冰冻植物组织Hi-C建库的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。
背景技术
DNA是细胞遗传信息的载体，在生物体内以染色质的形式存在于每个细胞中，并控制着整个生命活动的进程。目前绝大多数对于DNA信息的研究是以研究DNA分子内碱基的序列(DNA的一维信息)来进行，通过分析碱基排列信息来探究生命活动的规律。
真实状态中的细胞核是一个狭小的三维立体空间，直链分子结构的DNA会以复杂的卷曲方式位于细胞核内，原一维DNA序列被赋予三维空间构象，并导致了大量复杂的基因调控作用方式。对此，简单的一维DNA序列信息由于不能提供真实DNA空间分布相关的信息，因此也无法解释由于空间构象导致的一系列基因调控现象。为解决这一问题，目前已有一系列的检测方法。如3c(染色体结构捕获)方法及衍生的4c、5c方法。这些方法均以测序为基本检测手段，利用细胞核内蛋白形成DNA结构固定因子，之后通过对DNA的片段重联等构建带有空间结构信息的DNA序列，最后使用测序技术来检测染色质DNA信息，并计算其在空间中分布和相互作用。尽管此类方法在一定程度上能够提供部分染色质相互作用信息。但由于其方法与技术限制，这一类的方法仅能检测定点或部分的DNA相互作用位点，无法探究全细胞核水平上的立体互作信息。因此不可避免地大量信息将会遗漏。在对于未知相互作用信息的发现上，这一点尤为重要。
近年来随着高通量测序技术的出现，大规模基因组信息的获得变得更加容易。Hi-C技术便是结合高通量测序的方法，对整个细胞核内染色质的信息进行检测的技术。Hi-C技术是染色体构象捕获(Chromosome%20conformation%20capture，简称为3C)的一种衍生技术，是指基于高通量进行染色体构象的捕获，它能够在全基因组范围内捕捉不同基因座位之间的空间交互，研究三维空间中调控基因的DNA元件。
比如Genome-wide%20analysis%20of%20local%20chromatin%20packing%20in%20Arabidopsisthaliana(2015)报道了一种拟南芥新鲜幼苗的Hi-C建库方法，该方法利用甲醛固定染色质结构，然后通过限制性内切酶打断原基因组序列，并进行生物素标记后，再重新连接形成带有结构信息的新DNA分子。在这一过程中，如果两个不同基因组位置的DNA分子片段连接形成一个杂合分子，这将被认为是这两个DNA分子在空间上相互临近的证据。然后对DNA进行纯化并打碎，再针对标记的生物素分子进行钓取，富集获得所需的空间上相互作用的DNA杂合分子。最后构建高通量测序的文库及双端测序检测，获得全染色质在空间上的相互作用信息。
但是，采用该文献报道的方法构建的冰冻植物叶片Hi-C，最终建库失败。另外，现有的新鲜植物叶片固定步骤，对于冰冻植物叶片不适用，固定效果差，样品易降解，最终导致建库失败。
发明内容
本发明旨在提供一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法，以解决现有技术中冰冻植物叶片Hi-C建库失败的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，将冰冻植物组织进行液氮研磨;S2，研磨后的植物组织加入甲醛进行固定，然后加入甘氨酸进行终止固定，得到固定后产物;S3，将固定后产物过细胞筛网，离心获得固定化的细胞;S4，将固定化的细胞进行细胞裂解，然后进行限制性内切酶消化，得到被固定化的染色体片段;S5，对被固定化的染色质片段的末端进行标记物标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段;S6，对平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段;S7，对重新连接的被固定化的染色质片段解除固定化，进行DNA片段的提取，回收DNA片段;S8，将S7中回收的DNA片段，去除带有标记物标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段;S9，将S8得到的纯化的DNA片段，进行DNA打断;S10，利用能够与标记物亲和的磁珠钓取含有标记物标记的DNA片段;S11，S10中获得的标记物标记的DNA片段，进行末端修复加接头;S12，对S11获得的产物进行PCR扩增，获得Hi-C文库。
进一步地，S2中甲醛的体积浓度为5%～10%，固定的温度为室温，固定的时间为30～60min。
进一步地，S2中甘氨酸的浓度为1.5～3M;优选为2.5M。4.1的方法，S1中研磨后的植物组织加入磷酸盐缓冲液。
进一步地，标记物为生物素;能够与标记物亲和的磁珠为链霉亲和素化磁珠。
进一步地，S4中，采用0.1%-1%的SDS进行细胞裂解，温度为37℃，时间为10min;然后加入终浓度为1%-3%的Triton%20X-100，温度为37℃，时间为30min，中和SDS。
进一步地，S4中，限制性内切酶为DnpII。
进一步地，冰冻植物组织为冰冻植物叶片。
进一步地，S9中，打断后的片段大小为350～500bp。
进一步地，方法具体包括以下步骤：称取1～3g冰冻植物叶片，放入预冷的研钵中，进行液氮研磨;液氮研磨后的叶片，转入50ml的离心管中，加入30ml的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为5%～10%的甲醛，室温固定60min;加入2.04mL%202.5M甘氨酸，室温5min，终止固定;固定后的产物，过细胞筛网，收集滤液，进行离心，获得固定化的细胞;固定化的细胞，加入终浓度为0.1%～1%的SDS进行细胞裂解，37℃10min;然后加入终浓度为1%～3%的Triton%20X-100，37℃30min，中和SDS，得到中和产物;在中和产物中，加入200U的DnpII进行酶切，酶切条件37℃过夜，获得被固定化的染色体片段;被固定化的染色质片段的末端进行生物素标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段;生物素标记的是dATP，使用的末端修复酶是Klenow%20Fragment，反应温度为37℃，反应时间为45min;平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段;使用的连接酶为T4%20DNA%20ligase，反应温度为20℃，反应时间为30min;加入蛋白酶K和SDS，消化蛋白质，解除固定化，反应条件65℃90min;蛋白质消化后，加入磁珠进行DNA片段的提取，回收DNA片段;
回收的DNA片段，去除带有生物素标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段，使用的酶是T4%20DNA%20polymerase，反应条件为12℃2h;
纯化的DNA，使用超声打断的物理方法进行打断，打断后的片段大小为350～500bp;
利用链霉亲和素化磁珠钓取含有生物素标记的DNA片段，反应条件为20℃20min;
获得的生物素标记的DNA片段，进行末端修复加接头;
进行PCR扩增，获得Hi-C文库。
应用本发明的建库的方法，利用冰冻植物组织进行Hi-C建库，可以达到与新鲜叶片Hi-C建库同等的有效数据率;本发明已经经过了实验验证，冰冻的玉米、小麦、拟南芥、黄瓜、棉花、油菜叶片均已建库成功，有效数据率>25%，达到新鲜叶片Hi-C建库的水平。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
目前植物样品Hi-C建库的方法，必须使用新鲜的植物叶片进行建库，如果使用冰冻植物叶片进行建库，叶片不易固定，并且固定过程中容易降解，最终建库失败。但是在实际应用过程中，部分林木/药材/野生植物样本无法采用新鲜样本，而且有许多保存时间较久(1个月至半年)的冰冻植物样品建库的需求。为了解决该技术问题，本发明提供了下列技术方案。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，将冰冻植物组织进行液氮研磨;S2，研磨后的植物组织加入甲醛进行固定，然后加入甘氨酸进行终止固定，得到固定后产物;S3，将固定后产物过细胞筛网，离心获得固定化的细胞;S4，将固定化的细胞进行细胞裂解，然后进行限制性内切酶消化，得到被固定化的染色体片段;S5，对被固定化的染色质片段的末端进行标记物标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段;S6，对平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段;S7，对重新连接的被固定化的染色质片段解除固定化，进行DNA片段的提取，回收DNA片段;S8，将S7中回收的DNA片段，去除带有标记物标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段;S9，将S8得到的纯化的DNA片段，进行DNA打断;S10，利用能够与标记物亲和的磁珠钓取含有标记物标记的DNA片段;S11，S10中获得的标记物标记的DNA片段，进行末端修复加接头;S12，对S11获得的产物进行PCR扩增，获得Hi-C文库。
应用本发明的建库的方法，利用冰冻植物组织进行Hi-C建库，可以达到与新鲜叶片Hi-C建库同等的有效数据率
优选的，S2中甲醛的体积浓度为5%～10%，固定的温度为室温，固定的时间为30～60min，此固定能够保持细胞核的完整性，避免样品降解减少后期建库的随机连接，降低噪音。优选的，S2中甘氨酸的浓度为1.5～3M，更有选为2.5M。
在本发明一种典型的实施方式中，S1中研磨后的植物组织加入磷酸盐缓冲液。
本发明中标记物是为了后续DNA的分离，例如标记物可以为生物素，能够与标记物亲和的磁珠为链霉亲和素化磁珠。优选的，细胞裂解中，采用0.1%-1%的SDS进行细胞裂解，温度为37℃，时间为10min;然后加入终浓度为1%-3%的Triton%20X-100，温度为37℃，时间为30min，中和SDS。在本发明中，限制性内切酶可以为HindIII、MboI、AatII、ClaI和DnpII等，优选为DnpII。
典型的，冰冻植物组织为冰冻植物叶片。S9中，打断后的片段大小为350～500bp，便于后续的测序和分析，提高测序的质量;因为片段太长，会降低测序的质量，片段太短会影响mapping率。
在本发明一优选的实施方式中，该方法具体包括以下步骤：
称取1～3g冰冻植物叶片，放入预冷的研钵中，进行液氮研磨;
液氮研磨后的叶片，转入50ml的离心管中，加入30ml的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为5%～10%的甲醛，室温固定60min;
加入2.04mL%202.5M甘氨酸，室温5min，终止固定;
固定后的产物，过细胞筛网，收集滤液，进行离心，获得固定化的细胞;
固定化的细胞，加入终浓度为0.1%～1%的SDS进行细胞裂解，37℃10min;然后加入终浓度为1%～3%的Triton%20X-100，37℃30min，中和SDS，得到中和产物;
在中和产物中，加入200U的DnpII进行酶切，酶切条件37℃过夜，获得被固定化的染色体片段;
被固定化的染色质片段的末端进行生物素标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段;生物素标记的是dATP，使用的末端修复酶是Klenow%20Fragment，反应温度为37℃，反应时间为45min;
平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段;使用的连接酶为T4%20DNA%20ligase，反应温度为20℃，反应时间为30min;
加入蛋白酶K和SDS，消化蛋白质，解除固定化，反应条件65℃90min;蛋白质消化后，加入磁珠进行DNA片段的提取，回收DNA片段;
回收的DNA片段，去除带有生物素标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段，使用的酶是T4%20DNA%20polymerase，反应条件为12℃2h;
纯化的DNA，使用超声打断的物理方法进行打断，打断后的片段大小为350～500bp;
利用链霉亲和素化磁珠钓取含有生物素标记的DNA片段，反应条件为20℃20min;
获得的生物素标记的DNA片段，进行末端修复加接头;
进行PCR扩增，获得Hi-C文库。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
试剂：
37%甲醛
2.5M甘氨酸
20×PBS：细胞缓冲液;
250mM蔗糖：起到保护核酸的作用;
1mM%20MgCl2：维持离子强度;
5mM%20KCl：维持离子强度;
40%(v/v)甘油：维持一定渗透压;
0.25%(v/v)Triton%20X-100：表面活性剂(非离子型去垢剂);
0.1mM%20PMSF(苯甲基磺酰氟)：蛋白酶抑制剂;
0.1%(v/v)β-巯基乙醇：破坏蛋白质三级或四级结构。
操作步骤：
1.按照表1配制细胞核分离缓冲液(Nuclei%20Isolation%20Buffer，NIBuffer)：
表1
配好后冰上放置。
2.称取1g冰冻的植物叶片组织，然后放入预冷的研钵中，加入适量液氮，研磨至粉状(研磨过程中，需要保持一直有液氮，尽量研磨充分)，装入50mL离心管中(装入之前，离心管中先加入少量液氮预冷)。
3.用30mL预冷的NIBuffer重悬组织，加入11.11mL 37%甲醛(终浓度为10%)，室温状态下在交联60min。
4.加入2.04mL 2.5M甘氨酸(终浓度0.118M)，混匀后在真空中放置5min，终止交联。
5.在冰上温和晃动15分钟。
6.先用70μm的细胞筛网过滤，收集滤液。(过滤过程中，如果杂质太多，可以使用2个细胞筛网。注：过滤过程中不要吹打。如果2个细胞筛网不够，可以将使用过的细胞筛网用超纯水冲洗后，重复使用，但不同的样品间不能混用)。
7.再用40μm的细胞筛网过滤，收集滤液。(过滤过程中，如果杂质太多，可以使用2个细胞筛网。注：过滤过程中不要吹打。如果2个细胞筛网不够，可以将使用过的细胞筛网用超纯水冲洗后，重复使用，但不同的样品间不能混用)
8.1800g，4℃离心15min，弃掉上清。
9.用10mL NIBuffer重悬沉淀，轻轻晃动混匀，尽量避免用枪吹打(晃动混不匀，可以用枪轻轻吹打)，1800g，4℃离心5min，弃掉上清，
10.重复步骤9，再洗一遍;(如果上清比较颜色比较深，可以再多洗一遍)
11.根据1g叶片细胞核沉淀的量，确定下步细胞核酶切建库的取样量(一般是0.05～0.25g，)，进行分装。
分装步骤：在上步沉淀中加入500μl的1×PBS，轻轻吹打混匀，测量体积，计算0.05g～0.25g的体积，进行分装。
分装之后保存在-80℃。
细胞核酶切
1.从-80℃取除分装的植物样品，用500ul 1×NEBuffer 2(B7002S，NEB)重悬沉淀，1800g，4℃离心5min，弃掉上清;重复洗一遍。
2.用400μl 1×NEBuffer2重悬沉淀，继续加适量1×NEBuffer 2至500μl，加入55.6μl 1%SDS(终浓度0.1%)，混匀后65℃金属浴中孵育10min(每隔2min轻轻颠倒混匀)。
3.结束后立刻放在冰上。(每管取出10μL作为酶切前DNA完整性的验证。电泳检测前需做如下处理：加入25μL1×NEBuffer 2和7.5μL蛋白酶K，65℃孵育30min，此步骤可以在第二天与酶切后及连接后的产物一起做。)
4.加入61.7μl 10%Triton X-100(终浓度1%)中和SDS，37℃金属浴孵育15min(每隔2min轻轻颠倒混匀)。
5.加入200U(酶活单位)DpnII(DpnII 4μl)，37℃酶切1h(金属浴中进行)。
生物素标记DNA末端，稀释和连接
1.取10μL作为酶切后的验证。电泳检测前需做如下处理：加入25μL1×NEBuffer 2和7.5μL蛋白酶K，65℃孵育30min。
2.65℃20min灭活内切酶。
3.25℃5min平衡至室温。
4.每管配制补平末端体系见表2：
表2
将该体系加入到酶切后的体系中，37℃金属浴中孵育45min(每5min颠倒混匀一次)。
5.75℃，20min，灭活酶。
6.25℃，5min平衡至室温。
7.准备相应数量的1.5ml离心管，加入表3中所示试剂。
2×Rapid Ligation Buffer(T4 DNA连接酶的缓冲液，购自enzymatics，货号：L603-HC-L)，体积是上步反应液体积+6μl，上步反应后，离心量体积，在确定加入量X。
表3
8.连接之后，5000rpm(2500g)离心5min，去上清，用20ul的10X T4 DNA ligasebuffer，90ul NF水重悬。
9.加入50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20ul 10%的SDS，55℃30min。
10.加入20ul 5M NaCl。孵育温度如下：65℃90分钟，25℃5分钟。
注意：DNA纯化磁珠在使用前要恢复至室温并彻底混匀
反应结束后，5000rpm室温离心5min，丢弃沉淀，取上清进行xp(AMPure XP Beads，A63882，Beckman)纯化。加入160μl_XP(0.8倍)磁珠纯化，彻底混匀，室温孵育5min。
注意：样品在磁珠纯化后应呈现半透明状态。
11.将样品管放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。
12.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，加入200μl 80%乙醇，室温孵育30s。
13.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，加入200μl 80%乙醇，室温孵育30s。
14.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，室温孵育磁珠3-5min。
15.取下磁力架上的样品管，用70μl Elution Buffer(购自QIAGEN，货号：19086)重悬磁珠，室温孵育5min。
16.将样品管放置在磁力架上，孵育直到液体澄清，将上清液转移到新管中。
17.Qubit定量。
18.取出20ng DNA用于QC分析，储存在-20℃中。
酶切效率的验证
DNA完整性、酶切后、DNA抽纯后的中间产物三个平行样品可以一起进行检验，使用1%的琼脂糖凝胶电泳，分别取4μL两个留样和50ng中间产物(稀释至10μL)进行验证。
除去末端标记但未连接的DNA
1.取Hi-C中间产物2μg(不足2μg的则全取)，配成表4中的体系：
表4
PCR程序如下：12℃2h。
反应结束后，Qubit定量。
DNA打断
Covaris打断仪器需提前1h开启。
1.加入30μL NF Water将体积补至130μL，加入covaris管中，打断至350-500bp。
Covaris参数：peak power 450;duty factor 30;cycles burst200;time 100s。
2.将片段化的DNA产物转移(用中枪头插小枪头吸取covaris管中的液体)至新的1.5ml离心管中，补水至130μl(磁珠需提前半小时拿至室温)。
目标区域捕获(磁珠需提前半小时拿至室温)
1.震荡重悬M280磁珠，吸取20μL至1.5mL离心管中，将离心管放置在磁力架上等待约1min，待液体澄清后，小心吸取上清弃置。
2.用50μL Binding Buffer(结合缓冲液，具体配置见表5)洗涤磁珠，小心的重悬沉淀，磁力架分离1min，吸去上清。重复洗涤一次。最后用130μL Binding Buffer重悬磁珠。
3.将130μl重悬的磁珠与打断后的130μl样品小心混匀，在金属浴上反应20℃20min。
末端修复加A
4.将PCR管中的溶液放入新的1.5ml离心管中，放置在磁力架上，放置2min，待澄清后取上清留存。
5.用200μL Washing Buffer I(洗脱缓冲液，具体配置见表6)洗涤2次，用200μLEB洗涤2次。
(洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次)
6.配制表7的末端修复加A反应体系：
表5
表6
表7
将体系加入磁珠中，转移至PCR小管，PCR程序如下：37℃30min;72℃30min。
加接头
体系见表8。
表8
PCR程序如下：20℃30min。
文库PCR
1.将以上反应体系放入新的1.5ml离心管中，用200μL Washing Buffer I(表6)洗涤2次，用200μL Washing Buffer II(0.1M NaOH)洗涤1次(尽量快)，用200μL EB洗涤2次。洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次。
2.配制PCR反应体系见表9：
表9
3.将体系加入磁珠中，转移至PCR小管，PCR程序如下表10：
表10
PCR结束后，取上清测Qubit，
样品Qubit值，需>15ng/μl，总量大于750ng，若不够则酌情加2～3循环数。
文库片段选择
1.加入NF Water使样品体积达到100μl。
2.加入60μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。
3.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。
4.转移上清液到一个新管中，丢弃带有磁珠的管。12000rpm离心3min，放回磁力架上，吸取上清到新管中(避免吸到磁珠)。
5.再次转移上清到一个新的管中，丢弃原来的管。
6.加入20μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。
7.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。
8.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80%的乙醇，室温孵育30s。
9.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80%的乙醇，室温孵育30s。
10.弃掉上清。管仍在磁力架上，室温开盖孵育3～5min，晾干乙醇。
11.用52μl EB将DNA从磁珠上洗脱下来，混匀，放置3min后再放回磁力架上。
12.再次转移上清到一个新的管中，丢弃原来的管。
13.加入40μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。
14.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。
15.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80%的乙醇，室温孵育30s。
16.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80%的乙醇，室温孵育30s。
17.弃掉上清。管仍在磁力架上，室温开盖孵育3-5min，晾干乙醇。
18.用22μl EB将DNA从磁珠上洗脱下来，混匀，放置3min后再放回磁力架上，吸取上清至新的1.5ml离心管中，测Qubit，稀释到适合浓度并制备稀释液(2ng/μL，稀释液体积不少于30μl)，出库。
通过上述步骤分别进行冰冻的玉米、小麦、拟南芥、黄瓜、棉花、油菜叶片建库，建库均成功，其中，玉米有效数据率28%;小麦有效数据率25%;拟南芥有效数据率32%;黄瓜有效数据率43%;棉花有效数据率38%;油菜有效数据率35%;有效数据率均>25%，达到新鲜叶片Hi-C建库的水平。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
