一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒。
背景技术
肿瘤抗原是指由肿瘤细胞制造的一种具有免疫原性的物质，能够激发宿主机体的免疫应答。由于机体的自身耐受作用，机体内一般正常存在的蛋白物质不具有抗原性。但未经免疫耐受的蛋白就会激发免疫应答，这类蛋白可以是机体内存在的正常蛋白，包括隔离于免疫系统之外的隐蔽抗原、极低量存在的蛋白或仅在特定发育阶段存在的蛋白，也可以是由于突变造成结构异常的蛋白。肿瘤抗原通常来源于病毒蛋白、或突变导致的结构异常蛋白、或者在肿瘤中过度或异常表达的正常蛋白。肿瘤抗原是识别肿瘤的重要标志物，同时也是潜在的治疗靶点，因此，肿瘤抗原的检测和鉴定对于肿瘤的诊断、治疗和预后都具有重要的意义。肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。一些肿瘤相关抗原在正常组织中也存在，只是在肿瘤组织中高表达；而肿瘤特异性抗原一般是分子量较小的多肽，仅在肿瘤组织中表达，而正常组织中不表达。
肿瘤细胞具有高度异质性，无论是表型还是分子特征，不同患者之间、同一患者的肿瘤原发灶和转移灶之间、甚至同一肿瘤病灶的不同亚克隆之间，均存在很强的肿瘤异质性，因而可作为治疗靶点的肿瘤抗原也呈现高度异质性。因此目前靶向肿瘤抗原的免疫治疗的开发，均具有个体化、多靶点、特异性的特点，也亟需高通量、高灵敏度及高覆盖度的肿瘤抗原的检测和鉴定方法。
病毒抗原、癌睾抗原、组织特异性肿瘤抗原、肿瘤过表达抗原等目前在蛋白层面有相对成熟的检测和鉴定方法，主要基于酶联免疫吸附测定(ELISA)、抗体芯片等，这些方法通量低、且检测范围受限于已有抗体的抗原。
发明内容
为了解决目前技术上对肿瘤抗原的检测和鉴定的缺陷，本发明的目的是提供一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒，尤其是一种全面、高效、便捷、可适用于多癌种的检测(高通量测序法)鉴定肿瘤抗原的引物及试剂盒。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物，所述引物为用于肿瘤抗原基因的PCR扩增引物和用于看家基因的PCR扩增引物；
其中，所述肿瘤抗原基因包括MAGEC1,SSX1,MAGEC2,GAGE1,MAGEA1,MAGEA10,MAGEA3,MAGEA4,CTAG1B,SYCP1,SSX2,SSX4,DDX43,MAGEA2,MAGEA5,MAGEA6,PAGE4,SPANXB1,TPTE,GAGE10,GAGE12J,GAGE2A,CTAG2,MAGEA12,MLANA,XAGE1B,SPANXC,SSX5,MAGEB1,MAGEB2,MUC1,TERT,CEACAM5,KDR,GAST,WT1,KIF20A,CAP1,NBR1,MSLN,LUZP4,CTAG1A,SSX2B,SSX4B,CT45A1,DDX53,CTAGE1,FATE1,ACRBP,KDM5B,BAGE2,GAGE12F,GAGE12I,GAGE13,GAGE2E,GAGE2C,XAGE1A和BAGE中一个或两个以上；
所述看家基因包括JUN,LRP1,MRPL13,HMBS和TBP中的一个或两个以上。
根据本发明所述的引物，其中作为一种选择，所述用于肿瘤抗原基因的PCR扩增引物包括以下58对引物中的一对或两对以上：
针对GAGE12F扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
针对CT45A1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
针对SPANXC扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
针对GAGE12J扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
针对BAGE扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
针对DDX43扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
针对GAGE2C扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
针对GAGE13扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
针对NBR1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
针对CTAGE1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
针对MAGEA1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
针对CAP1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
针对PAGE4扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.25所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
针对MAGEC1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.27所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
针对SPANXB1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；
针对FATE1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；
针对MAGEA3扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.37所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；
针对ACRBP扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.39所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；
针对SSX2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.41所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；
针对GAGE10扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.43所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；
针对MUC1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.47所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；
针对SSX5扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.49所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；
针对MAGEC2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.53所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.54所示；
针对SSX2B扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.55所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.56所示；
针对XAGE1A扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.57所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.58所示；
针对DDX53扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.59所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.60所示；
针对GAST扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.61所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示；
针对MSLN扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.63所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示；
针对GAGE2E扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.65所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示；
针对MAGEB2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.67所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示；
针对SSX4扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.69所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.70所示；
针对CTAG1A扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.71所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.72所示；
针对LUZP4扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.73所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.74所示；
针对MAGEA12扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.75所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.76所示；
针对MAGEA10扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.77所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.78所示；
针对BAGE2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.79所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.80所示；
针对GAGE12I扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.81所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示；
针对MAGEA5扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.85所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；
针对GAGE2A扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.87所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.88所示；
针对MAGEB1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.89所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示；
针对WT1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.91所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.92所示；
针对TPTE扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.93所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.94所示；
针对SSX4B扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.95所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.96所示；
针对KIF20A扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.97所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.98所示；
针对GAGE1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.99所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.100所示；
针对MAGEA6扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.101所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.102所示；
针对MAGEA2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.103所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.104所示；
针对CTAG1B扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.105所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.106所示；
针对KDM5B扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.107所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.108所示；
针对CTAG2扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.109所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.110所示；
针对TERT扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.111所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.112所示；
针对CEACAM5扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.113所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.114所示；
针对SYCP1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.115所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.116所示；
针对KDR扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.117所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.118所示；
针对XAGE1B扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.119所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.120所示；
针对MAGEA4扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.121所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.122所示；
针对MLANA扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.123所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.124所示；
针对SSX1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.125所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.126所示；
所述用于看家基因的PCR扩增引物包括以下5对引物中的一对或两对以上：
针对TBP扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；
针对JUN扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
针对HMBS扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.45所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；
针对LRP1扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.51所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示；
针对MRPL13扩增的引物对，所述引物对包括正向引物：其核苷酸序列如SEQ IDNO.83所示，负向引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
具体地，本发明所述的引物涉及58个人类肿瘤相关抗原(Tumor-associatedantigen，TAA)基因和5个看家基因，具体为：MAGEC1,SSX1,MAGEC2,GAGE1,MAGEA1,MAGEA10,MAGEA3,MAGEA4,CTAG1B,SYCP1,SSX2,SSX4,DDX43,MAGEA2,MAGEA5,MAGEA6,PAGE4,SPANXB1,TPTE,GAGE10,GAGE12J,GAGE2A,CTAG2,MAGEA12,MLANA,XAGE1B,SPANXC,SSX5,MAGEB1,MAGEB2,MUC1,TERT,CEACAM5,KDR,GAST,WT1,KIF20A,CAP1,NBR1,MSLN,LU ZP4,CTAG1A,SSX2B,SSX4B,CT45A1,DDX53,CTAGE1,FATE1,ACRBP,KDM5B,BAG E2,GAGE12F,GAGE12I,GAGE13,GAGE2E,GAGE2C,XAGE1A,JUN,LRP1,MRPL13,H MBS,TBP和BAGE。对应的引物序列见表1所示。
表1引物序列
本发明还提供一种基于高通量测序的肿瘤抗原表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括本发明上述的全部或部分所述的引物。
根据本发明所述的试剂盒，其中作为一种选择，所述试剂盒还包括文库引物混合液、HIFI PCR混合液、FuPa试剂、连接缓冲液、DNA连接酶、HIFI酶混合液、DNA PCR引物混合液、洗脱缓冲液、逆转录酶、逆转录缓冲液、接头、标签、文库纯化磁珠和RNA阳性对照。试剂盒中的主要组成成分及其规格为下表2所示：
表2试剂盒组成成分(50次检测)
本发明试剂盒涉及的文库引物混合液为本领域常规试剂，在此不做特别限定。
上表中DNA PCR引物混合液即用于目的片段扩增。DNA PCR引物混合液即将本发明所述的引物溶解于LOW TE中，DNA PCR引物混合液中扩增引物的浓度为2000-6000ng/uL。
本发明所述的RNA阳性对照属于本领域公知的概念，就本发明而言，所述RNA阳性对照，亦即RNA阳性质控品，是含有本发明试剂盒要检测的基因扩增子序列。
本发明还提供了一种基于高通量测序法的肿瘤抗原基因文库的制备方法，包括以下步骤：
1)获取样本核酸，所述核酸是cDNA或RNA，若核酸为RNA则先将其进行反转录为cDNA；
2)制备基因文库：
2-1)多重PCR：将步骤(1)所获得的cDNA采用包括DNA PCR引物混合液的PCR反应体系进行PCR扩增，获得cDNA PCR扩增产物，其中，PCR扩增引物为权利要求1或2所述的引物；
2-2)消化部分引物序列：将步骤1)所获得的cDNA PCR扩增产物，采用FuPa试剂消化，获得消化后的目标产物；
2-3)连接接头和标签：接下来将经过FuPa试剂消化的目标产物进行连接接头和标签；
2-4)片段筛选：接下来采用磁珠进行纯化做核酸片段筛选得到片段集中的DNA，将HiFi酶混合液和文库引物混合液混合均匀，进行洗脱；
2-5)文库扩增：接下来将连接了接头和标签的DNA进行PCR扩增；
2-6)扩增文库纯化：将PCR扩增后的产物采用磁珠进行纯化筛选，获得基因文库。
进一步地，根据本发明所述的制备方法，还可以包括步骤3)，利用步骤2-6)获得基因文库，进行的人肿瘤抗原的表达检测与鉴定。
本发明还提供了上述引物在制备人肿瘤抗原的表达检测与鉴定产品中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在人肿瘤抗原的表达检测与鉴定中的应用。
进一步作为一种选择，本发明的基于高通量测序法的肿瘤抗原基因文库的制备方法，包括以下步骤：
1.对肝癌、胰腺癌、结直肠癌和肺癌相关抗原进行文献调研，归纳总结出临床作为免疫治疗靶点的肿瘤抗原，并提取各个抗原的mRNA序列(如表1所示)。
2.对肿瘤抗原mRNA序列进行分析，设计出各个肿瘤抗原的特异性引物(如表1所示)，并利用人基因组和转录组和基因组进行验证，确保扩增中无非特异性引物的产生。
3.检测模板的获得：
1)样本采集：肿瘤组织、肿瘤细胞、外周血、胸水、腹水、尿液、粪便等任意可能携带肿瘤细胞来源RNA的肿瘤患者人体来源样本；
2)RNA的获取：对肿瘤组织RNA、肿瘤单细胞悬液RNA、循环肿瘤细胞RNA(CTC-RNA)、体液游离RNA(cfRNA)、外泌体中RNA(exoRNA)等任意不同形式存在于人体组织、器官、细胞、亚细胞结构及体液中的RNA完成纯化、提取；
3)总RNA转录为cDNA：
I.将去除核糖体RNA后的总RNA(全RNA进行逆转录对于来源非编码区的肿瘤抗原的鉴定尤为重要)进行逆转录浓度的调整(起始质量为10ng-100ng之间)，具体是DV200％<30％的样本，逆转录起始量为50-100ng(浓度允许尽量高)；对于DV200>30％的样本，起始转录量为10-50ng。注：通常高质量RNA样本的文库产量会高于低质量的RNA的文库产量，为确保文库质量，起始逆转录的RNA量可相应调整；
II.在无RNA酶的环境中进行逆转录反应，反应体系由逆转录酶、逆转录引物、核苷酸底物、反应缓冲液、总RNA模板、无核苷酸酶的纯水组成。
4.多重PCR引物组合扩增靶序列
1)上述cDNA文库为模板，用于后续靶序列的多重PCR扩增；
2)低温环境中混合和准备cDNA的靶序列扩增反应体系，包括cDNA模板、多重PCR引物组合、DNA连接酶、核苷酸底物、反应缓冲液、无核苷酸酶的纯水组织。多重PCR引物组合根据检测需要，以一个或几个引物池的形式实现，相应的，反应体系也分为一个或几个反应体系进行；
PCR仪上进行上述体系的运行，包括DNA连接酶激活、cDNA链变性、退火、延伸的各个步骤，完成靶序列的PCR扩增反应，获得多重扩增子的文库。
3)选择性使用加长引物序列、化学修饰或磁珠标记等办法优化，以便于增加引物扩增的特异性、和/或降低引物二聚体在扩增和/或测序的步骤中的不良影响。
4)多重扩增子翻译后产生的氨基酸具有的特征是：氨基酸序列所对应的肿瘤抗原在肿瘤细胞中特异性表达或显著过表达，且该氨基酸序列为位于该肿瘤抗原的全部转录本重叠序列区，以实现对该抗原基因全部转录本的完全检测。
5)高通量测序鉴定多重扩增子：
I.多重扩增子文库中包含的扩增子序列信息及各扩增子的相对占比，即代表了患者个体化抗原在转录本层面的相对表达水平，通过NGS测序进行鉴定和分析。
II.上述多重扩增子文库，可选地通过能够特异识别化学修饰的试剂进行消化、或磁珠吸附，清除残留的多重PCR引物二聚体。
III.上述多重扩增子文库制备测序文库，包括测序接头的连接、测序文库的纯化、测序文库扩增、扩增后的第二次纯化、纯化后文库上机测序，获得基因文库。
进一步地，还可以包括步骤6)，利用步骤5)获得基因文库，进行的人肿瘤抗原的表达检测与鉴定，具体如下：
6)测序数据分析：
I.对测序得到的碱基序列进行质控：扩增子范围内reads数目大于200000条，HK(house-keeping gene)数目大于6个，有效的reads数目大于67％。
II.使用>＝100个对应组织的正常(癌旁)样本，计算出每个样本每个基因的表达量：
测序得到的碱基序列比对到扩增子序列，计算比对到HK的reads数目，并与预定的该HK的表达谱(RPM profile)进行比较，得到该HK在该样本中的倍数比值(ratio of HK)，公式如下：
Ratio of HK＝Read Count of HK/RPM Profile of HK。
按照上述方法计算全部HK的倍数变化，然后取中值，作为该样本的标准倍数比值(Normalization Ratio)，计算比对到每个基因的reads数目，并与标准倍数比值进行比较，得到该样本的每个基因的表达量，使用nRPM表示。计算公式如下：
nRPM＝Read Count of gene/Normalization Ratio。
III.按照计算出所有正常组织样本的基因表达(nRPMi)并求出平均值mean(nRPMi)以及标准偏差SD(nRPMi)，构建baseline。
IV.若待检测样本的nRPM>＝mean(nRPMi)+N*SD(nRPMi)，则判定该基因特异性表达或者显著过表达(N为2,3,4)。
本发明具有如下优势：
本发明的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒(高通量测序法)，覆盖多达58种肿瘤抗原，且特异性好，灵敏度高，检测限低，重复性好，用于检测时可以实现一次性检测和分析即可完成患者个体化的、全面的肿瘤抗原谱的鉴定，且覆盖多个肿瘤类型。
附图说明
图1为本发明实施例的个体化肿瘤抗原肽库的建立流程；
图2A为本发明实施例2的FFPE样本情况，其中，RIN值2.1，DV200 80；
图2B为本发明实施例2的FFPE样本10ngRNA起始量的文库情况；
图2C为本发明实施例2的FFPE样本20ngRNA起始量的文库情况；
图2D为本发明实施例2的FFPE样本50ngRNA起始量的文库情况；
图2E为本发明实施例2的FFPE样本的不同RNA起始量文库的Pearson相关性分析结果，其中，***p≤0.01；
图3为本发明实施例的新鲜肿瘤组织样本的批间重复性，其中，***p≤0.01；
图4A为本发明实施例4的SU-DHL肿瘤细胞系的靶序列表达水平的实时定量PCR验证；其中，横坐标是log2(NRPM+1)，纵坐标是1/△ct，***p≤0.01；
图4B为本发明实施例4的GM12878肿瘤细胞系的靶序列表达水平的实时定量PCR验证；其中，横坐标是log2(NRPM+1)，纵坐标是1/△ct，***p≤0.01；
图4C为本发明实施例4的KM肿瘤细胞系的靶序列表达水平的实时定量PCR验证；其中，横坐标是log2(NRPM+1)，纵坐标是1/△ct，***p≤0.01；
图4D为本发明实施例4的NCI-HCC781肿瘤细胞系的靶序列表达水平的实时定量PCR验证；其中，横坐标是log2(NRPM+1)，纵坐标是1/△ct，***p≤0.01；
图5为本发明实施例的肿瘤患者个体化肿瘤抗原谱。
具体实施方式
本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
高通量测序法
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等特征标志。
基因表达量Gene expression
即基因组DNA发生转录的过程及转录产物的水平。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例该方法可用于本发明，但不用来限制本发明的范围，实施例中使用的商品化试剂、耗材和仪器可依据实际操作需要使用具有同等功能的替代物。
实施例1鉴定个体化肿瘤抗原肽库的建立
使用新鲜肿瘤组织或FFPE切片鉴定个体化肿瘤抗原肽库的流程如图1所示。
1.总RNA提取
1)使用RNA提取试剂盒或者是DNA和RNA共提试剂盒进行total RNA的提取。
2)使用QubitTMRNA HS Assay Kit进行total RNA定量。
3)使用Agilent RNA 6000Pico Kit来确定RNA的完整性。
4)每次逆转录反应至少需要10ng经过Dnase处理的总RNA(≥1.43ng/μL)。对于提取浓度低的样本(浓度低于1.43ng/μL)，取最大体积(7μL)进行逆转录，建库起始量<10ng，属于高风险建库。
5)对于DV 200％<30％的样本，用50-100ng起始量进行逆转录，在浓度允许的条件下，尽量用高起始量进行逆转录，但是不需要超过100ng；对于DV 200％>30％的样本,用10-50ng起始量进行逆转录。
2.总RNA逆转录
1)如果RNA是从FFPE样本中提取，之前也并未进行过热处理，逆转录前80℃加热10min，冷却到室温。
2)如果5X逆转录缓冲液在融化后出现可见沉淀，吸取前室温条件下涡旋或吸打重悬沉淀。
3)按照以下表3反应体系表配制反应体系：
表3总RNA逆转录的反应体系
*替换等量的无核酸酶纯水以制备非模板对照(non-template control(NTC))。
4)充分涡旋混匀，离心收集液体到管底或通过吸打混匀。
5)将反应管放在PCR仪上，运行以下表4反应程序：
表4总RNA逆转录的反应程序
6)安全停止点：样品可在PCR仪中4℃保持16hr。若不继续实验，合成的PCR产物置于4℃冰箱保存。
7)反应结束后，充分离心，将液体收集到管底，继续下一步。
3.多重PCR引物组合扩增靶序列
1)将含有cDNA的反应管放在冰上。
2)冰上融化5X HiFi酶混合液，轻柔涡旋并离心收集。
3)在反应管内加入以下表5组分及表1的63组引物，可以按照提前准备一个多反应的master mix:
表5多重PCR引物组合扩增反应组分
4)将混合后的反应体系充分涡旋离心或吸打混匀。
5)将混合后的反应管放在PCR仪上运行以下表6的反应程序：
表6多重PCR引物组合扩增反应程序
6)反应结束后将反应管离心收集液体到管底，扩增的PCR产物置于-20℃冰箱保存。
4.部分消化扩增引物序列
1)反应管放在冰上准备接下来的反应。
2)将FuPa试剂放在冰上，轻柔涡旋混匀，离心收集。
3)小心揭开反应管的盖子，小心污染。
4)在包含有扩增产物的反应管内加入2μL FuPa试剂，总体积变为22μL。
5)扣上管盖，充分涡旋离心。
6)将反应管放在PCR仪上，运行以下表7反应程序：
表7部分消化扩增引物序列反应程序
7)反应结束后离心收集液体到管底。
5.测序接头连接
1)事先根据选择的barcode将接头和标签X按照以下表8体系进行混合稀释，取其中2μL用于后续步骤的连接反应，稀释后的接头在-20℃保存。
表8测序接头连接反应体系
*X＝所选择的标签
2)如果连接缓冲液融化中出现可视沉淀，使用前室温涡旋或吸打重悬沉淀后使用。
3)小心揭开管盖，依次加入以下表9组分，最后再加入DNA连接酶，不要事先将DNA连接酶和接头混在一起。
表9测序接头连接反应组分
4)扣上管盖，充分涡旋离心收集液体。
5)打开管盖，在反应管内加入2μL DNA连接酶。
6)扣上管盖，充分涡旋并离心。
7)将反应管放在PCR仪上，运行以下表10反应程序：
表10测序接头连接PCR反应程序
8)扩增后的样本可以在-20℃冰箱保存。
6.文库纯化
1)使用纯化试剂前需要平衡到室温并充分混匀，缓慢吸取溶液。
2)将反应管内文库离心并收集到管底，将产物转移到一个新的1.5mL管内。
3)在1.5mL反应管内加入45μL(1.5倍样本体积)文库纯化磁珠，吸打五次使磁珠充分与文库混匀。
4)室温孵育5min。
5)将反应管放在磁力架上静置2min，待液体澄清，小心吸弃液体，不要触碰磁珠。
6)在反应管内加入150μL洗脱缓冲液，清洗磁珠，吸弃液体，不要碰到磁珠。
8)重复步骤7进行第二次清洗。
9)确保吸弃所有的乙醇，将反应管在磁力架上室温晾干2-5min，不过过度干燥。
7.文库扩增
1)将反应管从磁力架上取下，加入50μL HiFi PCR缓冲液和2μL文库扩增引物混合液，可以事先将以上两种组分混合。
2)扣上管盖，充分涡旋并离心收集液体或吸打至少5次彻底混匀。
3)将反应管放在磁力架上静置至少2min，然后将约50μL体积的上清液转移到一个新的0.2ml管内。
4)将反应管放在PCR仪上，运行以下表11反应程序：
表11文库扩增PCR反应程序
5)扩增后的样本可以在-20℃冰箱保存。
8.纯化扩增文库
使用磁珠进行0.5x和1.2x共两轮纯化。
第一轮纯化：
1)将反应管离心收集液体到管底，将约50μL文库转移到1.5mL管内。
2)加入25μL磁珠到反应管内，吸打5次彻底混匀。
3)室温孵育5min。
4)将反应管放在磁力架上，静置至少5min直至液体澄清。
5)小心将上清转移到一个新的1.5mL管内，不要碰到磁珠。
6)注意：上清中含有目的扩增子，不要丢弃！
第二轮纯化：
7)将上面步骤5中的上清中加入60μL(1.2X original sample volume)的磁珠，吸打5次充分混匀。
8)室温孵育5min。
9)将反应管放在磁力架上静置至少3min，直至液体澄清，小心吸弃上清，不要碰到磁珠。
10)加入150μL新鲜配制的70％乙醇，静置30s,吸弃上清，不要触碰磁珠。
11)重复步骤4进行第二次清洗。
12)确保所有的乙醇都被吸弃，将反应管放在磁力架上室温晾干2-5min，不要过度干燥。
13)将反应管从磁力架上取下，在反应管内加入30μL(视情况而定)Low TE或水重悬磁珠。
14)充分涡旋混匀或吸打至少五次彻底混匀。
15)室温孵育2min。
16)将反应管放在磁力架上静置2min，待液体澄清。
17)将纯化好的文库上清转移到一个新的1.5mL管内准备接下来的实验。
18)Qubit定量对文库进行定量。
19)2100对文库进行质检。
实施例2FFPE样本的不同RNA起始量及批内重复
选取1例RNA提取质量较好的FFPE样本(RIN值2.1，DV200 80，图2A)，分别以10ng、20ng、50ng的总RNA起始量，进行多重PCR扩增靶序列后建库、测序，可以看到，在总RNA质量较好的情况下，总RNA低至10ng也可得到质量较好的文库(图2B-D)。每个起始量均重复建库3次，3个起始量共获得9个文库，并在同一批次完成测序。获得每个文库中靶序列表达量(nrpm)后，两两文库进行Pearson相关性分析，相关系数R均在0.9以上，一致性非常高(详见图2E)。
实施例3新鲜肿瘤细胞样本的批间重复性
选取1例新鲜样本，相同实验条件下、相同建库起始量(10ng)建库，获得3个重复文库，重复2次上机，共获得6份测序数据。获得每个文库中靶序列的表达量(nrpm)，对3个文库2次重复进行Pearson相关性分析，2次重复间相关系数均在0.99及以上，一致性极高(见图3)。
实施例4肿瘤抗原表达水平的实时定量PCR验证
选取4个肿瘤细胞系新鲜样本(分别为SU-DHL、GM12878、KM、NCI-HCC781肿瘤细胞系)，提取的RNA后，采用本发明方法建库测序，获得靶序列的RNA表达水平(NRPM)，同步采用实时定量PCR方法对43个靶序列的表达进行检测(δCt值)，两种方法检测的靶序列RNA表达水平呈现较高的一致性(图4A-D)，说明本发明能很好地完成肿瘤抗原的种类鉴定和相对定量，可作为个体化肿瘤抗原肽库制备的依据。
实施例5肿瘤患者个体化肿瘤抗原的鉴定
采集31例结直肠癌患者的FFPE结直肠癌组织样本，采用本发明方法检测每例患者的个体化肿瘤抗原谱。如图5所示，肿瘤抗原的检出个数从1-25种不等，中位检出个数是5个。
序列表
<110> 北京臻知医学科技有限责任公司
<120> 一种基于高通量测序法的肿瘤抗原表达检测引物及试剂盒
<160> 126
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggaaccagca actcaacgtc agg 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gagtgtgaag atggtcctga t 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gccaacgaga aattaatgct gatat 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
aaggacctac tgcagtcagg aagc 24
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
tggacaaaca atccagtgc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
aaaacatctg agtcctcgac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
aaccagcaac tcaacgtcag 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
gtgtgaagat ggtcctgat 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
agctggagtg ttaggagggc 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
ccctgtggtg agctggaggt tgg 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
cagtagagtc tctgcatgga gatag 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
tagaggactt gatgtccatg acgtt 25
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 13
aaccagcaac tcaacgtcag g 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 14
gactgggtgt gagtgtgaag at 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 15
tgtgaagatg gtcctgatgg 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 16
aggctgctcc tatgttgg 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 17
ctcacagact ctggaaacag t 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 18
tttaccagtt accataccag aag 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 19
cctcagctac tttatgcttc tgt 23
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 20
aatggtaagc ctagtgg 17
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 21
gcgaggtttc cattctga 18
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 22
agaggagcac caaggag 17
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 23
atacaagtgt gtcaacacga cat 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 24
gtggtgggca ttgtggagat aatc 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 25
agtgagatca agatccagag gaa 23
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 26
atattgaacc tggacaagag agag 24
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 27
tgtgagggac acatacat 18
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 28
accaccttaa gagaag 16
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 29
ataagagagc cacgaac 17
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 30
cagaagttgg gttttccagc t 21
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 31
ctgaagagga gcgtcccctg tg 22
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 32
aaaaatgaaa acatctgagt 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 33
cattgaccaa gaactgcat 19
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 34
ccttaagaac acaaagc 17
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 35
tgtccctggc agaagaactg 20
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 36
gaagcagaag ttggaac 17
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 37
gagattctcg ccctgagcaa 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 38
cagtgggtct ccattgccca gc 22
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 39
gagtctttct gccagtt 17
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 40
caaggagata gaagctt 17
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 41
agaaaacagc tggtgattta 20
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 42
gacctttcac gaacatgggc at 22
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 43
gatcgaccta tcggtcta 18
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 44
cagcaactca acgtcaggat 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 45
gctcgcatac agacggaca 19
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 46
agagaaaagc ctgtttacc 19
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 47
acctaccaca cccatg 16
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 48
ccacttctgc caacttgt 18
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 49
gcctcggaga aaatcat 17
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 50
gacttccagg ggaatgat 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 51
actttgggaa catccaac 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 52
tctctattgg acaagctac 19
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 53
acctcccacc ataga 15
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 54
cctaaagtca gcacag 16
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 55
tgatgggaaa gagctgtgc 19
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 56
gagaaaacag ctggtgat 18
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 57
gttccggcgt caaggtgaa 19
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 58
caacgcaagc tggttttata tt 22
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 59
acccaacgac aaagtcatca tgttt 25
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 60
aagagcgagc agtagaggac t 21
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 61
agcctctcat catcgaa 17
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 62
gcctatggat ggatggact 19
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 63
agatggaccg cgtgaa 16
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 64
caagatgagc cctgagg 17
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 65
aaccagcaac tcaacgtcag 20
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 66
tgtgagtgtg aagatggtcc t 21
<210> 67
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 67
acccgagcga gtgta 15
<210> 68
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 68
tccgctttgg aggcgag 17
<210> 69
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 69
gccatgaacg gagacga 17
<210> 70
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 70
atgaaatcct cggag 15
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 71
aggatgcccc accgctt 17
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 72
tccagcagct ttccctgtt 19
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 73
atagtaaaaa ggaatcgc 18
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 74
accatcccaa aaaccttct 19
<210> 75
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 75
tgactcaggt caacaca 17
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 76
ctacctgctg ccctgacc 18
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 77
ctcgttctga gggaca 16
<210> 78
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 78
ttttctacag acacagt 17
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 79
atactttttg tcttcaacga a 21
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 80
atagtgaaga aatgaaaatg tc 22
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 81
gtgaagatgg tcctgatgg 19
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 82
atgcaggctg ctcctatgtt 20
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 83
cctaaacgtc tagatgagta cacac 25
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 84
aacagtgaag tgattgaaac t 21
<210> 85
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 85
ctcaggggac aggctgacca ggatcac 27
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 86
gtgaccagag tcgtcatgtc tctt 24
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 87
cgaggaagat cgacctat 18
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 88
cagcaactca acgtcaggat 20
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 89
tggcatgttt cagtgtggt 19
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 90
tacaactcga aattctcag 19
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 91
aggctgcaat aagagatatt 20
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 92
tctcgttcag accagctc 18
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 93
gctcttgaca actatgacc 19
<210> 94
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 94
ccacagacaa gtgaatt 17
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 95
agtgccatga acggagacga 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 96
atgaaatcct cggagaaaat 20
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 97
tccctgtgca tctaccta 18
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 98
cactcgttca tcaaggaaca t 21
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 99
ccagcaactc aacgtcagg 19
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 100
gtgagtgtga agatggtcct 20
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 101
cctccttcag gttctgag 18
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 102
cctgaccaga gtcatcatgc ct 22
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 103
aagcatccag gtggagagcc tga 23
<210> 104
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 104
gtcatcatgc ctcttgagca gaggagt 27
<210> 105
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 105
aggatgcccc accgctt 17
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 106
gtctccagca gctttccct 19
<210> 107
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 107
tacttgcaaa gccaa 15
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 108
aaaactgaag agacgcct 18
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 109
gccgcttctg cgcaggatgg a 21
<210> 110
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 110
tggtccgcag gatcctgtcc cgggat 26
<210> 111
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 111
ccagccgtac atgcgacagt tcgt 24
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 112
tacgcttcat gtgccaccac gccgt 25
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 113
gcctatgtat gtggaatcca ga 22
<210> 114
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 114
tacctttcgg gagcgaacct caacct 26
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 115
gatgattttg agtttccatt tgc 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 116
ttggtaattc tgactgtcac tat 23
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 117
cttccaggga ggaaataaa 19
<210> 118
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 118
gtacaaatgt gaagcggtc 19
<210> 119
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 119
tgggttccgg cgtcaag 17
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 120
acaacgcaag ctggttttat at 22
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 121
ggttctgagc agacaggcca a 21
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 122
agagtcatca tgtcttctga gcag 24
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 123
gacagtgatc ctgggagtct t 21
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 124
cacaagaagg gtttgatcat 20
<210> 125
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 125
cgatgggaaa caactgc 17
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 126
agaaagcagc tggtgatt 18
