATAGTCCTGTGTGC-TEXAD RED(SEQ ID NO.9)
步骤(1)中，所述ssDNA2与荧光素的用量比根据实际情况确定。
步骤(2)中，所述pH＝3-4；优选地，为pH＝3.4。
步骤(2)中，所述pH用柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐等中的一种或多种进行调节；优选地，为柠檬酸盐。
步骤(2)中，所述ssDNA2与对荧光基团起猝灭作用的材料的摩尔比为(100-150):1；优选地，为150:1。
步骤(2)中，所述对荧光基团起猝灭作用的材料选自金球(AuNPs)、碳纳米管、石墨烯二维材料等中的一种或多种；优选地，为金球(AuNPs)。
其中，所述金球的直径为10-18nm；优选地，为13nm。
步骤(2)中，所述静置优选为避光静置。
其中，所述静置的时间为12-18min；优选地，为15min。
步骤(2)中，所述离心机的转速为9000-12000r；优选地，为10000r。
步骤(2)中，所述离心的时间为13-18min；优选地，为15min。
本发明还提出了由上述方法制备得到的标准液滴条形码文库。
本发明还提出了所述的标准液滴条形码文库在检测细菌中的应用。
基于上述方法，本发明将标记有荧光素的探针按照一定的比例混合构建的标准文库溶液和待测细菌混合后封装在液滴中，恒温孵育后，aptamer会与细菌结合同时释放靶标链，靶标链随后与探针链结合，在核酸机器人的作用下，ssDNA1会在探针上发生酶切反应，引起信号循环放大，释放荧光素带待测溶液体系中，使得待测溶液的整体荧光强度增强，通过测定液滴中的荧光强度并与标准文库进行比对分析，可以超灵敏、高通量的检测不同种类的细菌。
本发明首次用酶切信号循环放大法加液滴微流控技术用于细菌的检测。传统的荧光方法只能识别单种细菌，而液滴微流控技术虽然能实现细菌高通量检测，但是往往需要核酸分析技术，如核酸的提取，PCR放大等技术，费时费力，技术要求高。
本发明方法通过将探针按照一定的摩尔比构建的标准文库溶液和待测菌液封装在液滴中，通过对细菌进行荧光编码，在核酸机器人的作用下，可实现对待测菌液的超灵敏、高通量检测。该类基于核酸机器人的液滴条形码方法，包括但不限于上述九种细菌的检测，通过选择对其他细菌特异性响应的aptamer，也可实现对其他细菌的特异性检测。通过检测液滴中待测溶液反应前后的荧光强度变化来确定待测菌液中的细菌种类，灵敏度高，无需对样品预处理或预富集，而且可实现高通量检测。整个检测过程简单，特异性好，灵敏度高，可实现混合细菌检测，整个检测流程可在5h内完成。
附图说明
图1为单个探针上的核酸机器人诱导的信号循环放大原理图以及单个探针粒子上的荧光强度随时间的变化情况。
图2为核酸机器人诱导的信号循环放大用于超灵敏细菌检测。
图3为多色液滴条形码用于细菌检测可行性研究，图3a为三种探针的荧光强度；图3b为液滴中三种细菌的动力学曲线，其中，P.aeru的动力学曲线为y＝3·10-8-4·10-5x2+0.0119x-2.21，R2＝0.99；MRSA的动力学曲线为y＝3·10-8-4·10-5x2+0.0119x-2.19，R2＝0.99；E.coli的动力学曲线为y＝3·10-8-4·10-5x2+0.02x-2.32，R2＝0.99。
图4为荧光强度和多色编码的液滴用于构建标准文库，图4a表示用颜色和强度编码的液滴用于细菌超高通量检测；图4b表示用颜色和强度编码的液滴的分析结果；图4c表示含有不同种类细菌所对应的不同的荧光强度。
图5为荧光强度和多色编码的液滴用于混合细菌检测。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公共常识，本发明没有特别限制内容。
以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1MRSA、P.aeru、E.coli、S.epidermidis、Listeria、S.typhimurim、L.acidophilus、Bacillus和Shigella的检测
下面以MRSA、P.aeru、E.coli、S.epidermidis、Listeria、S.typhimurim、L.acidophilus、Bacillus和Shigella的检测为例，对本发明方法进行详细的说明。
一、方法
1.荧光探针的制备
荧光探针的制备采用一种新型的方法制备，传统的巯基修饰的DNA连接在金球表面采用盐老化方法，往往需要一到两天的时间，费时费力。本发明通过直接加入一定浓度的柠檬酸盐，控制溶液中的PH＝3，从而减弱AuNPs与SH-DNA之间的静电斥力，增强SH-DNA与AuNPs的结合机率。具体而言，将4μl巯基修饰的ssDNA2与40μl的AuNPs(60nM)混合，加入4.88μl的柠檬酸盐(500mM,PH＝3)并快速涡旋2min。并使得柠檬酸盐的终浓度为50mM。避光静置15min后，在转速10000r下离心十分钟，弃去上清液，用磷酸缓冲液(PH＝7.4)清洗三次。最后用磷酸缓冲液重新分散，至于4℃冰箱中储存。
2.基于核酸机器人的信号循环放大可行性研究
为了验证本发明的探针在EXOⅢ的酶切作用下会逐步释放荧光素到反应体系中，导致反应溶液整体荧光强度增强，本发明采用倒置荧光显微镜对单个探针表面的的酶切过程进行研究。具体来讲，取100μl探针、50μl MRSA菌液(4×108CFU/ml)、30ul双链DNA(ssDNA1+aptamer)、2μl EXOⅢ以及20μl 10×buffer，混合均匀后稀释1000倍，取少量稀释后反应混合物于载玻片上，在37℃恒温箱中静置15min，倒置荧光显微镜自动聚焦于载破片表面，这里本发明采用100×油镜和488nm激光器。每30秒记录一次荧光强度变化，最后得到的每帧图片通过ImageJ软件来处理。
3.基于核酸机器人的信号循环放大用于细菌的超灵敏检测
为了从宏观上验证基于核酸机器人的信号循环放大可用于细菌的超灵敏检测，本发明以MRSA的检测为例，将经过液体培养基培养的高浓度MRSA离心清洗三次，用磷酸缓冲液重新分散，通过梯度稀释后得到各个稀释度的细菌悬液。取100μl探针(30nM)九份，依次分别向其中加入50μl不同浓度梯度的菌液，30ul双链DNA(ssDNA1+aptamer)，2μl EXOⅢ以及20μl 10×buffer，控制反应体系中EXOⅢ的终浓度为20U/L以及梯度稀释的菌液终浓度分别为0,1,10,102,103,104,105,106,107,和108CFU/ml。用荧光光谱仪测定反应混合物的初始荧光强度后将反应混合物置于37℃恒温箱中孵育4h，用荧光光谱仪测定反应混合物荧光强度。
4.多色液滴条形码用于细菌检测可行性研究
在验证了基于核酸机器人的酶切信号循环放大可实现细菌的超灵敏检测后，本发明将三种不同颜色的探针(三种探针的终浓度为15nM)和三种细菌(MRSA、P.aeru、E.coli，终浓度为108CFU/ml)按照本发明步骤2中的反应物用量封装在液滴中，恒温孵育后，用荧光共聚焦显微镜测定液滴中三种探针的荧光强度，用于验证基于液滴的核酸机器人能否实现单种细菌和混合细菌的检测。
5.荧光强度和多色编码的液滴用于构建标准文库
为了进一步提高细菌检测的通量，本发明对不同种类的细菌进行荧光强度编码，具体而言，本发明希望通过精准的控制每种细菌所对应的探针的数目，从而精准的控制每种细菌所对应的荧光强度，单种颜色的探针总共可以产生2n-1(n为细菌的种类)中组合方式，以MRSA、P.aeru和E.coli为例，三种细菌标记的荧光素都为绿色，令MRSA所对应的探针(终浓度为15nM)产生的荧光强度定为1，P.aeru所对应的探针(终浓度为30nM)产生的荧光强度定位2，E.coli所对应的探针((终浓度为60nM)产生的荧光强度定为4，三种不同的细菌可以产生7种不同的组合方式，有望大大提高了细菌检测通量。
6.荧光强度和多色编码的液滴用于混合细菌检测
在成功构建了标准液滴条形码文库后，本发明将此方法用于混合细菌检测，通过将混合细菌与本发明的标准文库溶液按照一定的体积比混合，然后封装在直径50μm的液滴中，恒温于37℃孵育4h后，用荧光共聚焦显微镜观测液滴中三个通道(蓝、绿、红)的荧光强度，然后与标准文库进行比例分析，用于确定液滴中的细菌种类。
二、结果
1.荧光探针的表征及浓度测定
与传统的盐老化方法相比，本发明采用的通过加入柠檬酸盐调控PH的方法来增强ssDNA与AuNPs的结合机率，这种方法可以实现快速的探针制备，适用于实际生活中细菌的快速检测。
2.基于核酸机器人的信号循环放大可行性研究
为了从单分子水平上揭示本发明的方法确实可以实现荧光强度的增强，本发明通过用倒置荧光显微镜观察单个探针上的荧光强度变化。原理图如图1a所示，在EXOⅢ的剪切作用下，在单个探针上发生随机的核酸机器人，探针上的荧光素被逐步剪切下来，金球对荧光素的猝灭作用减弱，从而导致溶液中的整体荧光强度增强。实验结果如图1b所示，随着时间的变化，探针上的荧光素逐渐变少，因此探针上的荧光强度逐渐减弱，说明基于核酸机器人的酶切反应可以实现信号的循环放大。
3.基于核酸机器人的信号循环放大用于细菌的超灵敏检测
将菌液投入反应体系中，探针在核酸机器人的作用下逐步释放荧光素到反应体系中，使得反应体系的整体荧光强度增强，通过检测反应前后荧光强度的变化，可实现超灵敏的MRSA检测。为了验证本发明的方法所能检测的最低菌液数目，本发明选取了一系列不同浓度梯度的菌液，如图2所示，本发明发现该方法可以实现单个细菌检测，证明了基于核酸机器人的信号循环放大可实现细菌的超灵敏检测。本发明选取了一系列不同数目的细菌(0,1,10,102,103,104,105,106,107,和108CFU/ml)50μl，并分别与等体积的反应混合物(100μl探针(30nM)，30ul双链DNA(ssDNA1+aptamer)，2μl EXOⅢ以及20μl 10×buffer)混合，恒恒温孵育后，用荧光光谱仪测定反应前后的荧光强度，如图2所示，我们的方法可以灵敏的实现单细菌检测。
4.多色液滴条形码用于细菌检测可行性研究
在验证了基于核酸机器人的酶切信号循环放大可实现细菌的超灵敏检测后，本发明将三种不同的探针(三种探针终浓度为15nM)和三种细菌(MRSA、P.aeru、E.coli，三种细菌终浓度为108CFU/ml)按照步骤2中的反应物用量封装在液滴中，恒温孵育后，用荧光共聚焦显微镜测定液滴中三种探针的荧光强度，如图3a所示，多色液滴用于指示细菌分析结果，每种颜色代表一种细菌(与P.aeru对应的为蓝色荧光编码的液滴，与MRSA对应的为绿色荧光编码的液滴，与E.coli对应的为红色荧光编码的液滴)，荧光编码的液滴从左到右依次代表不同细菌组合(MRSA,P.aeru,E.coli,MRSA+P.aeru,P.aeru+E.coli,MRSA+E.coli,andMRSA+P.aeru+E.coli)，结果验证了基于核酸机器人的荧光编码的液滴可以实现单种细菌和混合细菌的检测。图3b为液滴中三种细菌的动力学曲线，整个信号放大过程可在四小时左右完成，加上探针制备时间等，本发明整个检测过程可在六小时内完成，大大优于传统细菌检测方法(传统检测时间一般超过24小时)。
5.荧光强度和多色编码的液滴用于构建标准文库
本发明通过对不同种类的细菌进行荧光强度编码，精准的控制每种细菌所对应的探针的数目，实现了精准的控制每种细菌所对应的荧光强度，单种颜色的探针总共可以产生2n-1(n为细菌的种类)中组合方式，以MRSA、P.aeru和E.coli为例，令MRSA所对应的探针(终浓度为15nM)产生的荧光强度定为1，P.aeru所对应的探针(终浓度为30nM)产生的荧光强度定为2，E.coli所对应的探针(终浓度为60nM)产生的荧光强度定为4，三种不同的细菌可以产生7种不同的组合方式，大大提高了细菌检测通量，基于相似的原理，我们通过对S.epidermidis(终浓度为15nM)、Listeria(终浓度为30nM)和S.typhimurim(终浓度为60nM)进行蓝色荧光强度编码，三种不同的细菌可以产生7种不同的组合方式，同样的通过对L.acidophilus(终浓度为15nM)、Bacillus(终浓度为30nM)和Shigella(终浓度为60nM)进行红色荧光强度编码，三种不同的细菌也可以产生7种不同的组合方式，九种细菌总共可以511中细菌组合。如图4a所示，示意图表示用颜色和强度编码的液滴用于细菌超高通量检测，用彩色的球表示荧光强度水平，n表示细菌的种类。2n-1表示强度级别的个数。图4b表示用颜色和强度编码的液滴的分析结果。图4c表示含有不同种类细菌所对应的不同的荧光强度。分析结果表示本发明成功通过颜色和强度编码的液滴构建了一个标准的文库。
6.荧光强度和多色编码的液滴用于混合细菌检测
本发明有选择地列出了20种混合细菌，如图5所示，本发明给出了20种混合细菌所对应的液滴的荧光图像以及所对应的荧光强度和液滴条形码。通过使用三种染料(AMCA,FAM,Texas red)和不同强度级别(1-7,0代表背景荧光)，本发明可以对511种细菌组合进行分析。例如液滴的荧光标记为111条形码代表蓝，绿，红三个通道的荧光强度为1，此条形码代表的细菌组合为S.epidermidis+MRSA+L.acidophilus。值得指出的是，增加强度级别和/或颜色的数量可以进一步提高检测通量。在建立的颜色强度编码条码库的基础上，利用这种基于颜色强度编码条码的细菌分析方法，不仅大大简化了检测过程，而且提高了细菌的检测通量(本发明的高通量体现在可实现对多重细菌混合物的鉴定，如图5所示)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种细菌的检测方法
<160> 36
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt ttaaccgagt cggggt 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttttttt cctgcttcct ttcttg 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttttttttt agtgcacctg cggtcc 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttttttttt ggaagttctg cgttat 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttttttttt ctgtgttttc gggtgc 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tttttttttt cttgacatta tgactg 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tttttttttt ctctgcattc tgtgtg 26
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tttttttttt tggtgttggc tcccgtatc 29
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttttttttt tgtatagtcc tgtgtgc 27
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agcaatccct ttctttgtat taaccgagtc ggggtttttt 40
<210> 11
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caagaaagga agcagggacg aaacgaacaa aagcgaaagg aaaagcgaaa gcaacggggg 60
ttttt 65
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cctggcgtcc acgtgacccg ctgcagagac ccacaccaca ttttt 45
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ataacgcaga acttccggca ctctgagtgc cacgtgagag ggcgcttttt 50
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcacccgaaa acacagtaag aatcgaaaac ggaacacaga 40
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcaccgccaa ggatgttccc gccttgtatt gattaactct tttt 44
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cacacagaat gcagagatat tactatgttg aagggctatt ttt 43
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gatacgggag ccaacaccac ctggtcccca tgttagtggc cagagcaggt gtgacggatt 60
ttt 63
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggcacacagg actatacagt gttgcagtgt tgctgttcga catgaggggg cccattttt 59
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
accccgactc ggttaataca aataaaggga ttgctttttt 40
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccccgttgc tttcgctttt cctttcgctt ttgttcgttt cgtccctgct tcctttcttg 60
ttttt 65
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggaccgcagg tgcactgggc gacgtctctg ggtgtggtgt ttttt 45
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcgccctctc acgtggcact cagagtgccg gaagttctgc gttatttttt 50
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tctgtgttcc gttttcgatt cttactgtgt tttcgggtgc 40
<210> 24
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gagttaatca atacaaggcg ggaacatcct tggcggtgct tttt 44
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tagcccttca acatagtaat atctctgcat tctgtgtgtt ttt 43
<210> 26
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
catccgtcac acctgctctg gccactaaca tggggaccag gtggtgttgg ctcccgtatt 60
ttt 63
<210> 27
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgggccccct catgtcgaac agcaacactg caacactgta tagtcctgtg tgccttttt 59
<210> 28
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
accccgactc ggttaataca aataaaggga ttgctttttt agcaatccct ttctttgtat 60
taaccgagtc ggggtttttt 80
<210> 29
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
cccccgttgc tttcgctttt cctttcgctt ttgttcgttt cgtccctgct tcctttcttg 60
tttttcaaga aaggaagcag ggacgaaacg aacaaaagcg aaaggaaaag cgaaagcaac 120
gggggttttt 130
<210> 30
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggaccgcagg tgcactgggc gacgtctctg ggtgtggtgt tttttcctgg cgtccacgtg 60
acccgctgca gagacccaca ccacattttt 90
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gcgccctctc acgtggcact cagagtgccg gaagttctgc gttatttttt ataacgcaga 60
acttccggca ctctgagtgc cacgtgagag ggcgcttttt 100
<210> 32
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tctgtgttcc gttttcgatt cttactgtgt tttcgggtgc gcacccgaaa acacagtaag 60
aatcgaaaac ggaacacaga 80
<210> 33
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gagttaatca atacaaggcg ggaacatcct tggcggtgct ttttgcaccg ccaaggatgt 60
tcccgccttg tattgattaa ctcttttt 88
<210> 34
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tagcccttca acatagtaat atctctgcat tctgtgtgtt tttcacacag aatgcagaga 60
tattactatg ttgaagggct attttt 86
<210> 35
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
catccgtcac acctgctctg gccactaaca tggggaccag gtggtgttgg ctcccgtatt 60
tttgatacgg gagccaacac cacctggtcc ccatgttagt ggccagagca ggtgtgacgg 120
attttt 126
<210> 36
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tgggccccct catgtcgaac agcaacactg caacactgta tagtcctgtg tgcctttttg 60
gcacacagga ctatacagtg ttgcagtgtt gctgttcgac atgagggggc ccattttt 118
