癌症诊断和治疗
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2011年2月23日提交的US61/445,972的权益，其以全文引用的方tt式并入本文中。tt
技术领域tt
本发明涉及使用生物标记物诊断癌症和治疗癌症的方法。tt
背景技术tt
数十年来肺癌已成为最常见的癌症，且造成世界上最大数目的癌症死亡。在2008tt年，据估计世界上有161万例新病例(总数的12.7％)且肺癌造成138万例死亡(总数tt的18.2％)。这超过了乳癌、前列腺癌和结肠直肠癌合起来的死亡率。肺癌影响吸烟者、tt曾吸烟者和不吸烟者，后一组占病例的约15％。对这一疾病的肿瘤进程和侵袭性生物行tt为的基础仍知之甚少。缺乏可用的动物模型使问题复杂化，从而难以确定疾病的生物与tt分子起源和最佳的治疗策略。tt
如同其他癌症一样，如果肺癌被及早检测到的话，那么肺癌的存活率就高得多。当tt疾病在早期、局限阶段被检测到且可用手术方式去除时，五年存活率可达到85％。但是，tt一旦癌症已扩展到其他器官，尤其扩展到远端部位，那么只有少到2％的患者存活五年。tt不幸的是，肺癌直到其已达到晚期之前通常是无症状的。由此，仅5％的肺癌在早期、tt局限阶段被发现。因此，迫切需要辅助筛查无症状人员的工具，从而可在肺癌的最早、tt最可治疗阶段检测到肺癌。tt
检测早期肺癌的潜在筛查工具是胸部X射线和计算机断层摄影(CT)扫描。然而，tt高费用和高假阳性率使得这些放射照相工具对于常规的广泛使用来说是不实用的。举例tt来说，美国国家癌症研究所(U.S.National Cancer Institute)的最新研究得出结论：使用tt胸部X射线筛查肺癌可检测到早期肺癌但产生许多假阳性测试结果，导致不必要的后续tt测试，奥肯等人，国家癌症研究所杂志，97(24)1832-1839，2005(Oken et al.，Journal of thettNational Cancer Institute，97(24)1832-1839，2005)。涉及CT扫描的进行中的试验遇到类tt似的假阳性问题。基于不确定的放射照相发现物的数目，计算出CT筛查的特异性为约tt65％。普及的CT扫描所发现的大量不确定的肺结节需要通过侵入性程序进一步研究，tt且通过CT扫描鉴别的许多肺结节是良性的，其引发了关于挽救每个生命所带来的大部tttttt分卫生保健成本的深切关注。tt
PET扫描是另一种诊断选择，但PET扫描成本高且一般不适用于筛查程序。tt
当前，年龄和吸烟史是仅有的两个被大型筛查研究用作选择标准的风险因子。可检tt测到放射照相上明显的癌症(＞0.5cm)以及隐性和恶化前癌症(低于放射照相检测限)tt的血液测试将鉴别最需要进行放射性筛查的个体，且实际上将减少需要进一步检查的良tt性肺部发现物的数目。tt
因此，显而易见的是，迫切需要克服前述放射照相技术局限性的经过改进的肺癌筛tt查和更好的检测工具。tt
除了诊断筛查肺癌之外，如果检测工具可提供最佳治疗处理的指示的话，那么其将tt具有巨大价值。对于如乳腺和结肠癌的癌症来说，对具有表皮生长因子受体(epidermalttgrowth factor receptor；EGFR)或GTPaseKRas(KRAS)突变的患者的靶向疗法已显示tt在临床试验中取得成功。这种靶向或“个体化医疗”方法可提高患者响应性，且因为治tt疗可特定针对患者作调整，所以也节约了卫生保健成本。tt
已描述了几种用于使用生物标记物诊断癌症的方法和生物标记物用于治疗适应症tt的用途。然而，这些方法中没有一种适用于有成本效益的、最低侵入性的、高预测性的tt分析手段，这些手段辅助筛查无症状人员，从而可在肺癌的最早、最可治疗阶段检测到tt肺癌。现有技术中通过在前瞻性研究中使用人类血清样本无法令人满意地解决与鉴别癌tt症标记物相关的技术问题。在前瞻性研究中，通过CT扫描筛查处于高度显现肺癌风险tt下的患者，获取样本将其库存以供测试，且追踪患者若干年以确定哪些患者显现肺癌。tt当知晓哪些患者显现肺癌时，可针对DNA或蛋白质生物标记物中的显著差异来测试来tt自那些患者的库存样本。使用这些现有技术研究的结果用于在疑似患有癌症的患者中检tt测癌症或用于筛查有风险的患者的主要问题在于，这种方法鉴别中期到后期肺癌的生物tt标记物，而所需要的是如下生物标记物：可使用最低侵入性和有成本效益的方法提供肺tt癌的早期检测；以及具有作为可在治疗上靶向的生物标记物并用作预测指示物和患者对tt疗法的响应的指示物的潜力。tt
发明内容tt
为了辅助本文所描述的本发明的发展而应克服的一个技术问题是，肺癌的生物标记tt物在人类患者中难以鉴别，因为基因和蛋白质表达的变化与肺癌的存在无关。因此，合tt适的肺癌动物模型可提供可再现的和可预测的疾病发展以及合适的阴性对照。tt
为了辅助本发明的发展而应克服的另一技术问题是鉴别特异性生物标记物，这些生tttttt物标记物在癌症患者中与非癌症患者中的数量不同。这些生物标记物在临床环境下向医tt师提供是／否的回答时极为有用，而不需要测试结果的统计分析，这些测试结果不是简单tt的临床诊断测试所能处理的。此外，在本发明中，可针对每个生物标记物鉴别临限表达tt水平，从而使得指示患者的蛋白质表达水平在临限表达水平以上或以下的(取决于所选tt择的生物标记物)的检验结果可确定是否需要额外筛查(如CT扫描)。这是优于其他方tt法的优势，其他方法使用许多蛋白质／mRNA的表达模式的复杂统计分析来计算患者患有tt癌症的可能性。tt
为了辅助本发明的发展而应克服的另一技术问题是鉴别可在癌症治疗中被靶向的tt具有已知功能的生物标记物；癌症治疗可在动物模型中进行测试。另一技术问题是确定tt一个组织中的致癌基因是否一定是不同组织中的致癌基因。tt
申请人已发现可通过包括以下的方法解决这些技术问题：使用肺癌小鼠模型鉴别癌tt症生物标记物，使用生物标记物鉴别可能患有肺癌的患者，以及使用生物标记物作为治tt疗指示物以预测患者可能响应的治疗。根据本文所描述的本发明的生物标记物或生物标tt记物衍生物可用于癌症治疗。也已发现，当这些生物标记物用作抗癌剂用于起源于除肺tt组织外的组织的肿瘤时，可获得有价值和出人意料的结果。tt
在一个方面，本发明针对用于肺癌的转基因小鼠模型(Grg1小鼠)鉴别癌症的生物tt标记物的用途和适用于治疗癌症的疗法。在本发明的这个方面的一个实施例中，Grg1tt小鼠可用于鉴别可在患者血液样本中定量测量的生物标记物并检测肺癌患者与正常对tt照样本之间的差异。tt
在另一方面，本发明针对用于使用有待确定癌症存在或不存在的患者的组织或体液tt样本早期检测肺癌的检验、方法和试剂盒。在一个实施例中，本发明涉及通过评价可呈tt现为一组生物标记物的一个或一个以上生物标记物的存在来检测肺癌。在一个实施例tt中，可在肺癌筛查策略中采用本发明，尤其当与患者(例如有患癌症风险的患者)群体tt的放射照相成像和其他筛查模式联合使用时。本发明可用于集中最可能患有癌症的群体tt用于对这些患者进行进一步放射照相分析以排除肺癌的存在。简单地说，在这个方面，tt本发明针对一种检测患者中肺癌存在的方法。tt
在一个实施例中，分析来自患者的血液样本中根据本发明的一个或一组与肺癌相关tt的蛋白质生物标记物的存在。在一个特定实施例中，本发明针对使用下文所描述的生物tt标记物对无症状患者或高风险组患者进行筛查测试，使用可接受的测试和方案尚未诊断tt出这些高风险组患者患有肺癌，也就是说，例如，这些患者没有放射照相上可检测的肺tt癌。本文所描述的本发明方法相对较便宜、侵入性最低、对癌症有高特异性，且提供高tttttt成本和低特异性的当前肺癌筛查方法(例如胸部X射线或低剂量CT)的替代方法。tt
在另一方面，本发明针对通过使用下文所描述的一个或一个以上生物标记物的状态tt预测患者对一个或一个以上药物治疗的响应来确定治疗性干预。在本发明的另一实施例tt中，生物标记物或生物标记物的类似物、同源物或片段可用于治疗癌症。tt
由此，根据本发明的这个方面，提供一种鉴别生物样本中的一个或一个以上肺肿瘤tt蛋白质生物标记物的方法。这些生物样本包括体液或组织，例如(但不限于)血液、血tt清或血浆或细胞(例如从活检体获得的那些)。所述方法包含以下步骤：在经鉴别为未tt患肺癌的个体的肺肿瘤组织之间，使用例如下文所描述和在Grg1小鼠模型中鉴别的西tt方印迹(Western blot)、蛋白质组分析、北方印迹(Northern blot)、RT-PCR、免疫检验tt来测量经鉴别的肺肿瘤蛋白质生物标记物表达；以及测量生物样本(例如来自疑似肺癌tt患者的人类血液样本)中相同的肺肿瘤蛋白质生物标记物，从而鉴别在肺癌患者中与未tt患肺癌的患者(正常或阴性对照)相比测量为不同的蛋白质生物标记物。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种含有一个或一个以上用于检测癌症(例如(但tt不限于)肺癌)的生物标记物的试剂盒。在本发明的一个实施例中，所述一个或一个以tt上生物标记物涉及格劳乔相关蛋白质(Groucho-related protein)，例如(但不限于)TLE1。tt所述试剂盒可包括附着于固体支撑物上用于测量生物标记物的表达水平的抗体，这些生tt物标记物包括(但不限于)格劳乔相关蛋白质或患者体液(如血液、血清或血浆)中的tt蛋白质。所述固体支撑物(如抗体阵列)可进一步包括来自未指示有癌症的样本的参考、tt对照或基线量的相同的一个或一个以上生物标记物，用于确定患者样本中癌症存在的可tt能性。tt
在各种实施例中，生物标记物包含格劳乔相关蛋白质、Mdm2、Ras、ErbB1、ErbB2tt或CyclinD1／D2中的一者或一者以上。为了确定患者中癌症的可能性，在本发明方法的tt另一实施例中，所述方法包含确定Mdm2、Ras、ErbB1、ErbB2或CyclinD1／D2和／或格tt劳乔相关蛋白质(例如(但不限于)TLE)中的一者或一者以上的量的定量测量值。在tt另一方面，本发明针对一种指示使用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC抑制剂)作为癌tt症患者的治疗方法的方法。在这种方法的一个实施例中，自癌症患者获取血液样本，且tt测量癌症患者中格劳乔相关蛋白质的表达并将其与来自未患癌症的患者的这种蛋白质tt的表达的参考值相比较。由这个数据，确定用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂治疗患者的有用tt性。在又一方面，本发明针对一种通过将一种或一种以上候选化学治疗药物施用于Grg1tt肺癌小鼠模型并定量比较经治疗和未经治疗的Grg1小鼠中的肺肿瘤的大小、数目和组tt织学外观来评价用于癌症治疗的药物的方法。tt
在再一方面，本发明针对一种治疗癌症的方法。在一个实施例中，所述方法使用蛋tt白质生物标记物的衍生物，如类似物、同源物或片段。举例来说，在一个实施例中，格tt劳乔相关蛋白质的Q结构域可用于治疗肺癌。在另一实施例中，格劳乔相关蛋白质或其tt类似物、同源物或片段可用于治疗结肠癌。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下步骤诊断哺乳动物中的肺癌的方tt法：提供来自哺乳动物的生物样本；提供包含一个或一个以上大分子的组，其中每个大tt分子都是在Grg1表达转基因小鼠中与非转基因小鼠相比在数量上不同的水平下可测量tt的生物标记物或特异性地结合于所述生物标记物；使哺乳动物生物样本与所述组接触以tt确定生物标记物的表达水平；将在哺乳动物样本中表达的生物标记物的水平与参考样本tt中的生物标记物的水平相比较；其中在哺乳动物生物样本中与参考样本相比生物标记物tt的表达水平存在数量上不同指示有癌症。tt
在各种实施例中，参考样本为来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本；或以对应于在来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本中测量的水平的浓度水平提供的纯化生物标记物。tt
在各种实施例中，大分子为抗体、核酸、蛋白质或其片段。tt
在各种实施例中，生物标记物为蛋白质、mRNA或抗体。tt
在各种实施例中，生物标记物为蛋白质，所述蛋白质为格劳乔相关蛋白质、Mdm2、ttRas、ErbB1、ErbB2以及CyclinD1／D2；或编码一个这种蛋白质的mRNA；或特异性地tt结合于一个这种蛋白质的自身抗体。在一个优选实施例中，生物标记物中的至少一者包tt含格劳乔相关蛋白质。生物标记物蛋白质的特征在于蛋白质通常为非分泌蛋白。tt
在各种实施例中，组包括一个或一个以上抗体，其中抗体特异性地结合于在Grg1tt表达转基因小鼠中与非转基因小鼠相比在数量上不同的水平下可测量的生物标记物蛋tt白质；或组包括一个或一个以上cDNA分子，其中cDNA分子特异性地结合于生物标记tt物mRNA或其互补序列，其中生物标记物mRNA或其互补序列是在Grg1表达转基因小tt鼠中与非转基因小鼠相比在数量上不同的水平下可测量的；或组包括一个或一个以上蛋tt白质，所述蛋白质为在Grg1表达转基因小鼠中与非转基因小鼠相比在数量上不同的水tt平下可测量的生物标记物。tt
在一些实施例中，所述方法进一步包括从哺乳动物生物样本和参考样本中分离ttmRNA并定量扩增mRNA以及产生cDNA。tt
在各种实施例中，哺乳动物生物样本为流体样本。流体样本可为血液、血浆或血清。tt在各种其他实施例中，哺乳动物生物样本和参考样本以可检测方式标记。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下方式鉴别对抑制剂化学疗法有响应tt的候选患者的方法；提供来自候选患者的生物样本；检测患者生物样本中TLE生物标记tt物的表达的存在；将患者生物样本中的TLE生物标记物的表达水平与参考样本中的TLEtt生物标记物的水平相比较；以及当候选患者生物样本中的TLE生物标记物表达升到高过tt参考样本中的TLE生物标记物的水平时，将候选患者鉴别为HDAC抑制剂化学疗法的tt响应性候选者。在一个实施例中，癌症患者患有肺癌。在各种实施例中，通过测量TLEtt蛋白质水平或mRNA水平确定TLE生物标记物的表达。TLE生物标记物蛋白质的特征tt在于蛋白质通常为非分泌蛋白。tt
在各种实施例中，参考样本为来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本；以对应于在来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺乳tt动物的生物样本中测量的水平的浓度水平提供的纯化生物标记物；来自已知非响应性患tt者的生物样本；或以对应于在来自非响应性患者的生物样本中测量的水平的浓度水平提tt供的纯化生物标记物。tt
在各种实施例中，患者生物样本为流体样本或组织样本。流体样本可为血液、血浆tt或血清。组织样本可为肺组织。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下方式监测癌症患者治疗方案的有效tt性的方法：提供在进行治疗方案之前来自患者的生物样本；检测治疗前患者样本中TLEtt生物标记物的表达的存在；将治疗前患者样本中的TLE生物标记物的表达水平与来自治tt疗期间或之后的患者的生物样本中的TLE生物标记物的表达水平或与参考样本中的ttTLE生物标记物的水平相比较，其中治疗前患者样本中与治疗后患者样本相比TLE生物tt标记物的表达水平的变化或治疗后患者样本的TLE的表达水平与参考样本中TLE生物tt标记物的水平的差异指示治疗的有效性。在一个实施例中，所述治疗后患者样本中的ttTLE水平降低指示有效治疗。在各种实施例中，通过测量TLE蛋白质水平或mRNA水tt平确定TLE生物标记物的表达。tt
在各种实施例中，参考样本为来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本；或以对应于在来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本中测量的水平的浓度水平提供的纯化生物标记物。tt
在一个实施例中，治疗包括投予治疗有效量的HDAC抑制剂。在一个实施例中，癌tt症患者患有肺癌。tt
在各种实施例中，样本为流体样本或组织样本。流体样本可为血液、血浆或血清。tt组织样本可为肺组织。tt
在本发明的又一方面，本发明针对一种通过以下方式监测癌症患者治疗方案的有效tt性的方法：提供来自所述患者的治疗后生物样本；检测所述患者样本中TLE生物标记物tt的表达的存在；将所述治疗后患者样本中TLE生物标记物的表达水平与参考样本中TLEtt生物标记物的表达水平相比较，其中所述治疗后患者样本的TLE表达水平与所述参考样tt本中的所述TLE表达水平的差异指示所述治疗的有效性。在一个实施例中，所述治疗后tt患者样本中的TLE水平降低指示有效治疗。TLE生物标记物蛋白质的特征在于蛋白质通tt常为非分泌蛋白。tt
在一个实施例中，参考样本从对疗法没有响应的治疗后癌症患者获得。在各种其他tt实施例中，参考样本为来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺乳动物的生tt物样本；或以对应于在来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺乳动物的生tt物样本中测量的水平的浓度水平提供的纯化生物标记物。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下方式鉴别癌症患者治疗候选者的方tt法：提供来自患者的生物样本；检测与参考样本中TLE生物标记物的水平相比在患者生tt物样本中较高水平的TLE生物标记物的存在；以及将癌症患者鉴别为用于以投予治疗有tt效量的格劳乔相关蛋白质的片段来治疗癌症的候选者。在一个实施例中，癌症患者患有tt肺癌。TLE生物标记物蛋白质的特征在于蛋白质通常为非分泌蛋白。在一个实施例中，tt片段包含Q结构域。tt
在各种实施例中，参考样本为来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺tt乳动物的生物样本；以对应于在来自未诊断出癌症且癌症风险因子没有增加的健康哺乳tt动物的生物样本中测量的水平的浓度水平提供的纯化生物标记物；来自已知非响应性患tt者的生物样本；或以对应于在来自已知非响应性患者的生物样本中测量的水平的浓度水tt平提供的纯化生物标记物。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下方式鉴别癌症患者治疗候选者的方tt法：提供来自患者的生物样本；检测患者生物样本中失活APC或β-连环蛋白突变的存tt在；以及将具有失活APC或β-连环蛋白突变的癌症患者鉴别为用于以向癌症患者投予tt治疗有效量的格劳乔相关蛋白质或格劳乔相关蛋白质的片段来治疗癌症的候选者。在一tt个实施例中，癌症患者患有结肠癌。在一个实施例中，片段至少包含WD40结构域。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过向哺乳动物投予治疗有效量的格劳乔相tt关蛋白质或格劳乔相关蛋白质的片段来治疗哺乳动物的癌症的方法。在一个实施例中，tt癌症为肺癌。在一个实施例中，片段包含Q结构域。在又一实施例中，癌症为结肠癌。tt在一个实施例中，片段至少包含WD40结构域。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过向癌症投予治疗有效量的β-连环蛋白来tt治疗哺乳动物的癌症的方法。在一个实施例中，癌症为肺癌。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种转基因小鼠，所述转基因小鼠的基因组包含tt编码APC蛋白质的基因的杂合无效等位基因，其中Apc基因至少在密码子1638处被截tt断，和格劳乔相关基因的半合转基因等位基因，且其中小鼠显现出肿瘤形成。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种针对抗肿瘤活性筛选化合物的方法，所述方tt法包含以下步骤：制备转基因小鼠，所述转基因小鼠的基因组包含编码APC蛋白质的tt基因的杂合无效等位基因，其中Apc基因至少在密码子1638处被截断，和格劳乔相关tt基因的半合转基因等位基因，且其中小鼠显现出肿瘤形成；用候选化合物治疗所制备的tt转基因小鼠；通过测量肿瘤细胞的数目、肿瘤的体积或肿瘤细胞活力来确定经候选化合tt物治疗的转基因小鼠中肿瘤的水平；以及如果肿瘤细胞的数目或肿瘤的体积相对于用候tt选化合物治疗之前的转基因小鼠中肿瘤细胞的数目或肿瘤的体积已有所降低的话，或如tt果在用候选化合物治疗之后已诱导肿瘤细胞凋亡的话，那就将候选化合物鉴别为具有抗tt肿瘤活性的化合物。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种诊断试剂盒，其包含一个或一个以上在Grg1tt表达转基因小鼠中与非转基因小鼠相比处于数量上不同的水平下的生物标记物。tt
在一个实施例中，试剂盒的一个或一个以上生物标记物为格劳乔相关蛋白质、ttMdm2、Ras、ErbB1、ErbB2或CyclinD1/D2。在一个优选实施例中，至少一个生物标记tt物包含格劳乔相关蛋白质。在一个实施例中，试剂盒包括以结合于固体支撑物的一组生tt物标记物形式提供的一个或一个以上生物标记物。生物标记物蛋白质的特征在于蛋白质tt通常为非分泌蛋白。tt
在本发明的另一方面，本发明针对一种通过以下方式鉴别非小细胞肺癌的标记物的tt方法：提供来自Grg1表达转基因小鼠的生物样本和来自非Grg1表达小鼠的生物样本；tt测量Grg1表达转基因小鼠和非Grg1表达小鼠中的生物标记物的表达；以及鉴别在样本tt中以不同水平表达的生物标记物。生物标记物蛋白质的特征在于蛋白质通常为非分泌蛋tt白。tt
在一个实施例中，生物标记物为蛋白质或mRNA。在各种实施例中，样本为流体样tt本或组织样本。流体样本可为血液、血清或血浆。组织样本可为肺组织。tt
在一个实施例中，所述方法进一步包括在测量步骤之前使生物样本与结合搭配物接tt触。结合搭配物可为抗体、核酸、配体或适体。在各种实施例中，鉴别步骤包含检测与tt结合搭配物的结合。因此，生物样本可以可检测方式标记。在其他实施例中，检测步骤tttttt包括使标记物-结合搭配物复合物与第二结合搭配物接触。在这些实施例中，第二结合搭tt配物可以可检测方式标记。一些实施例包括液相色谱分析和串联质谱分析。tt
在一个实施例中，与非Grg1表达小鼠中的生物标记物的表达水平相比，Grg1表达tt转基因小鼠中的生物标记物的表达水平有所提高。在另一实施例中，与非Grg1表达小tt鼠中的生物标记物的表达水平相比，Grg1表达转基因小鼠中的生物标记物的表达水平有tt所降低。tt
在一些实施例中，所述方法进一步包括在比较mRNA水平的步骤之前使样本与DNAtt接触。在其他实施例中，所述方法进一步包括从样本中分离mRNA并定量扩增mRNAtt以及产生cDNA。tt
根据以下描述和所附权利要求书将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面以及tt优势。tt
附图说明tt
在附图中tt
图1为Grg1和Grg5转基因小鼠的蛋白质表达的变化概述的图示；tt
图2为用于抗体微阵列的抗体稀释液的表格；tt
图3为描绘抗体阵列定位的表格；tt
图4为示出用于抗体微阵列的检测和点样分析的表格；tt
图5为抗体微阵列的例示性图像(负像，用145145A5孵育的阵列)；tt
图6为示出玻片孵育期间样本重分配的表格(14个阵列/玻片)；tt
图7为每个阵列或样本的经标记BSA阳性对照的平均值、SD和CV的表格；tt
图8为对照(具有每个样本的抗白蛋白和抗H1抗体)的平均值(净信号，去除背tt景信号)、SD和CV的表格；tt
图9为每个样本的阴性对照(PBS)和背景(B635)的平均值、SD和CV的表格；tt
图10为血清和孵育对照的平均净信号的表格；tt
图11为示出突出值的一个实例的表格；tt
图12为10个抗体所获得的结果的表格；tt
图13为MDM2抗体的盒形图(p＝0.03，曼恩-惠特尼(Mann&Whitney))；tt
图14为TLE1抗体的盒形图(p＝0.03，曼恩-惠特尼)；tt
图15为示出在用曲古霉素A(TrichostatinA)治疗后Grg1转基因小鼠中的肿瘤发tt展的表格；tt
图16为来自经或未经曲古霉素A治疗的Grg1hPLAP转基因小鼠的肿瘤切片的照tt片；tt
图17为示出APCmin/Grg1hPLAP小鼠中肠息肉和肺腺瘤的定量的表格；以及tt
图18A和18B为示出脊椎动物的格劳乔相关蛋白质的结构和序列保守性的示意图。tt
具体实施方式tt
使用人类样本因样本的不均匀性而难以鉴别生物标记物。人类样本中出现许多与疾tt病无关的差异。为了克服这个困难，在发展本文所公开的本发明中使用提供可预测的疾tt病进程和可用合适的阴性对照的动物模型。tt
Grg1转基因小鼠品系用于鉴别肺癌的生物蛋白质标记物。Grg1小鼠显现类似人类tt非小细胞肺腺癌的肺肿瘤。Grg1小鼠用作组织来源以提供用于在肺肿瘤发展期间测量基tt因和蛋白质差异的样本。Grg1转基因小鼠的产生描述于艾伦T.等人“Grg1充当转基因tt小鼠模型中的肺特异性致癌基因”，癌症研究，66：3，1294-1301(2006)(Allen，T.et al.tt″Grg1Acts as a Lung-Specific Oncogene in a Transgenic Mouse Model"，Cancer Res，66：3，tt1294-1301(2006))(以引用的方式并入本文中)。在本发明中，Grg1转基因小鼠用于鉴别tt肺癌的生物蛋白质标记物。与鉴别肺癌患者相关的经鉴别的生物蛋白质标记物为在来自tt人类癌症患者的血清中的可测量的蛋白质，当通过诊断人类癌症的常规手段进行分析tt时，这些蛋白质与在未患癌症的人类对照患者中鉴别的蛋白质在数量上或质量上不同。tt本发明提供一种用于检测癌症的检验和方法。简单地说，获得来自患者或疑似患有癌症tt或需要排除癌症作为诊断结果的个体的样本(如血液样本)，且针对肺癌的生物标记物tt的存在或不存在进行分析。使用一个生物标记物或一组生物标记物，每个生物标记物都tt在一定程度上与肺癌相关。根据本发明的生物标记物包括(但不限于)格劳乔相关蛋白tt质(在人类中被称为类转导蛋白分裂增强子(transducin-like enhancer-of-split；TLE))、tt针对格劳乔相关蛋白质的自身抗体或编码格劳乔相关蛋白质的核酸。根据本发明的生物tt标记物进一步包括(但不限于)Mdm2蛋白质、针对Mdm2蛋白质的自身抗体或编码ttMdm2蛋白质的核酸。tt
格劳乔蛋白质为转录共阻遏物，其与许多转录因子和组蛋白脱乙酰基酶-1tt(HDAC-1)相互作用以阻遏靶基因的转录。格劳乔蛋白质家族由小鼠中的Grg1-5和人tt类中的TLE1-5编码。大多数格劳乔蛋白质具有原型果蝇格劳乔蛋白质的所有结构域，tt但Grg5/TLE5和Grg3替代剪切变异体编码仅具有氨基末端Q和G/P结构域的格劳乔同tt功异构物。Q结构域用于格劳乔蛋白质的寡聚。因此，短格劳乔蛋白质可通过形成非功tt能性复合物而抑制长蛋白质的活性。tt
图18A在上方示出果蝇格劳乔蛋白质的结构组织，且具有所有保守格劳乔结构域或tt仅含有Q和B/P结构域的相关脊椎动物蛋白质示于下方。格劳乔同源物的命名在左列中tt指示。数字以果蝇格劳乔蛋白质(斜线的左边)或人类TLE蛋白质(斜线的右边)来指tt示氨基酸一致性百分比。图18B示出鼠类格劳乔同源物的Q和WD40结构域的比对。tt短划线指示氨基酸一致性。右侧的百分比指示与Grg3的同源性。对于Grg3来说，与人tt类TLE3的保守性在圆括号中给出。tt
表1通过氨基酸编号鉴别每个TLE蛋白质的Q结构域和WD40结构域。Grg1-5和ttTLE1-5的氨基酸和多聚核苷酸序列提供于附录A中。tt
表1tt
Mdm2(鼠类双微体2(mdm2)基因)的人类同源物编码E3泛素-蛋白质连接酶，tt所述E3泛素-蛋白质连接酶为p53肿瘤抑制物的负调控因子。这种基因的过度表达可导tt致肿瘤蛋白质p53过度失活，从而降低其肿瘤抑制功能。人类MDM2的氨基酸和多聚tt核苷酸序列提供于附录A中。tt
本发明的生物标记物，格劳乔相关蛋白质(小鼠中的Grg蛋白质家族；人类中的ttTLE蛋白质家族)、Mdm2、Ras、ErbB1、ErbB2和CyclinD1/D2，是在细胞中驻留并发tt挥功能的蛋白质。由此，本发明的蛋白质生物标记物通常为非分泌蛋白。人们将预期，tt能够检测流体生物样本(如血液、血清或血浆)中的生物标记物的检验将限于检测分泌tt蛋白。因此，令人惊讶且出人意料的是，本发明的一方面为用于检测流体生物样本(如tt血液、血浆或血清)中的可测量水平的本发明生物标记物的诊断检验和试剂盒。tt
在本发明的所有方面和实施例中，本发明的生物标记物可呈现为一组，其中一组是tt指本发明的检验或方法中所选择或提供的特定生物标记物或生物标记物群；或本发明的tt试剂盒中所提供的特定生物标记物或生物标记物群。tt
在本发明的所有方面和实施例中，生物标记物以大分子形式提供。大分子可为蛋白tt质、核酸、抗体或其片段。当大分子为蛋白质时，片段可包括(但不限于)抗原性片段、tt各种长度的N末端结构域、各种长度的C末端结构域、如本领域中所鉴别的指定结构域tttttt(例如格劳乔相关蛋白质的Q结构域或WD40结构域)。当大分子为核酸时，核酸可包括tt(但不限于)mRNA、cDNA、基因组DNA和其片段。核酸的片段可包括(但不限于)tt编码序列和对应于上文所列的各种蛋白质片段的序列。当大分子为抗体时，抗体可包括tt(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、人源化抗体和其片段。抗体的片段tt可包括任何抗原结合片段，例如(但不限于)F(ab)片段和F(ab′)2片段。tt
如下文更详细阐述，根据本发明的检验和方法可鉴别已知患有I期或II期肺癌的患tt者。鉴别患有早期肺癌的患者尤其有价值，因为当前检验和筛查模式很少能够以稳固而tt有成本效益的方式这样做。检验也是通用的，通过使用能够同时测试大量样本的检验形tt式(例如使用微阵列)，可平行操作关于任何群体的对照样本以获得高置信度的有差别tt数据，其中多个对照有尽可能多的参数与测试群体匹配。tt
本发明还提供一种基于有变化的生物标记物确定可为有效的疗法的方法。可选择靶tt向生物标记物或与生物标记物相互作用的其他蛋白质的治疗。tt
本发明还提供其他癌症的治疗，例如(但不限于)APC途径蛋白质有变化的结肠癌。tt治疗可通过将治疗有效量的格劳乔相关蛋白质或格劳乔相关蛋白质的同源物或片段引tt入癌症患者体内而实现。tt
生物标记物选择tt
使用Grg1转基因小鼠完成肺癌相关标记物(例如蛋白质生物标记物或针对这些蛋tt白质的自身抗体)的选择和鉴别。收集来自Grg1小鼠的组织样本，且通过包括差异性ttRNA阵列、西方印记或蛋白质组方法(如LC-MS/MS)的方法进行分析。将Grg1小鼠tt中的蛋白质或基因表达的水平与不带有肿瘤的对照小鼠相比较。在Grg1小鼠中或在肿tt瘤中与相邻正常肺组织相比以不同水平表达的蛋白质或基因表示用于肺癌早期检测的tt潜在肺癌生物标记物。测试人类肺癌患者样本中这些蛋白质的存在。tt
在“诊断芯片”上编译针对生物标记物的抗体，例如，在固体基质上以微阵列形式tt呈现一组抗体，且在区别肺癌患者的样本与非肺癌群体的样本中对独立的预测值进行进tt一步评价。选择能够鉴别个体中在影像学上可检测的肺癌的存在或未来存在的诊断标记tt物。tt
患者样本中的生物标记物测量tt
如下文更详细讨论，本发明涵盖使用不同检验形式。微阵列能够同时测试多个标记tt物和样本。由此，许多阳性和阴性对照可包括于微阵列中。随后可在同时处理多个样本tt下进行检验，例如来自一个或一个以上已知受影响患者的样本(阳性对照)，和一个或tt一个以上来自未患癌症的患者的样本(阴性对照)，以及一个或一个以上待测试和比较tttttt的样本(如患者样本)。在检验中包括内部阳性和阴性对照允许对检验中的信号强度进tt行归一化、校准和标准化。举例来说，可以多个形式操作阳性对照、阴性对照和患者样tt本中的每一者，且多个样本可为连续稀释液。也可在微阵列装置上随机布置对照位点和tt患者样本位点以使得由于测试装置上的样本位点位置引起的变化减到最小。tt
由此，具有内部对照的这种微阵列或芯片能够在微阵列或芯片上同时诊断被测试的tt患者。因为有合适的对照的缘故，以受控方式进行测试和数据采集的这种多元方法能够tt在检验装置内诊断患者，且如果标记物组是那些个别地具有适度高的预测能力的标记物tt的话，那就可获得定点护理诊断结果。tt
取样和测试的范例tt
尤其在筛查检验中经得起测试的样本通常为那些可从患者获得的样本，且优选地以tt非侵入性或最低侵入性的方式获得。血液样本、血浆或血清是这种合适的样本，且可容tt易受大多数免疫检验形式处理。在血液样本的情形下，有许多已知的血液收集管，多数tt收集5或10ml流体。类似于大多数通常有序的诊断血液测试，可收集5ml血液，但以tt微阵列形式操作的检验可能需要少于1ml的血液。血液收集器皿可含有抗凝剂，如肝素、tt柠檬酸盐或EDTA。细胞单元一般通过离心来分离，例如，在4℃下以1000×g(RCF)tt离心10分钟(产生约40％的血浆供分析)，且可在冰箱温度下或4℃下储存直到使用。tt血浆样本优选地在收集3日内进行检验或例如在-20℃下冷冻储存。过量样本在-20℃下tt储存(在无霜冰箱中储存以避免样本冻融)最多两周以供需要时进行重复分析。储存期tt长于两周应在-80℃下。血清样本可通过不提供抗凝剂且使样本凝结来获得。实施如本领tt域中已知的保存蛋白质结构和功能的标准处理和储存方法。tt
根据本发明，随后将来自疑似患有癌症或需要排除癌症作为诊断结果的人类患者的tt流体样本应用于测试组合物，例如含有负载有例如针对本文所讨论的生物标记物的抗体tt的位点的微阵列，且在一个实施例中，优选地连同合适的阳性对照和/或阴性对照样本一tt起。可以梯度量(如连续稀释)的形式提供患者、阳性对照和阴性对照样本以能够进行tt定量。样本可随机定位于微阵列上以处理微阵列的任何位置效应。在孵育后，洗涤微阵tt列，随后使其暴露于检测器。再次洗涤微阵列，随后在一个实施例中，使其暴露于能够tt检测报告基因的试剂。由此，如果报告基因包含有色粒子(如金属溶胶)的话，那就不tt需要特定的检测手段。在本发明的另一实施例中，使用荧光分子且用适当的入射光进行tt检测。或者，在本发明的另一实施例中，使用酶且使微阵列暴露于合适的基质用于可视tt化。针对结合于位点的反应产物来评估微阵列。尽管可以进行视觉评估，但其他装置将tt检测且必要时定量信号强度。随后例如通过观察阳性和阴性对照样本来解译数据以提供tttttt关于反应有效性的信息，且如果有效的话，那就评估患者样本。分析从检验获得的数据tt以确定患者样本中的一个或一个以上生物标记物与阴性对照样本中相比是否在数量上tt不同。如果患者样本与阴性对照样本相比具有较多或较少量的生物标记物(取决于所选tt择的生物标记物)的话，那就将患者诊断为对肺癌呈阳性。tt
试剂盒和检验的用途tt
根据本发明的血液检验(测试)具有多种用途和应用，不过对后续跟踪的早期诊断tt或预警对疾病结果的潜在影响非常引人注目。本发明可用作诊断工具以为肺癌的放射照tt相筛查作补充。连续CT筛查一股对肺癌灵敏，但往往相当昂贵而且是非特异性的(64％tt的报告特异性)。由此，CT导致大量假阳性结果，接近十分之四。放射照相成像期间不tt确定的肺结节的常规鉴别频繁导致昂贵的检查和潜在有害的干预，包括侵入性活检。当tt前，年龄和吸烟史是仅有的两个被针对肺癌的大型筛查研究用作选择标准的风险因子。tt
用于检测放射照相上明显的癌症(＞0.5cm)和/或隐性或恶化前癌症(低于常规放tt射照相检测限)的根据本发明的方法界定最需要进行额外筛查的个体。由此，根据本文tt所描述的本发明的检验可充当初步筛查测试，其中阳性结果表明癌症的存在是供进一步tt检查的指示，如本领域中常规和已知的检查，例如通过放射照相分析(如CT、PET、Xtt射线以及其类似分析)进一步检查。此外，周期性重复测试可鉴别新出现的非小细胞肺tt癌NSCLC。tt
本文所描述的本发明的检验的临床应用的一个实例为其在医疗实践中的用途，其中tt可针对一个或一个以上本文所描述的肺癌生物标记物检验来自高风险吸烟者(例如相当tt于每天吸一包并持续20年或更多年的人员)的体液样本(如血液)，作为每年身体检查tt的一部分。不含任何其他显性症状的阴性检验结果可指示至少每年一次进行进一步测tt试。如果测试结果呈阳性的话，那么患者将接受进一步测试，如重复检验和/或CT扫描tt或X射线，以通过诊断成像鉴别可能的肿瘤。如果CT扫描或X射线上无明显肿瘤的话，tt那就将在一年内重复检验一次或两次，且在接下来的年份中重复检验多次直到肿瘤直径tt为至少0.5mm且可被检测到并以手术方式去除。除了用于临床筛查方案中以外，本发tt明的检验和方法也可适用于区分CT筛查上所鉴别的良性结节与恶性结节。孤立性肺结tt节(SPN)定义为影像学上直径小于3cm且完全被正常肺组织包围的单一球形病灶。尽tt管所报告的SPN中恶性肿瘤患病率在约10％到约70％的范围内，但大多数使用SPN现tt代定义的最新研究揭示恶性肿瘤患病率为约40％到约60％。大部分良性病灶为肉芽肿的tt结果，而大部分恶性病灶为原发性肺癌。SPN的初始诊断评价是基于评估恶性肿瘤的风tt险因子，例如年龄、吸烟史、恶性肿瘤既往史以及基于老的胸部x射线评价的结节的胸tttttt部放射照相特征(如大小、钙化、边缘(针状或平滑)和生长模式。随后使用这些因子tt确定恶性肿瘤的可能性且指导进一步患者管理。tt
初始评价之后，许多结节将被归为具有恶性肿瘤的中等概率(25-75％)。这组中的tt患者在继续进行活检或手术之前将受益于使用检验的额外测试。连续扫描评估生长或代tt谢成像(例如PET扫描)是当前可用的仅有的非侵入性选择且远不够理想。连续放射照tt相分析依赖于测量生长，这要求病灶在两年的时间范围内不显示出生长；尽管两年内每tt3个月进行一次CT扫描是常规的纵向评价，但扫描之间的理想时间间隔仍未确定。PETtt扫描对肺癌具有90-95％的特异性并具有80-85％的灵敏度。这些预测值可基于良性肉芽tt肿疾病(例如组织胞浆菌病)的局部患病率而变化。tt
PET扫描目前费用在每次测试$2000与$4000之间。来自非手术程序(如支气管镜tt检或经胸穿刺活检(TTNB))的诊断检出率在40％到95％的范围内。设定非诊断程序中tt的后续管理可能有问题。在有或没有其他诊断检查的情况下，通常追求手术干预作为最tt可行的选择。选择将取决于恶性肿瘤的预测试风险是高还是低、在特定机构测试的可用tt性、结节的特征(如大小和位置)、患者的手术风险以及患者的偏好。其他胸腔外恶性tt肿瘤的既往史直接表明癌症转移到肺部的可能性，且非侵入性测试的相关性变得微不足tt道。在SPN的临床情形与对肺癌不确定的临床怀疑混杂时，循环的肿瘤标记物可有助于tt避免潜在有害的侵入性诊断检查且反过来支持侵袭性手术干预的理论基础。tt
所描述的本发明由此提高选择的临床舒适度以替代侵入性诊断而使结节连续成像。tt本发明也将影响连续X射线或CT筛查的时间间隔，从而降低临床卫生保健成本。所描tt述的本发明将补充或替代PET扫描作为有成本效益的方法以进一步提高肺癌存在或不tt存在的概率。tt
本发明将适用于在治疗性干预后评估疾病复发。通常以这种能力采用用于结肠癌和tt前列腺癌的血液测试，其中追踪标记物水平作为治疗成功或失败的指标，且其中上升的tt标记物水平表明需要对导致治疗性干预的复发进行进一步诊断评价。tt
因此，根据本文所描述的本发明的检验对于筛查、治疗选择且对于在治疗期间继续tt使用以监测疗程、治疗成功、复发、治愈等来说是有价值的诊断工具。检验的试剂、特tt定组的标记物可受操控以适于特定目的。举例来说，在筛查检验中，可使用一大组标记tt物或一组极为普及的标记物以使对大量个体的预测能力最大化。然而，在正在进行治疗tt的个体的情形下，例如可获得患者的特定肿瘤类型的特定生物标记物指纹，其可能需要tt或可能不需要所有用于筛查的生物标记物或可能仅仅是用于筛查的生物标记物的子组。tt生物标记物的特定化子组可用于监测那个患者中肿瘤的存在，和后续治疗性干预。tt
可以许多不同形式配置本发明的检验和试剂盒的组分以供配送和使用。举例来说，tt可将一个或一个以上抗体等分并储存于一个或一个以上器皿(如玻璃小瓶、离心管以及tt其类似器皿)中。抗体溶液可含有合适的缓冲剂和其类似物，包括防腐剂、抗微生物剂、tt稳定剂以及其类似物，如本领域中已知。抗体可呈保存形态，例如脱水形式、冻干形式tt等。抗体可放置于合适的固相上以用于特定检验。由此，抗体可在培养板的孔中放置并tt干燥，点样于分层阵列或侧向流动免疫检验装置中的膜上，点样于玻片或其他微阵列支tt撑物上等。可如本领域中已知封装物件以确保最大存放期，例如用塑料薄膜包裹或不透tt明包裹封装，且将其装箱。检验容器也可含有阳性和阴性对照样本，各自在一个器皿中，tt其包括：当样本为液体时，具有滴管或具有盖子且能够分配液滴的器皿、样本收集装置、tt其他液体转移装置、检测器试剂、显色试剂(如银染试剂和酶底物)、酸/碱溶液、水等。tt可包括合适的使用说明书。tt
在其他形式(例如使用基于珠粒的检验或试剂盒)中，多个抗体可附着于不同珠粒tt群体上，其随后可合并成单一试剂以准备暴露于患者样本。tt
现在将在以下非限制性实例中例示本发明。tt
实例tt
实例1tt
抗体微阵列tt
在Grg1转基因小鼠中鉴别非小细胞肺癌的候选生物标记物，其中使用西方印迹测tt量显现肺肿瘤的Grg1表达小鼠中与不带有肿瘤的小鼠相比的蛋白质水平。Grg1转基因tt小鼠中经鉴别为有变化的蛋白质示于图1中。tt
抗体微阵列实验的目的在于使用用于30个人类血清的常用抗体阵列评价肺癌中相tt对于对照样本的10种人类蛋白质的相对丰度。tt
点样方案和玻片孵育tt
1.玻片点样tt
通过Microgrid II点样仪与Quill Pins Microspot2500进行点样。点样直径为150μm。tt点样仪由设定为4℃的温控生物库(Biobank)装备。tt
所使用的玻片为硝化纤维素玻片(Gentel PATH PLUS蛋白质微阵列玻片)。tt
抗体以其市售储存缓冲液或经磷酸盐缓冲盐水(0.01M，pH7.4)稀释的形式点样tt于14个垫片上。优化用于每个抗体的稀释液(见图2)。在每一阵列上对每个抗体重复tt点样三次。tt
在每个垫片上将4个不同对照重复点样三次(见图3)。第一个PBS(磷酸盐缓冲盐tttttt水)是阴性对照。第二个经标记的BAS(以0.05mg/ml点样)是网格定位/阳性对照。tt第三个是抗白蛋白抗体(以O.1mg/ml点样)，其为血清孵育的阳性对照。最后一个对照tt为抗H1抗体(抗组蛋白H1，以0.5mg/ml点样)，其为阴性对照。tt
2.标记和样本孵育tt
血清样本从Asterand获得：来自肺癌患者供体的Asterand XPressBANKTM人类血清tt和人类正常对照血清。人类正常对照血清对应于如本文所描述的参考样本。根据肿瘤组tt织结构确定每个患者的癌症阶段。tt
用50μl的40mM Sulfo-NHS-LC-生物素标记500μl的每个血清(以1/10稀释)。tt在室温下孵育混合物1小时，同时每10分钟短暂涡旋一次。已对方案进行优化以获得tt最佳信噪比。tt
在振荡(50rpm)下洗涤玻片2次(2分钟)，且在室温下于1小时内在缓缓振荡(15ttrpm)下用5m1PBS(0.01M；pH=7.4)、0.1％吐温(Tween)、1％酪蛋白将其阻断。tt
在缓缓振荡下，在室温下，将70μl的每个样本以1/300(PBS+0.05％吐温+0.1％酪tt蛋白)孵育1小时。随后，在35rpm下用80μl PBS+0.05％吐温、0.1％酪蛋白洗涤每个tt孔5次(5分钟)。tt
在缓缓振荡(15rpm)下，在室温下于暗处将70μl的抗生蛋白链菌素AlexaFluor647tt溶液以1μg/ml于每个孔中孵育1小时。在暗处于35rpm下用80μl PBS+0.05％吐温、tt0.1％酪蛋白洗涤每个孔5次(5分钟)，且.在暗处于35rpm下在5分钟内用5mlttPBS+0.05％吐温、0.1％酪蛋白洗涤玻片2次。最后，用蒸馏水冲洗玻片且在黑暗洁净处tt干燥并进行扫描。tt
图像分析tt
用Innoscan700荧光微阵列扫描仪(Innoscan700-InnopsysTM)扫描玻片。优化扫tt描参数。tt
用软件(2.8.2版)处理图像。将检测网格和点样标识覆盖于相应图像上。tt
分析参数tt
专用于图像分析的软件允许设置点样检测参数(点样检测阈值、可变或恒定点样直tt径、异常检测)。用Mapix对这个分析设置的参数示于图4中。一个例示性图像示于图5tt中。孵育图显示于图6中。tt
也使图像可视化以便检查检测网格位置并检测异常或错误点样检测(粉尘检测、高tt背景值)的存在。一些样本已被孵育两次。已针对这些样本中的每一者选择最佳图像。tt
质量控制tt
1.点样控制tt
在视觉上进行第一质量控制。其揭示没有可能影响分析的异常情况。tt
每个网格含有定位阳性对照点样：经标记的BSA(每个垫片3个点样)和抗白蛋白tt抗体(每个垫片3个点样)。最后被点样的经标记的BSA点样用于网格定位和对照，其tt全部点样都被点样(图7)。抗白蛋白抗体为微阵列上的血清孵育对照。如所预期，这个tt阳性对照显示出高反应性(图8)。tt
也有阴性对照点样：PBS和抗H1抗体。PBS(每个网格51个)用于检查非特异性tt信号。预期相应的信号约为背景水平(图9)。抗H1抗体是血清孵育的阴性对照。如所tt预期，阴性对照显示出低反应性(图8)。tt
2孵育控制tt
两个阵列经孵育缓冲液而非患者样本孵育以检查仅仅通过孵育抗生蛋白链菌素ttAlexafluor溶液获得的非特异性信号。tt
除“Rb hypo”抗体以外，用这一对照测量的所有信号都接近背景值(低于背景附tt近舍去值)。对于“Rb hypo”抗体来说，所获得的信号都高于舍去值，但与其在孵育样tt本时所测量的信号相比，这一信号极低(图10)。tt
原始数据处理tt
从点样中所含的像素的中值计算每个点样的强度。tt
点样的测量信号受局部背景值(在点样周围的区域中测量)所影响，背景值会增强tt信号。由此，从信号中系统地扣除局部背景值以获得净信号。净信号由于背景水平比点tt样信号(弱点样信号)略高而可能为负值。在这种情况下，负的净值(中值点样信号-tt中值局部背景信号)被数值“10”(修正值)替代。tt
在每个阵列上对每个抗体重复点样三次。这允许检查信号有效性以验证复本之间的tt数值一致性。如果三个复本呈现出CV＞50％的话，那么随后在表格和相应的归一化数值tt中用星号(*)突出显示所计算的中值。tt
呈现接近背景值的信号水平的点样对背景值变化有很高的灵敏度。因此，尽管信号tt较低，但比较一对接近背景值的数据可得出很大的比率。为了清楚地鉴别这些数值，我tt们为每个点样设置了背景附近舍去值，计算如下：tt
局部背景值的(像素)平均值+3SDtt
当一个复本呈现出低于舍去值的信号时，在表格中用折音号(^)突出显示其净信tt号值。如果点样的三个复本中的至少两个呈现出低于舍去值的信号的话，那就认为蛋白tt质信号接近背景值。在这种情况下，在表格中用井号(#)突出显示从三个复本计算出tttttt的中值，独立于三个点样复本之间的CV值。突出显示报告于相应的归一化数值上(实tt例，图11)。tt
分析和归一化tt
为了比较用不同样本和玻片获得的信号群体，必须对每个群体进行归一化。实际上，tt实验参数可变化，且蛋白质浓度并不完全相同。tt
随后已选择针对强度平均值的归一化。针对除对照点样以外的每个样本，通过计算tt所有点样的强度(净信号)的平均值来计算用于归一化的参考值。tt
随后如下对每个蛋白质的信号进行归一化：tt
归一化值(VN)=(信号-背景值)抗体/平均值(信号-背景值)阵列×Ktt
K：常数(为使数据适于阅读)=10000tt
用这些归一化值进行下文所描述的不同分析。tt
比较对照组与肺癌组tt
有2组样本：对照和肺癌。进行以下比较：肺癌/对照(图12)。每个组含有15个tt样本，且计算每个组的中值。从归一化值计算比率(肺癌组中值/对照组中值)和Log2tt(比率)。tt
如果一组中至少一半的数值被突出显示的话，那么也在图12中用折音号(^)突出tt显示一组的所得中值。tt
为了比较样本组，也使用曼恩-惠特尼试验。曼恩-惠特尼试验是用于独立样本的非tt参数试验。这个试验的虚假设为H0：群体中值相等。针对试验所选择的显著性水平为tt5％(α＜0.05)。tt
所有抗体所获得的比值都相对较弱，但曼恩-惠特尼的统计试验允许分离2种抗体：ttMDM2(图13)和TLE1(图14)(假设H0被拒绝)。对于这2种抗体来说，与对照组tt相比，蛋白质在肺癌组中过度表达。tt
结论tt
数据分析使用曼恩-惠特尼试验揭示2种表达有潜在差异的蛋白质：MDM2和TLE1。tt与对照组相比，这2种蛋白质在肺癌组中过度表达。tt
实例2tt
药物治疗tt
生物标记物可用于预测药物治疗的有效性。Grg1转基因小鼠过度表达Grg1(人类ttTLE1)蛋白质，这种蛋白质与HDAC复合物相互作用以发挥其功能。由此，可通过用ttHDAC抑制剂治疗来抑制Grg1转基因小鼠中的肺肿瘤。HDAC抑制剂药物用于治疗多tttttt种癌症，但不清楚哪些患者将有响应。此外，HDAC抑制剂具有严重的副作用，因此正tt在开发具有更大比活性的HDAC抑制剂。对于针对非小细胞肺癌的有效性来说，Grg1tt小鼠模型提供了测试新HDAC抑制剂的理想设置。tt
曲古霉素A(TSA)是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其抑制肺癌细胞株的增殖。然而，tt尚未研究TSA对动物模型中的肺癌发展的影响。在本实例中，TSA用于治疗由于Grg1tt的过度表达而显现支气管肺泡肺癌的转基因小鼠。在TSA治疗时，发现在Grg1转基因tt小鼠中肺肿瘤的生长受到抑制。在经TSA治疗的Grg1转基因小鼠的组中，6个小鼠中tt仅有1个显现肿瘤。此外，肿瘤血管生成也被TSA抑制。这些发现表明，TSA在体内tt可有效抑制肺肿瘤生长，且组蛋白脱乙酰基酶活性的抑制对支气管肺泡腺癌具有治疗潜tt力。tt
材料和方法tt
用Grg1的Cre条件表达来产生转基因小鼠(鼠类TLE1)。转基因初始表达lacZ报tt告基因。当引入Cre重组酶时，侧接loxP的lacZ基因被切除，且转基因表达Grg1和另tt一报告基因，也就是人类胎盘碱性磷酸酶(hPLAP)。Cre切除之前和之后的转基因的广tt泛表达得到证实，且发现Grg1过度表达导致肺腺癌的发展。tt
在Cre切除前表达lacZ报告基因的小鼠被称为Grg1lacZ小鼠，且在Cre切除后表达ttGrg1和hPLAP的小鼠被称为Grg1hPLAP小鼠。本发明仅涉及Grg1表达(Grg1hPLAP)小tt鼠，且因此它们或称为Grg1hPLAP小鼠或简称为Grg1转基因小鼠。tt
产生129背景上的Grg1转基因小鼠且如所描述通过碱性磷酸酶染色进行基因分型，tt艾伦T.等人“Grg1充当转基因小鼠模型中的肺特异性致癌基因”，癌症研究，66：3，tt1294-1301(2006)(Allen，T.et al.″Grg1Acts as a Lung-Specific Oncogene in a TransgenicttMouse Model″，Cancer Res，66：3，1294-1301(2006))。以于40μl10％DMSO/PBS中的0.5ttmg/kg的量将TSA(BIOMOL研究实验室，普利茅斯会议，宾夕法尼亚(BIOMOL ResearchttLaboratories，Plymouth Meeting，Pennsylvania))腹腔注射到1个月大的Grg1hPLAP小鼠tt和对照同窝仔中(米什拉(Mishra)等人，2003)。将40μl的10％DMSO/PBS对照溶液tt注射到Grg1小鼠和对照同窝仔的其他组中。每个组由6个雄性小鼠组成，且注射持续tt30天。3个月后，处死小鼠且解剖肺脏用于组织学检查。将左肺的下叶固定于4％多聚tt甲醛中，随后包埋于石蜡中用于贯穿叶片以100mm步骤间隔进行5μm连续切片。用ttH&E将切片染色，且在放大10倍下针对腺瘤/癌性增殖进行筛查。记录病灶数目，且通tt过ANOVA测量统计学显著性。tt
结果tt
在5月龄时，Grg1过度表达小鼠显现连续切片上可见的肿瘤。经TSA治疗的Grg1tt转基因小鼠组是健康的，且组织切片显示出肿瘤生长显著减少(图15)。与6个Grg1tt小鼠中的5个显现肿瘤的未经治疗组相比，6个经TSA治疗的Grg1小鼠中仅有1个显tt现肿瘤。经或未经TSA治疗的非转基因动物未显现肿瘤或未显示出任何明显表型。tt
经H&E染色的连续切片的检查揭示，在Grg1过度表达小鼠中显现的肿瘤显示出广tt泛增殖，且观察到血管生长到肿瘤中。图16示出来自单一小鼠的病灶，这个小鼠在TSAtt治疗后显现肿瘤。病灶具有类似的细胞形态，但要小得多。病灶周围未观察到血管。在tt来自经TSA治疗的Grg1转基因小鼠和非转基因小鼠的肺组织上未观察到其他异常。tt
实例3tt
格劳乔蛋白质可用于治疗肿瘤tt
考虑到Grg蛋白质对β-连环蛋白/Tcf功能的拮抗作用，Grg蛋白质可对由异常Wnt/β-tt连环蛋白信号传导引起的恶性肿瘤起到肿瘤抑制作用。然而，Grg1的肺肿瘤表型与这一tt假设相矛盾。为了进一步解决这个问题，将Grg1和Grg5过度表达小鼠与携带APCmin等位基因的小鼠杂交。APCmin/+小鼠在鼠类APC基因的一个拷贝的密码子850中携带截tt断突变。野生型APC等位基因的损失导致这些小鼠体内β-连环蛋白水平升高且形成肠tt腺瘤。我们发现，Grg1过度表达在APCmin/+模型中对肠息肉的发展有显著影响。相反，ttAPCmin等位基因的存在也对由Grg1诱导的肺腺瘤有影响。tt
Grg1减少APCmin/-小鼠中大腺瘤的数目tt
在C57BL/6J背景上，APCmin/+小鼠具有4到6个月的寿命且显现多个肠腺瘤。在远tt亲杂交背景上腺瘤多样性和致死率由于修饰子基因座的存在而降低。我们将C57BL/6JttAPCmin/+小鼠与Grg1和Grg5小鼠杂交以产生携带APCmin等位基因而且过度表达Grg1tt或Grg5的小鼠。为了排除与转基因插入相关的影响，也将APCmin/+小鼠与Grg1lacZ和ttGrg5lacZ小鼠杂交以产生具有APCmin等位基因与未切除的转基因的小鼠。通过这些杂交tt产生的小鼠的远亲杂交背景允许在6个月的时间点时评估小鼠，且同时检查Grg1相关tt肺肿瘤和APCmin/+相关肠息肉。我们发现，这个时间点对于在Grg1过度表达小鼠中肺腺tt瘤的定量来说是理想的。tt
小鼠的小肠和结肠全部被去除，且测量肠息肉的数目和大小。图17示出了具有所tt检查的每个基因型的小鼠体内的肠息肉的平均数目。在不携带APCmin等位基因的Grg1tt(n=6)或Grg5(n=5)小鼠中未发现息肉。在APCmm/+小鼠中平均显现49.9个息肉，且tt类似地，在对照GrglacZ/APCmin/+小鼠中平均有47.6个息肉。在具有Grg1或Grg5过度表tt达的Grg1/APCmin/+或Grg5/APCmin/+小鼠中，息肉的总数没有显著变化，但有少于APCmintttt小鼠中的息肉数目的趋势。tt
C57BL/6J APCmin/+小鼠中的致死率通常与由于一个或一个以上腺瘤的进程而引起的tt肠堵塞有关。腺瘤的大小因此是疾病严重度的一个重要决定因素。在不存在或存在Grg1tt和Grg5过度表达的情况下，我们测量在APCmin/+小鼠体内显现的肠息肉的大小。在过度tt表达Grg1的APCmin+小鼠体内发现的大腺瘤(>2mm)的数目显著减少。Grg5/APCmin/+小鼠在大的肠腺瘤的数目方面未显示出类似的稳固减少。因此，Grg1(全长格劳乔蛋白tt质)的过度表达减少大腺瘤的数目。与其他经检查的组相比，Grg1/APCmin/+小鼠的体重、tt小肠长度和结肠长度没有显著不同。tt
肺肿瘤负荷在携带APCmin等位基因的Grg1小鼠中降低tt
Grg1小鼠在180天时显现8.3+/-6.0(n=28)个在胸膜表面上可见的肺病灶。将一tt代杂交到C57BL/6J背景中没有在肺腺瘤数目方面产生显著变化，表明对Grg1诱导的表tt型没有品系特异性影响(图17，第5列，7.4+/-3.1个表面可见腺瘤)。然而，APCmin等位基因的存在显著降低可在胸膜表面上和肺连续切片中发现的病灶的数目(图17，第tt5列、第7列)。一般来说，Grg1小鼠中的腺瘤大于那些在Grg1/APCmin/+小鼠中发现的tt腺瘤。在高放大倍数下检查腺瘤揭示了两种基因型之间的细胞形态没有可见差异。因此，tt尽管APCmin等位基因并未完全消除由Grg1引起的肺腺瘤的诱导，但肺肿瘤负荷有显著tt降低。tt
材料和方法tt
小鼠品系和基因分型tt
产生APCmin/+小鼠并维持于来自从杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)(缅因州tt巴哈伯(Bar Harbor，ME))获得的储备液的C57BL/6J背景上。iZ/AP-Grg1(品系2F12)tt和iZ/AP-Grg5(品系H2)小鼠已描述于艾伦T.等人“Grg1充当转基因小鼠模型中的肺tt特异性致癌基因”，癌症研究，66：3，1294-1301(2006)(Allen，T.et al.″Grg1Acts as attLung-Specific Oncogene in a Transgenic Mouse Model″，Cancer Res，66：3，tt1294-1301(2006))中。具有未切除的转基因的小鼠被称为Grg1lacZ和Grg5lacZ。具有完全tt切除的iZ/AP-Grg转基因的小鼠被称为Grg1或Grg5。为了产生携带APCmin等位基因和ttiZ/AP-Grg转基因的小鼠，将C57BL/6J、APCmin/+小鼠与携带未切除的转基因(GrglacZ)tt或切除的转基因(Grg)的F2代和F3代iZ/AP-Grg转基因小鼠杂交。通过使用如迪特tt里希W.F.等人“基因鉴别Mom-1，小鼠体内影响Min诱导的肠腺瘤病的主要修饰子基tt因座”，细胞，75：4631-639(1993)(Dietrich，W.F.et al.″Genetic identification of Mom-1，attmajor modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse″，Cell，75：4，tttttt631-639(1993))所描述的引物和条件进行竞争PCR来对APCmin等位基因进行基因分型。tt对于Grg1和Grg5转基因的存在来说，通过耳部穿孔组织的lacZ或hPLAP染色来对小tt鼠进行基因分型。tt
肠息肉和肺腺瘤的定量tt
在约6月龄时将动物处死。小肠和结肠全部从每个小鼠中去除，且用PBS冲洗其内tt含物。将肠固定于4％多聚甲醛/PBS中过夜。第二天用PBS洗涤肠且将其储存于70％乙tt醇(v/v)中。为了进行检查，纵向打开被固定的肠且将内腔侧钉到皮氏培养皿(petri dish)tt中经硬化的3％琼脂糖层上。通过使用解剖显微镜(20-40×)和卡尺，针对整个小肠和tt结肠评定息肉数目和大小。通过测量每个息肉的最大直径来确定息肉大小。可用这种方tt式评定直径小到0.3mm的肠息肉。使用解剖显微镜(10×)针对胸膜表面上的肿瘤来检tt查来自相同小鼠的肺。对石蜡包埋的肺进行连续切片以针对在胸膜表面上不可见的肿瘤tt进行检查。贯穿左叶以100μm间隔切割5μm切片。用苏木素(hematoxylin)和伊红(eosin)tt将切片染色且在100×放大倍数下在视觉上对微腺瘤进行扫描。大到足以存在于相邻切片tt上的腺瘤未被计数两次。对每个小鼠评定十个连续切片。tt
统计分析tt
进行方差分析(ANOVA)以对息肉多样性、小肠长度、结肠长度和重量的显著变tt化进行测试。非参数克鲁斯卡-沃利斯试验(non-parametric Kruskal-Wallis test)和接下tt来的邓恩试验(Dunn′s test)用于评估息肉大小的显著差异。使用曼恩-惠特尼试验分析tt胸膜表面上或肺连续切片中的肿瘤数目变化的统计学显著性。tt
西方印记tt
使用冷的溶解缓冲液将新鲜解剖的组织制成全组织蛋白质提取物，这种溶解缓冲液tt为：150mM NaCl、25％甘油、0.2mM EDTA、20mM Hepes pH7.8、0.5mM DTT、0.5mMttPMSF、0.5mg/ml亮肽素(Leupeptin)、0.7mg/ml胃酶抑素(Pepstatin)、2mg/ml抑肽tt酶(Aprotonin)。对组织进行超声处理且通过简单离心去除碎片。将上清液转移到新鲜tt试管中且立即于-80℃下冷冻。使用布拉德福方法(Bradford method；Bio-Rad)测量蛋tt白质浓度。对于西方印记分析来说，在10％聚丙烯酰胺凝胶上操作100μg溶解产物并转tt移到PVDF膜上。在10mM TrisHCl pH8.0、150mM NaCl、0.1％吐温(TBST)中的tt10％脱脂奶粉中阻断过夜。初级抗体和二级抗体的结合在5％脱脂奶粉TBST中。使用Ctt末端18个氨基酸的肽产生针对Grg5的兔多克隆血清。初级市售抗体是α-TLE1兔多克tt隆血清M-101(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))(侯赛因(Husain)tt等人，1996)、小鼠单克隆α-β-半乳糖苷酶(普洛麦格公司(Promega))、小鼠单克隆α-β-tttttt肌动蛋白AC-15(西格玛公司(Sigma))、α-β-连环蛋白H-102兔多克隆血清(圣塔克鲁tt斯生物技术公司)、小鼠单克隆α-活性β-连环蛋白(α-ABC)8E7(阿普斯特公司(Upstate))tt以及α-磷酸基-β-连环蛋白(Ser-33、37、Thr-41)兔抗血清(细胞信号传导公司(CellttSignaling))。结合HRP的二级抗体购自圣塔克鲁斯生物技术公司。tt
免疫染色tt
去石蜡化、复水和抗原修复之后，用α-Grg3/TLE2兔多克隆血清(圣塔克鲁斯生物tt技术公司)、α-Grg1/TLE1兔多克隆血清、α-β-连环蛋白兔多克隆血清、α-ABC小鼠单克tt隆抗体或α-磷酸基-β-连环蛋白(Ser-33、37、Thr-41)兔抗血清孵育切片。随后用经生tt物素化的二级抗体、抗生蛋白-生物素复合物和DAB(凡克特实验室公司(VectorttLaboratories Inc.))孵育切片。用苏木素对切片进行复染。对于免疫荧光来说，使用结tt合四甲基若丹明的山羊α-小鼠二级抗体(分子探针公司(Molecular Probes))。tt
组织化学染色tt
组织和冷冻切片的固定和染色基本上如洛伯C等人“Z/AP，用于Cre介导的重组的tt双报告基因”，发育生物学，208：2281-292(Lobe C.et al.″Z/AP，a double reporter forttCre-mediated Recombination″，Dev.Biol.208：2281-292)中所描述，但其中在经lacZ或tthPLAP染色的冷冻切片上不使用复染剂。tt
序列表
SEQ ID NO：1tt
人类TLE1蛋白质tt
mfpqsrhptp hqaagqpfkf tipesldrik eefqflqaqy hslklecekltt
asektemqrh yvmyyemsyg lniemhkqte iakrlntica qvipflsqehtt
qqqvaqaver akqvtmaeln aiigqqqlqa qhlshghgpp vpltphpsgltt
qppgipplgg sagllalssa lsgqshlaik ddkkhhdaeh hrdrepgtsntt
sllvpdslrg tdkrrngpef sndikkrkvd dkdsshydsd gdksddnlvvtt
dvsnedpssp raspahspre ngidknrllk kdassspast assasstslktt
skemslheka stpvlksstp tprsdmptpg tsatpglrpg lgkppaidpltt
vnqaaaglrt plavpgpypa pfgmvphagm ngeltspgaa yaslhnmspqtt
msaaaaaaav vaygrspmvg fdppphmrvp tippnlagip ggkpaysfhvtt
tadgqmqpvp fppdaligpg iprharqint lnhgevvcav tisnptrhvytt
tggkgcvkvw dishpgnksp vsqldclnrd nyirsckllp dgctlivggett
astlsiwdla aptprikael tssapacyal aispdskvcf sccsdgniavtt
wdlhnqtlvr qfqghtdgas cidisndgtk lwtggldntv rswdlregrqtt
lqqhdftsqi fslgycptge wlavgmessn vevlhvnkpd kyqlhlhesctt
vlslkfaycg kwfvstgkdn llnawrtpyg asifqskess svlscdisvdtt
dkyivtgsgd kkatvyeviytt
SEQ ID NO：2tt
人类TLE2蛋白质tt
mypqgrhptp lqsgqpfkfs ileicdrike efqflqaqyh slkleceklatt
sektemqrhy vmyyemsygl niemhkqaei vkrlsgicaq iipfltqehqtt
qqvlqavera kqvtvgelns ligqqlqpls hhappvpltp rpaglvggsatt
tgllalsgal aaqaqlaaav kedragveae gsrverapsr saspsppesltt
veeerpsgpg gggkqradek epsgpyesde dksdynlvvd edqpseppsptt
attpcgkvpi ciparrdlvd spaslasslg splprakeli lndlpastpatt
skscdssppq dastpgpssa shlcqlaakp apstdsvalr spltlsspfttt
tsfslgshst lngdlsvpss yvslhlspqv sssvvygrsp vmafeshphltt
rgssvssslp sipggkpays fhvsadgqmq pvpfpsdalv gagiprharqtt
lhtlahgevv cavtisgstq hvytggkgcv kvwdvgqpga ktpvaqldcltt
nrdnyirsck llpdgrsliv ggeastlsiw dlaaptprik aeltssapactt
yalavspdak vcfsccsdgn ivvwdlqnqt mvrqfqghtd gascidisdytt
gtrlwtggld ntvrcwdlre grqlqqhdfs sqifslghcp nqdwlavgmett
ssnveilhvr kpekyqlhlh escvlslkfa scgrwfvstg kdnllnawrttt
pygasifqsk esssvlscdi srnnkyivtg sgdkkatvye vvytt
SEQ ID NO：3tt
人类TLE3蛋白质tt
mypqgrhpap hqpgqpgfkf tvaescdrik defqflqaqy hslkveydkltt
anektemqrh yvmyyemsyg lniemhkqte iakrlntila qimpflsqehtt
qqqvaqaver akqvtmteln aiigqqqlqa qhlshathgp pvqlpphpsgtt
lqppgippvt gsssgllalg algsqahltv kdeknhheld hreressanntt
svspseslra sekhrgsady smeakkrkae ekdslsryds dgdksddlvvtt
dvsnedpatp rvspahsppe ngldkarslk kdaptspasv asssstpssktt
tkdlghndks stpglksntp tprndaptpg tsttpglrsm pgkppgmdpitt
gimasalrtp isitssyaap fammshhemn gsltspgaya glhnippqmstt
aaaaaaaaay grspmvgfdp hppmratglp sslasipggk paysfhvsadtt
gqmqpvpfph dalagpgipr harqintlsh gevvcavtis nptrhvytggtt
kgcvkiwdis qpgskspisq ldclnrdnyi rsckllpdgr tlivggeasttt
ltiwdlaspt prikaeltss apacyalais pdakvcfscc sdgniavwdltt
hnqtlvrqfq ghtdgascid ishdgtklwt ggldntvrsw dlregrqlqqtt
hdftsqifsl gycptgewla vgmessnvev lhhtkpdkyq lhlhescvlstt
lkfaycgkwf vstgkdnlln awrtpygasi fqskesssvl scdisaddkytt
ivtgsgdkka tvyeviytt
SEQ ID NO：4tt
人类TLE4蛋白质tt
mirdlskmyp qtrhpaphqp aqpfkftise scdrikeefq flqaqyhslktt
leceklasek temqrhyvmy yemsyglnie mhkqaeivkr lnaicaqviptt
flsqehqqqv vqaverakqv tmaelnaiig qqlqaqhlsh ghglpvpltptt
hpsglqppai ppigssagll alssalggqs hlpikdekkh hdndhqrvsptt
sasfrgaekh rnsadysses kkqkteekei aarydsdgek sddnlvvdvstt
nedpssprgs pahsprengl dktrllkkda pispasiass sstpsskskett
lslneksttp vsksntptpr tdaptpgsns tpglrpvpgk ppgvdplasstt
lrtpmavpcp yptpfgivph agmngeltsp gaayaglhni spqmsaaaaatt
aaaaaaygrs pvvgfdphhh mrvpaippnl tgipggkpay sfhvsadgqmtt
qpvpfppdal igpgiprhar qintlnhgev vcavtisnpt rhvytggkgctt
vkvwdishpg nkspvsqldc lnrdnyirsc rllpdgrtli vggeastlsitt
wdlaaptpri kaeltssapa cyalaispds kvcfsccsdg niavwdlhnqtt
tlvrqfqght dgascidisn dgtklwtggl dntvrswdlr egrqlqqhdftt
tsqifslgyc ptgewlavgm ensnvevlhv tkpdkyqlhl hescvlslkftt
ahcgkwfvst gkdnllnawr tpygasifqs kesssvlscd isvddkyivttt
gsgdkkatvy eviytt
SEQ ID NO：5tt
人类TLE5蛋白质tt
mchkngfpqe ggitaaflqk rklrlsknhr parakvtehv rgtrpgratatt
gpaastraag slffdrwgnr gpagcrgssh lpqqlkftts dscdrikdeftt
qllqaqyhsl klecdklase ksemqrhyvm yyemsyglni emhkqaeivktt
rlngicaqvl pylsqehqqq vlgaierakq vtapelnsii rqqlqahqlstt
qlqalalplt plpvglqpps lpavsagtgl lslsalgsqa hlskedknghtt
dgdthqeddg eksdtt
SEQ ID NO：6tt
人类TLE1编码序列tt
atgttcccgcagagccggcacccgacgccgcaccaggctgcaggccagcccttcaagttcactatcccggagtccctggaccggtt
attaaagaggaattccagttcctgcaggcgcagtatcacagccttaaattggaatgtgagaaactggcaagtgaaaagacagaaattt
gcagaggcactatgtgatgtattatgaaatgtcatatggattaaacattgaaatgcacaaacagactgaaatcgccaagagattgaattt
acgatttgtgcacaagtcatcccatttctgtctcaggaacatcaacaaacaggtggcccaggctgttgaacgtgcccaaacaggtgacctt
atggcagagttgaatgccatcatcgggcagcagcagttgcaagctcagcatctttctcatggccacggacccccagttccccttacgtt
cctcacccttcgggacttcagcctcctggaatcccgcccctcgggggcagtgccggccttcttgcgctgtctagtgctctgagtgggtt
cagtctcacttggcaataaaagatgacaagaagcaccacgatgcagagcaccacagagacagagagccgggcacaagtaattcctt
ctcctggtcccagacagtctaagaggcacagataaacgcagaaatggacctgaattttccaatgacatcaagaaaaggaaggtggtt
atgataaggactccagccactatgacagtgatggtgacaaaagcgatgacaacttagttgtggatgtgtctaatgaggacccttcttcttt
ccgcgagcaagccctgcccactcgccccgggaaaatggaatcgacaaaaatcgcctgctaaagaaggatgcttctagcagtccatt
gcttccacggcctcctcggcaagttccacttctttgaaatccaaagaaatgagcttgcatgaaaaagccagcacgcctgttctgaaattt
ccagcacaccaacgcctcggagcgacatgccaacgccgggcaccagcgccactccaggcctccgtccaggtctcggcaagccttt
ccagccatagaccccctcgttaaccaagcggcagctggcttgaggacacccctggcagtgcccggcccatatcctgctccttttggtt
gatggtcccccacgctggcatgaacggcgagctgaccagcccaggcgctgcctacgccagtttacacaacatgtcgccccagattt
gagcgccgcagccgccgcggccgccgtggtggcctacgggcgctcccccatggtggggtttgatcctccccctcacatgagagttt
acctaccattcctccaaacctggcaggaatccctggggggaaacctgcatactccttccacgttactgcagacggtcagatgcagctt
ctgtcccttttccccccgacgccctcatcggacccggaatcccccggcatgctcgccagatcaacaccctcaaccacggggaggttt
ggtgtgcgctgtgaccatcagcaaccccacgagacacgtgtacacaggcgggaagggctgcgtcaaggtctgggacatcagcctt
accctggcaataagagccctgtctcccagctcgactgtctgaacagagacaattatatccgttcctgtaaattgctacccgatggctgtt
cactctcatagtgggaggggaagccagtactttgtccatttgggacctggcggctccaaccccgcgcatcaaggcggagctgacgtt
tcctcggcccccgcctgctacgccctggccatcagccccgattccaaggtctgcttctcatgctgcagcgacggcaacatcgctgtgtt
tgggatctgcacaaccagacactagtgaggcaattccagggccacacagacggagccagctgtattgacatttctaatgatggcactt
caagctctggacgggtggtttggacaacacagtcaggtcctgggacctgcgcgaggggcggcagctgcagcagcacgacttcactt
ctcccagatcttctccctggggtactgccccaccggggagtggctggcagtgggcatggagagcagcaatgtggaggtgctgcactt
gtgaacaagcctgacaagtaccagctgcacctgcatgagagctgcgtgctgtccctgaaatttgcttactgtggtaaatggtttgtgatt
gtactggaaaagataacctcctcaatgcttggcggaccccctatggagccagcatattccagtccaaagagtcctcgtcagtgcttatt
gctgtgacatctctgtggatgataagtacatagtcactggctcgggggacaagaaggctacagtctatgaagtcatctactgatt
SEQ ID NO：7tt
人类TLE2编码序列tt
atgtacccccaggggaaggcacccgaccccgctccagtccggccagcccttcaagttctcgatcttggagatctgcgaccgcatcaatt
agaagaattccagtttcttcaggctcaataccacagcctcaagctagaatgtgagaagctggccagcgagaagacggaaatgcagtt
cgacattatgtcatgtattatgagatgtcgtacgggctcaacattgaaatgcataagcaggcggagattgtgaagcgtctgagcggtatt
tctgcgctcagattatccccttcctgacccaggagcatcagcagcaggtgctccaggccgtagaacgcgccaagcaggtcaccgttt
gggggagctgaacagcctcatcgggcagcagctccagccgctgtcccaccacgcaccccctgtgcccctcaccccccgcccagtt
ccgggctggtgggcggcagtgctacggggctgcttgctctgtctggagccctggctgcccaggctcagctggcggcggctgtcatt
aggaggaccgtgcgggcgtggaggccgaggggtccagagtggagagagccccgagcaggagtgcatctccctcgccccctgatt
gagtctcgtggaggaggagcgaccgagtggccctggtggtggcgggaagcagagagcagatgagaaggagccatcaggaccttt
tatgaaagcgacgaagacaagagtgattacaatctggtggtggacgaggaccaaccctcagagccccccagcccggctaccacctt
ccctgcggaaaggtacccatctgcattcctgcccgtcgggacctggtggacagtccagcctccttggcctctagccttggctcaccgtt
ctgcctagagccaaggagctcatcctgaatgaccttcccgccagcactcctgcctccaaatcctgtgactcctccccgccccaggatt
cgcttccacccccgggcccagctcggccagtcacctctgccagcttgctgccaagccagcaccttccacggacagcgtcgccctgtt
aggagccccctgactctgtccagtcccttcaccacgtccttcagcctgggctcccacagcactctcaacggagacctctccgtgccctt
agctcctacgtcagcctccacctgtccccccaggtcagcagctctgtggtgtacggacgctcccccgtgatggcatttgagtctcatctt
cccatctccgagggtcatccgtctcttcctccctacccagcatccctgggggaaagccggcctactccttccacgtgtctgcggacgtt
ggcagatgcagccggttcccttcccctcggatgcactggtaggcgcgggcatcccgcggcacgcccggcagctgcacacgctgtt
gcccatggcgaggtggtctgcgcggtcaccatcagcggctccacacagcatgtgtacacgggcggcaagggctgtgtgaaggtgtt
tgggacgtgggccagcctggggccaagacgcccgtggcccagctcgactgcctgaaccgagacaactacattcgttcctgcaagtt
ttgctgccggatggccggagtctgatcgtgggcggtgaggccagcaccttgtccatttgggacctggcggcgcccaccccccgtatt
tcaaggccgagctgacttcctcagccccagcctgctacgccctggccgtcagccccgacgccaaggtttgcttctcctgctgcagctt
gatggcaacattgtggtctgggacctgcagaatcagactatggtcaggcagttccagggccacacggacggcgccagctgcattgtt
atatttccgattacggcactcggctctggacagggggcctggacaacacggtgcgctgctgggacctgcgggagggccgccagctt
tgcagcagcatgacttcagctcccagattttctccctgggccactgccctaaccaggactggctggcggtcggaatggagagtagctt
aacgtggagatcctgcacgtccgcaagccggagaaataccagctgcacctccacgagagctgcgtgctgtccctgaagtttgcctctt
ctgcggacggtggtttgtgagcaccgggaaggacaacctgctcaacgcctggaggacgccgtacggggccagcattttccagtctt
caaggagtcgtcctcagtcctgagttgtgacatctccagaaataacaaatacatcgtgacaggctcgggggacaagaaggccacctt
gtgtatgaggtggtctactgatt
SEQ ID NO：8tt
人类TLE3编码序列tt
atgtatccgcagggcagacatccggctccccatcaacccgggcagccgggatttaaattcacggtggctgagtcttgtgacaggattt
caaagacgaattccagttcctgcaagctcagtatcacagcctcaaagtggagtacgacaagctggcaaacgagaagacggagatgtt
cagcgccattatgtgatgtactatgagatgtcctatggcttgaacattgaaatgcacaagcagacagagattgcgaagagactgaactt
acaattttagcacagatcatgcctttcctgtcacaagagcaccagcagcaggtggcgcaggcagtggagcgcgccaagcaggtcatt
ccatgacggagctgaacgccatcatcgggcagcagcagctccaggcgcagcacctctcccatgccacacacggccccccggtctt
cagttgccaccccacccgtcaggtctccagcctccaggaatccccccagtgacagggagcagctccgggctgctggcactgggctt
gccctgggcagccaggcccatctgacggtgaaggatgagaagaaccaccatgaactcgatcacagagagagagaatccagtgctt
gaataactctgtgtcaccctcggaaagcctccgggccagtgagaagcaccggggctctgcggactacagcatggaagccaagaatt
gcggaaggtggaggagaaggacagcttgagccgatacgacagtgatggagacaagagtgatgatctggtggtggatgtttccaattt
gaggaccccgcaacgccccgggtcagcccggcacactcccctcctgaaaatgggctggacaaggcccgtagcctgaaaaaagatt
tgcccccaccagccctgcctcggtggcctcttccagtagcacaccttcctccaagaccaaagaccttggtcataacgacaaatcctctt
cacccctgggctcaagtccaacacaccaaccccaaggaacgacgccccaactccaggcaccagcacgaccccagggctcaggttt
cgatgccgggtaaacctccgggcatggacccgataggtataatggcctcggctctgcgcacgcccatctccatcaccagctcctattt
gcggcgcccttcgccatgatgagccaccatgagatgaacggctccctcaccagtcctggcgcctacgccggcctccacaacatcctt
caccccagatgagcgccgccgccgctgctgcagccgctgcctatggccgatcgccaatggtgagctttggagctgttggttttgactt
cctcaccccccgatgcgggccacaggcctcccctcaagcctggcctccattcctggaggaaaaccagcgtactcattccatgtgagtt
tgctgatgggcagatgcagcccgtgcccttcccccacgacgccctggcaggccccggcatcccgaggcacgcccggcagatcatt
acacactcagccacgggggggtggtgtgtgccgtgaccatcagcaaccccagcaggcacgtctacacaggtggcaagggctgctt
gtgaagatctgggacatcagccagccaggcagcaagagccccatctcccagctggactgcctgaacagggacaattacatgcgctt
tcctgcaagctgcaccctgatgggcgcacgctcatcgtgggcggcgagggcagcacgctcaccatctgggacctggcctcgccctt
acgccccgcatcaaggccgagctgacgtcctcggctcccgcctgttatgccctggccattagccctgacgccaaagtctgcttctcctt
tgctgcagcgatgggaacattgctgtctgggacctgcacaaccagaccctggtcaggcagttccagggccacacagatggggcctt
agctgcatagacatctcccatgatggcaccaaactgtggacagggggcctggacaacacggtgcgctcctgggacctgcgggagtt
ggccgacagctacagcagcatgacttcacttcccagatcttctcgctgggctactgccccactggggagtggctggctgtgggcattt
ggagagcagcaacgtggaggtgctgcaccacaccaagcctcacaagaccagctgcacctgcacgagagctgcgtgctctcccttt
caagttcgcctactgcggcaagtggttcgtgagcactgggaaagataaccttctcaacgcctggaggacgccttatggagccagcatt
tatcccagtctaaagaatcctcgtctgtcttgagttgtgacatttcagcggatgacaaatacattgtaacaggctctggtgacaagaagtt
gccacagtttatgaggtcatctactaatt
SEQ ID NO：9tt
人类TLE4编码序列tt
atgattcgcgacctgagcaagatgtacccgcagaccagacacccggcaccgcatcagcctgctcaaccctttaaatttacaatttcctt
gaatcctgtgatcggattaaggaagagtttcagtttttacaggctcaataccacagtctgaagctggaatgtgagaaactcgccagtgtt
agaagacagagatgcagcggcattatgtcatgtattatgaaatgtcctatgggttgaatatagaaatgcacaagcaggcagagattgttt
caagaggctgaatgctatctgtgcacaagtcattcctttcctgtcccaagagcaccagcaacaagtggtgcaggctgtggaacgggtt
ccaagcaggtgaccatggcagaactgaacgccatcattgggcaacaactccaggcccagcatttatcacatggacatggtctcccctt
gtacctctgactccacacccttcagggctccagccccctgccattccacccatcggtagcagtgccgggcttctggccctctccagttt
gctctaggaggtcagtcccatcttccaattaaagatgagaagaagcaccatgacaatgatcaccaaagagacagagactccatcaatt
gagctcttcagtatccccatcagccagtttccgaggtgctgagaagcacagaaactccgcagactactcctcagagagcaaaaagctt
agaaaactgaagaaaaggaaattgcagctcgttatgacagcgatggtgagaaaagtgatgacaacttggtggttgacgtttccaatgtt
aggatccatcttcccctcgagggagcccagcacattcccccagagagaatggcctagacaagacacgcctgctcaagaaagatgtt
ccccgattagtccagcctctattgcatcttccagcagtactccctcctccaaatccaaagaacttagccttaatgaaaaatctactactctt
ccgtctcaaagtccaatacccctactccacgaactgatgcgcccaccccaggcagtaactctactcccggattgaggcctgtacctgtt
gaaaaccaccaggagttgaccctttggcctcaagcctaaggaccccaatggcagtaccttgtccatatccaactccatttgggattgttt
gccccatgctggaatgaacggagagctgaccagccccggagcggcctacgctgggctccacaacatctcccctcagatgagcgctt
agctgctgccgccgccgctgctgctgctgcctatgggagatcaccagtggtgggatttgatccacaccatcacatgcgtgtgccagtt
caatacctccaaacctgacaggcattccaggaggaaaaccagcatactccttccatgttagcgcagatggtcagatgcagcctgtcctt
cttttccacccgacgccctcatcggacctggaatcccccggcatgctcgccagatcaacaccctcaaccacggggaggtggtgtgtt
cgcggtgaccatcagcaaccccacgagacacgtgtacacgggtgggaagggctgcgtcaaggtctgggacatcagccacccagtt
gcaataagagtcctgtctcccagctcgactgtctgaacagggataactacatccgttcctgcagattgctccctgatggtcgcacccttt
aattgttggaggggaagccagtactttgtccatttgggacctggcggctccaaccccacgcatcaaggcagagctgacatcctcggtt
cccccgcctgctatgccctggccatcagccccgattccaaggtctgcttctcatgctgcagcgacggcaacatcgctgtgtgggatctt
tgcacaaccagaccttggtgaggcaattccagggccacacagatggagccagctgtattgacatttctaatgatggcaccaagctcttt
ggacaggtggtttggacaacacggtcaggtcctgggacctgcgcgaggggcggcagctgcagcagcacgacttcacctcccagtt
atcttttctctgggctactgcccaactggagagtggcttgcagtggggatggagaacagcaatgtggaagttttgcatgtcaccaagctt
cagacaaataccaactacatcttcatgagagctgtgtgctgtcgctcaagtttgcccattgtggcaaatggtttgtaagcactggaaagtt
gacaaccttctgaatgcctggagaacaccttatggggccagtatattccagtccaaagaatcctcatcggtgcttagctgtgacatctctt
cgtggacgacaaatacattgtcactggctctggggataagaaggccacagtttatgaagttatttattaatt
SEQ ID NO：10tt
人类TLE5编码序列tt
atgtgtcacaagaatggcttccctcaggaaggcggcattaccgctgcctttctgcagaaaaggaaactaaggctcagcaagaaccatt
ccgcccagccagagccaaggtcacagagcacgtccgtggcacgcgtccaggtcgtgccacagcagggccggcggcttcgacgtt
cgggcagccgggtcccttttctttgacagatggggaaaccgaggcccggccggctgccggggctcctcgcacctaccccagcaatt
ctcaaattcaccacctcggactcctgcgaccgcatcaaagacgaatttcagctactgcaagctcagtaccacagcctcaagctcgaatt
tgtgacaagttggccagtgagaagtcagagatgcagcgtcactatgtgatgtactacgagatgtcctacggcttgaacatcgagatgtt
cacaaacaggctgagatcgtcaaaaggctgaacgggatttgtgcccaggtcctgccctacctctcccaagagcaccagcagcaggtt
tcttgggagccattgagagggccaagcaggtcaccgctcccgagctgaactctatcatccgacagcagctccaagcccaccagcttt
gtcccagctgcaggccctggccctgcccttgaccccactacccgtggggctgcagccgccttcgctgccggcggtcagcgcaggtt
caccggcctcctctcgctgtccgcgctgggttcccaggcccacctctccaaggaagacaagaacgggcacgatggtgacacccatt
ccaggaggatgatggcgagaagtcggattagtt
SEQ ID NO：11tt
小鼠Grg1蛋白质tt
mfpqsrhptp hqaagqpfkf tipesldrik eefqflqaqy hslklecekltt
asektemqrh yvmyyemsyg lniemhkqte iakrlntica qvipflsqehtt
qqqvaqaver akqvtmaeln aiigvrglpg lpptqqqlqa qhlshghgpptt
vpltphpsgl qppgipplgg sasllalssa lsgqshlaik ddkkhhdaertt
hrdrepgtsn sllvpdslrg tdkrrngpef ssdikkrkvd dkdnydsdgdtt
ksddnlvvdv snedpsspha spthspreng idknrllkkd asgspastastt
sgsssslksk evslhekant pvlksstptp rsdmptpgts atpglrpglgtt
kppameplvn qaaaglrtpl avpgpypapf gmvphagmng eltspgaayatt
glhsmspqms aaaaaaaaav vaygrspmvg fdppphmrvp sippnlagiptt
ggkpaysfhv tadgqmqpvpfppdaligpg iprharqint lnhgevvcavtt
tisnptrhvy tggkgcvkvw dishpgnksp vsqldclnrd nyirsckllptt
dgctlivgge astlsiwdla aptprikael tgsapacyal aispdskvcftt
sccsdgniav wdlhnqtlvr qfqghtdgas cidisndgtk lwtggldntvtt
rswdlregrq lqqhdftsqi fslgycptge wlavgmessn vevlhvnkpdtt
kyqlhlhesc vlslkfaycg kwfvstgkdn llnawrtpyg asifqskesstt
svlscdisvd dkyivtgsgd kkatvyeviytt
SEQ ID NO：12tt
小鼠Grg2蛋白质tt
mypqgrhptp lqsgqpfkfs vleicdrike efqflqaqyh slkleceklatt
sektemqrhy vmaaphqcpq ggtsyphwpr lsplqyyems yglniemhkqtt
aeivkrlsai caqmvpfltq ehqqqvlqav drakqvtvge lnsllgqqnqtt
lqplshappv pltprpaglv gagatgllal sgalaaqaql vaavkedrvgtt
vdaegsrvdr aasrssspsp peslveedhp ssrggsgkqq raedkdlsgptt
ydseedksdy nlvvdedqps eppspvttpc gkaplcipar rdltdspasltt
asslgsplpr skdialndlp tgtpasrscg tsppqdsstp gpssashlcqtt
laaqpaaptd sialrspltl sspftssfsl gshstlngdl smpgsyvglhtt
lspqvsssvv ygrsplqmaf eshphlrgss vslpgipvak paysfhvsadtt
gqmqpvpfps dalvgtgipr harqlhtlah gevvcavtis sstqhvytggtt
kgcvkvwdvg qpgsktpvaq ldclnrdnyi rsckllpdgq slivggeasttt
lsiwdlaapt prikaeltss apacyalavs pdakvcfscc sdgnivvwdltt
qnqamvrqfq ghtdgascid isdygtrlwt ggldntvrcw dlregrqlqqtt
hdfssqifsl ghcpnqdwla vgmesshvev lhvrkpekyq lrlhescvlstt
lkfascgrwf vstgkdnlln awrtpygasi fqskesssvl scdisrnnkytt
ivtgsgdkka tvyevvytt
SEQ ID NO：13tt
小鼠Grg3蛋白质tt
mypqgrhpap hqpgqpgfkf tvaescdrik defqflqaqy hslkveydkltt
anektemqrh yvmyyemsyg lniemhkqte iakrlntila qimpflsqehtt
qqqvaqaver akqvtmteln aiigvrglpn lpltqqqlqa qhlshathgptt
pvqlpphpsg lqppgippvt gsssgllalg algsqahlav kdeknhheldtt
hreresstnn svspseslra sekhrgsady smeakkrkae ekdslsrydstt
dgdksddlvv dvsnedpatp rvspahsppe ngldkarglk kdaptspasvtt
asssstpsak tkdlghndks stpglksntp tprndaptpg tsttpglrsmtt
pgkppgmdpi gimasalrtp itltssypap fammshhemn gsltspsayatt
glhnipsqms aaaaaaaaay grspmvsfga vgfdphppmr atglpsslastt
ipggkpaysf hvsadgqmqp vpfphdalag pgiprharqi ntlshgevvctt
avtisnptrh vytggkgcvk iwdisqpgsk spisqldcln rdnyirsckltt
lpdgrtlivg geastltiwd lasptprika eltssapacy alaispdakvtt
cfsccsdgni avwdlhnqtl vrqfqghtdg ascidishdg tklwtggldntt
tvrswdlreg rqlqqhdfts qifslgycpt gewlavgmes snvevlhhtktt
pdkyqlhlhe scvlslkfay cgkwfvstgk dnllnawrtp ygasifqskett
sssvlscdis addkyivtgs gdkkatvyev iytt
SEQ ID NO：14tt
小鼠Grg4蛋白质tt
mirdlskmyP qtrhpaphqp aqpfkftise scdrikeefq flqaqyhslktt
leceklasek temqrhyvmy yemsyglnie mhkqaeivkr lnaicaqviptt
flsqehqqqv vqaverakqv tmaelnaiig qqlqaqhlsh ghglpvpltptt
hpsglqppai ppigssagll alssalggqs hlpikdekkh hdndhqrdrdtt
siksssvsps asfrgsekhr nstdyssesk kqkteekeia arydsdgekstt
ddnlvvdvsn edpgsprgsp ahsprengld ktrllkkdap ispasvassstt
stpsskskel slneksttpv sksntptprt daptpgsnst pglrpvpgkptt
pgvdplassl rtpmavpcpy ptpfgivpha gmngeltspg aayaglhnistt
pqmsaaaaaa aaaaaygrsp vvgfdphhhm rvpaippnlt gipggkpaystt
fhvsadgqmqpvpfppdali gpgiprharq intlnhgevv cavtisnptrtt
hvytggkgcv kvwdishpgn kspvsqldcl nrdnyirscr llpdgrtlivtt
ggeastlsiw dlaaptprik aeltssapac yalaispdsk vcfsccsdgntt
iavwdlhnqt lvrqfqghtd gascidisnd gtklwtggld ntvrswdlrett
grqlqqhdft sqifslgycp tgewlavgme nsnvevlhvt kpdkyqlhlhtt
escvlslkfa hcgkwfvstg kdnllnawrt pygasifqsk esssvlscditt
svddkyivtg sgdkkatvye viytt
SEQ ID NO：15tt
小鼠Grg5蛋白质tt
mmfpqsrhsg sshlpqqlkf ttsdscdrik defqllqaqy hslklecdkltt
aseksemqrh yvmyyemsyg lniemhkqae ivkrlngica qvlpylsqehtt
qqqvlgaier akqvtapeln siirqqlqah qlsqlqalal pltplpvglqtt
ppslpavsag tgllslsalg sqthlskedk nghdgdthqe ddgeksdtt
SEQ ID NO：16tt
人类MDM2蛋白质tt
mvrsrqmcnt hmsvptdgav ttsqipaseq etlvrpkpll lkllksvgaqtt
kdtytmkevl fylgqyimtk rlydekqqhi vycsndllgd lfgvpsfsvktt
ehrkiytmiy rnlvvvnqqe ssdsgtsvse nrchleggsd qkdlvqelqett
ekpssshlvs rpstssrrra iseteensde lsgerqrkrh ksdsislsfdtt
eslalcvire iccersssse stgtpsnpdl dagvsehsgd wldqdsvsdqtt
fsvefevesl dsedyslsee gqelsdedde vyqvtvyqag esdtdsfeedtt
peisladywk ctscnemnpp lpshcnrcwa lrenwlpedk gkdkgeisektt
aklenstqae egfdvpdckk tivndsresc veenddkitq asqsqesedytt
sqpstsssii yssqedvkef ereetqdkee svesslplna iepcvicqgrtt
pkngcivhgk tghlmacftc akklkkrnkp cpvcrqpiqm ivltyfptt
SEQ ID NO：17tt
人类MDM2编码序列tt
atggtgaggagcaggcaaatgtgcaataccaacatgtctgtacctactgatggtgctgtaatt
ccacctcacagattccagcttcggaacaagagaccctggttagaccaaagccattgctttttt
gaagttattaaagtctgttggtgcacaaaaagacacttatactatgaaagaggttcttttttt
tatcttggccagtatattatgactaaacgattatatgatgagaagcaacaacatattgtattt
attgttcaaatgatcttctaggagatttgtttggcgtgccaagcttctctgtgaaagagcatt
caggaaaatatataccatgatctacaggaacttggtagtagtcaatcagcaggaatcatcgtt
gactcaggtacatctgtgagtgagaacaggtgtcaccttgaaggtgggagtgatcaaaaggtt
accttgtacaagagcttcaggaagagaaaccttcatcttcacatttggtttctagaccatctt
tacctcatctagaaggagagcaattagtgagacagaagaaaattcagatgaattatctggttt
gaacgacaaagaaaacgccacaaatctgatagtatttccctttcctttgatgaaagcctggtt
ctctgtgtgtaataagggagatatgttgtgaaagaagcagtagcagtgaatctacagggactt
gccatcgaatccggatcttgatgctggtgtaagtgaacattcaggtgattggttggatcagtt
gattcagtttcagatcagtttagtgtagaatttgaagttgaatctctcgactcagaagatttt
atagccttagtgaagaaggacaagaactctcagatgaagatgatgaggtatatcaagttactt
tgtgtatcaggcaggggagagtgatacagattcatttgaagaagatcctgaaatttccttatt
gctgactattggaaatgcacttcatgcaatgaaatgaatcccccccttccatcacattgcatt
acagatgttgggcccttcgtgagaattggcttcctgaagataaagggaaagataaaggggatt
aatctctgagaaagccaaactggaaaactcaacacaagctgaagagggctttgatgttccttt
gattgtaaaaaaactatagtgaatgattccagagagtcatgtgttgaggaaaatgatgatatt
aaattacacaagcttcacaatcacaagaaagtgaagactattctcagccatcaacttctagtt
tagcattatttatagcagccaagaagatgtgaaagagtttgaaagggaagaaacccaagactt
aaagaagagagtgtggaatctagtttgccccttaatgccattgaaccttgtgtgatttgtctt
aaggtcgacctaaaaatggttgcattgtccatggcaaaacaggacatcttatggcctgctttt
tacatgtgcaaagaagctaaagaaaaggaataagccctgcccagtatgtagacaaccaatttt
caaatgattgtgctaacttatttcccctagtt
SEQ ID NO：18tt
小鼠Grgl编码序列tt
atgttcccgcagagccggcacccaacsccgcaccaagctgcaggccagccctttaagttcactatcccggagtctctggaccggattt
taaagaggaattccagttcctgcaggcgcagtatcacagtcttaaattggagtgtgagaaactggcaagtgaaaagacagaaatgctt
agaggcactacgtgatgtattatgaaatgtcatatggattaaacattgaaatgcacaaacagactgaaatcgccaagagattgaacactt
catttgtgcccaagacatcccatttctgtctcaggaacatcaacaacaggtggcccaggctgtggaacgtgccaaacaggtgaccattt
ggcagagttgaatgccatcatcgggcagcagcagttgcaagctcagcatctctcccatggccatggacccccagtacctctcacgctt
ctcacccttcaggacttcagcctcctggaatcccgcccctcgggggcagtgccggccttcttgcgctgtctagtgctctgagtgggctt
agtctcacttggcaataaaagatgacaagaagcaccatgatgcagagcgccacagagacagagagcctggcacgagtaattcccttt
cttggtcccagacagcctaagaggcacagataagcgcagaaatggtccagagttttccagtgacatcaaaaaaaggaaggtggattt
gataaggataactatgacagtgatggggacaagagtgatgacaacttagttgtggatgtgtctaacgaggacccttcttctccacatgtt
caagccccacacactcaccccgggaaaacggaattgacaaaaaccgtctgctgaagaaagatgcttcaggtagcccggcatccatt
cagcctcctctggaagttcctcttccctgaaatccaaagaagtgagcctgcatgaaaaagccaacactcctgttctgaaatccagcactt
accgacgcctcggagcgacatgccaaccccaggcaccagcgctactccaggcctccgtccaggtcttggcaagcctccagccattt
ggaaccccttgtcaaccaagcagcagctggcctgaggacgcccctggcagtgcctggcccataccctgccccctttggcatggtgtt
ccccatgcgggcatgaacggagagctgaccagccctggtgctgcctatgcaggtctacacagcatgtctccacagatgagcgctgtt
cagctgctgcagctgctgctgctgtggtggcctatgggcgctccccaatggttggttttgatcctcctcctcacatgagagtaccttctatt
tcccccccaacctggcaggaatacctggagggaaaccagcatactccttccacgttactgctgatggccaaatgcagcctgttccttttt
tccccctatgcccctcattggacctggattcccccgacatgctcggcagatcaacaccctcaaccacggggaggtggtgtgcgcagtt
tgaccatcagcaaccccacaaggcacgtgtacacaggtggcaagggctgcgttaaggtgtgggacatcagccaccccggcaacatt
agagccccgtctctcagctggattgtctgaatagagataactacatccgaacctgtaaattgctacctgatgactgtactctcatagtgtt
ggaggggaagccagtactttgtccatttgggacctggcggctccaaccccgcgcatcaaggcggagctgacgtcctcggccccctt
gcctgctacgccctggccatcagccccgactccaaggtctgcttctcatgctgcagtgacggcaacatcgcagtgtgggacctgcatt
caaccagaccctggtgaggcaattccagggccacacagacggagccagctgtattgacatttctaatgatggcaccaagctctggatt
caggcggtttagacaacactgtgaggtcctgggacctgagagaagggcggcagctgcagcagcatgacttcacttcacagatcttctt
tctttgggatactgcccaactggggagtggcttgctgtgggcatggaaagcagcaacgtggaagttctgcatgtgaacaagcctgatt
caagtaccagctgcacctccacgagagctgcgtgctgtccctaaagtttgcttattgtggcaaatggtttgtgagtactggaaaagatatt
acctcctcaatgcttggcggaccccctatggagccagcatattccagtccaaagagtcctcgtcagtgcttagctgtgacatctctgtgtt
gatgataagtacatagtcactggctcgggggacaagaaggctacagtctatgaagtcatctactgatt
SEQ ID NO：19tt
小鼠Grg2编码序列tt
atgtaccctcagggaaggcacccgaccccgctgcagtctggccagcctttcaagttctcagtactggaaatctgtgaccggatcaaatt
gaggaattccagtttcttcaagctcagtaccacagcctcaagctagaatgtgagaagctggccagcgagaagacagaaagcaaatt
ggcattatgtgatggctgcaccccatcagtgtccccagggtggcaccagctatccacactggccaagactgtctcctttgcagtactatt
cgagatgtcctacggactcaacattgagatgcataaacaggctgagattgtgaaacgcctcagtgcgatctgtgcccagatggtccctt
gttcctcactcaggagcatcagcagcaggtgctccaggctgtggaccgagccaagcaggtgaccgtgggggaactgaacagccttt
cctggggcagcagaatcagctccagccgctgtcccacgcaccccccgtgcctctcaccccgcgcccagccggcctggtgggtgctt
cggggccactgggctgctggccctatctggggcactggctgcgcaggcccagctggtggctgccgtaaaggaagaccgtgtggtt
gtgtggacgccgaggggtccagagtggacagagctgccagcaggagttcttccccgtctccccctgagagtctggtggaagaggtt
accatcccagcagccgaggcggcagtgggaaacagcagagagctgaagacaaggatctgtcagggccttatgacagtgaggaatt
gacaagagtgactataacctggtagtgggatgaggaccaaccgtcagagccccccagccctgtgaccaccccttgtgggaaggcgtt
cccctctgcattcctgcccgcagggacctcacagacagtccagcctccttggcctccagtttgggctcaccactccccagaagcaatt
agacatagccctgaacgatcttcccacaggcactcctgcctccaggtcatgtggtacctctccaccccaggactcgtccaccccggtt
ggcccagctcagccagtcacctctgccagctggcggctcagccggcagcacccacagacagcatcgccctgaggagtcccctgtt
accttgtccagccctttcacctcatccttcagcctgggctcccacagcaccctcaatggggacctctccatgcctggctcctatgtcggtt
cctccacctgtccccccaggtcagcagctctgtcgtgtatggacgctcacctctgcagatggcatttgaatcgcacccccatctccgatt
ggctcgtctgtctccttgcctggcatccctgtggctaagccggcttactccttccacgtgtctgcggatggccagatgcagcctgtgctt
ccttcccgtctgatgctctggtaggcacaggcatccctcgccacgcaaggcagctacacacgctggcccacggtgaggtggtgtgttt
gccgtcaccatcagcagctgcacacagcacgtgtacacaggcggcaaaggatgcgtgaaggtgtgggacgtgggccagccggtt
gtagcaagacccctgtggcacagctggattgcctgaaccgagacaactacatccgctcctgcaagctgctgcccgacgggcagatt
gcctgattgtaggtggcgaggccagtaccctgtccatttgggacctggcagcacccacaccacggatcaaagcagagctgacttctt
gtctgccccggcctgctatgctctggccgtcagtccggacgccaaggtctgcttctcctgctgcagcgacggtaacatcgtggtctgtt
ggacctgcagaaccaggccatggtcagacagttccagggccacacggacggggccagctgcatcgacatatcagactacgggatt
cccggctgtggactgggggcctggacaacactgtgcgctgctgggacctgcgcgagggccgccagcttcagcagcatgacttcatt
gttcccagattttctcattgggccactgtcccaatcaggactggttggctgtggggatggagagcagccacgtggaggtcctgcatgtt
tgcgcaagcctgagaagtaccagctccgcctccatgagagctgcgtgctgtcactcaagttcgcttcctgtggacgctggtttgtgatt
gcacaggcaaggacaacctgctcaatgcctggaggacaccctatggggccagcattttcagtccaaagaatcatcttctgtactgatt
gctgcgacatctccaggaataataagtacatcgtgacaggctcaggggacaagaaggccactgtgtatgaggtggtgtactgatt
SEQ ID NO：20tt
小鼠Grg3编码序列tt
atgtatccgcaaggcagacatccggcaccccatcaacccgggcagccgggatttaaattcactgtggccgagtcctgtgacaggattt
caaagacgaattccagttcctgcaagctcagtatcacagcctcaaagtggagtatgacaagctggctaacgagaagacggagatgtt
cagcgccattatgtgatgtactatgagatgtcctatggcttgaatattgaaatgcacaagcagacagagattgcgaagagactgaacatt
caatcctagcccagatcatgccttttttgtcacaggagcatcagcagcaagtggcgcaggctgtggaacgcgccaagcaggtcacctt
atgacggagttgaacgccatcatcggggtacgtggactccccaatctgcctctcacccagcagcaactccaggcccagcacctctctt
ccatgccacgcatggtcccccggtccagctgccaccccacccgtcaggcctccagcctcctgggattcccccagtgacaggaagtt
cagctctgggttgctggcacttggtgccctgggaagtcaagctcacttggcggtgaaggatgagaagaaccaccatgaactggatctt
acagagagagagagtccagcacgaacaattccgtgtcaccctctgaaagcctccgggccagtgagaagcaccggggctctgcatt
gactacagcatggaagccaagaagcggaaggcggaagagaaagacagcctcagcagatacgatagcgatggggacaagagttt
gacgacctggtggtggatgtctctaatgaggacccagcaacaccccgggtgagcccagcacactcccctcctgaaaatgggctggtt
acaaagcccgtggtctgaagaaagatgcccccaccagcccagcctccgtggcttcctccagcagcacaccttcctccaagaccaatt
agaccttggtcataatgacaaatcttccacacctgggctcaagtccaacacaccaacgccaagaaatgatgccccaactccaggcatt
ccagcaccaccccggggctccggtcaatgccgggcaaacctccaggcatggacccgataggtataatggcctcggccctgcgaatt
cacccatcaccctcaccagctcctatccagcaccctttgccatgatgagccaccacgagatgaatggctccctcaccagcccaagctt
gcctatgctggcctacacaacatcccatcccagatgagcgccgccgcagccgctgcagccgccgcctatggccgatcgccaatgtt
gtgagctttggagctgttggttttgaccctcaccccccaatgagggccacaggcctgccttccagtctcgcctccattcctggagggatt
aaccggcatactccttccatgtgagtgctgatgggcagatgcaacctgtgcccttcccccatgatgcactagcaggccctggcattctt
ccaggcatgcccggcagatcaatacgctcagccatggagaggtggtatgtgctgtgaccatcagcaaccccacacgacacgtctatt
cacaggcggcaagggctgtgtgaagatatgggacatcagccagccgggcagcaagagtcccatctcccagctggactgcctgaatt
cagggacaactacatccgctcgtgcaagcttctccccgatgggcgcacgctcattgtgggtggtgaggccagcacgctcaccatcttt
gggacctggcctcacccacaccccgcatcaaggctgagctgacgtcctcggctccagcctgttatgccctggccatcagtcctgattt
gccaaagtctgtttctctgctgcagcgacgggaacattgcggtttgggatctgcacaaccagaccctggtcaggcagttccagggctt
cacacagatggggccagctgtatagacatctctcatgatggcactaagctgtggaccgggggcctggacaacaccgtgcgctccttt
gggacctacgtgaaggacggcagttacagcaacacgatttcacctcccagatcttctccctgggttactgccccactggggagtggtt
ctggccgtgggcatggagagcagcaatgtggaggtcctgcaccacactaagcccgacaaataccagctgcacctgcacgagagtt
ctgcgtgctgtccctcaagttcgcctattgtggcaagtggtttgtgagcactgggaaagacaaccttctcaatgcctggaggacgccttt
tatggagccagcatcttccagtcaaaagaatcctcatctgtcttgagctgtgacatttcagcggatgacaaatatattgtaacaggctcttt
ggtgacaagaaggccacagtttacgaggtcatctactgatt
SEQ ID NO：21tt
小鼠Grg4编码序列tt
atgattcgcgacctgagcaagatgtacccgcagacgcgccacccggcaccgcatcagcctgctcaacccttcaaatttacaatttcatt
gaatcctgtgatcggattaaggaagagtttcagtttttacaggctcaataccacagtctgaagctggaatgtgagaagctcgccagcgtt
agaagacagagatgcagcggcattatgtcatgtattatgaaatgtcctatgggttgaacatagaaatgcacaagcaggcagagattgtt
ttaaacgactaaatgctatctgtgcacaggtcattcctttcctgtcccaagagcaccagcaacaagtggtgcaggctgtggaacgggtt
ccaagcaggtgaccatggcagaactgaacgccatcattgggcaacaactccaagctcagcatttatcacatggacatggtctgccttt
gtgcctctgacaccacacccttcagggcttcagcccccagccatcccacctatcggtagcagtgcaggacttctggcccrctccagttt
gcactaggaggtcagtctcacctcccaattaaggatgagaagaagcaccatgacaatgatcaccaaagagacagagactccatcatt
agagctcttccgtatccccatcagccagtttccggggttctgagaaacataggaactctacagactattcctcagagagcaaaaagctt
agaaaacagaagaaaaagaaattgcagctcgctatgacagtgatggtgagaagagtgatgacaacttggtagctgatgtgtccaattt
gaggatccatcttccccccgaggaagcccagcacattccccaagggagaatggcctggacaagacacgactcctcaagaaagattt
gcccccatcagccccgcttctgttggatcttccagcagtactccttcctccaaatccaaagagcttagccttaatgaaaagtctactacttt
cctgtttcaaagtccaatacccctactccacgaactgatgcacctacccctggcagtaattctactcctggactgaggcctgtacctggtt
aaagccaccaggtgtggaccccttagcatcaagcctgaggaccccgatggctgtaccttgtccatatccaaccccctttgggatcgttt
gccccatgctgggatgaacggagagctgaccagccccggagccgcctatgctgggctacacaacatctccccccagatgagtgctt
agctgctgctgcagctgcggcagcagcagcctatggaagatcacctgtggtgggatttgatccacaccatcacatgcgagtgccagtt
caatacctccaaatctaacaggcattccaggaggaaaaccagcatactcctttcacgtcagtgccgatggccagatgcagcctgtcctt
ctttcccccctgatgccctcattggaccagggatcccccgacacgctcgacagatcaacaccctcaaccatggggaggtggtgtgttt
gcagtgaccatcagcaaccccacaaggcacgtgtacacaggtggcaagggctgtgttaaggtctgggacatcagccaccctggctt
aacaagagcccagtctctcagctggactgtctgaacagggataactacatccgttcctgcagattgctccctgatggtcgcaccttaatt
ttgttggaggggaagccagcacactgtccatctgggacctggcagctccaactccacgcatcaaggcagagctgacatcctcagctt
ccctgcctgctatgctctggccatcagccccgactccaaggtctgcttctcatgctgcagcgacggtaacatcgcagtgtgggatcttt
gcacaaccagactctggtgaggcaattccaggggcacacagatggagccagctgtattgacatttctaatgatggcaccaagctcttt
ggacaggtggtttggacaacactgtgaggtcctgggacctgcgtgaagggcggcagctgcagcaacatgacttcacctctcagattt
cttttcattgggctattgcccaactggagagtggcttgcagtggggatggagaatagcaatgtggaagtattgcatgtcaccaaaccatt
gacaaataccagttgcatcttcatgagagctgtgtgctgtcactcaagtttgcccactgtggcaaatggtttgtaagcactggaaaggatt
caaccttctgaatgcttggaggacgccttatggggccagcatattccagtccaaagaatcctcatcggtgcttagctgtgacatctctgtt
tggatgacaagtacattgtcactggctctggggacaagaaagctacggtttatgaagttatttattaatt
SEQ ID NO：22tt
小鼠Grg5编码序列tt
atgatgtttccgcaaagccggcactcgggctcctcccacctccctcagcagctcaagttcaccacctccgactcctgtgaccgcatctt
aaagatgagttccagctgctgcaagcgcagtatcacagcctgaagctggagtgcgacaagctggccagcgagaagtcagagatgtt
cagaggcattacgtcatgtactatgagatgtcctacggattgaacatcgagatgcacaaacaggcggaaattgtgaagaggctgaattt
gggatttgcgcccaggttctgccctatttgtcacaggagcatcagcagcaggtcctgggagccatcgagagagccaagcaggtcatt
cggctcctgagctgaactccatcatccgacagcagctccaggctcaccagctgtcccagctgcaggcgctggccctgcccctgactt
accgctgcctgtcgggctccagccaccgtccctccctgcagtcagtgcaggcacaggcctgctgtcactctctgctctgggttctcatt
gacccacctctccaaggaggacaatgaacggacacgatggggacacccaccaggaggatgacggagagaagtcggattagtt
