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一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库及应用

2020-11-09 00:56:22

　　一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库及应用

　　技术领域

　　本发明涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库及应用。

　　背景技术

　　动脉夹层是指血管内膜撕裂或动脉壁滋养血管破裂，血液进入血管壁内，形成壁内血肿。颅颈动脉夹层是动脉夹层常见的一种形式，是青年人缺血性卒中最常见的病因之一。流行病学研究发现，在45岁以下的首发卒中患者中，10-25%由颅颈动脉夹层所致;此外由于部分动脉夹层不引起任何症状或仅导致轻微的非特异症状，故其真正的发病率可能更高。

　　颅颈动脉夹层作为一种复杂疾病，既可因轻微外伤、瑜伽练习、颈部按摩推拿等环境因素，又可因遗传性结缔组织病如Ehlers-Danlos综合征(IV型)、肌纤维发育不良(FMD)、马凡综合征等遗传因素致病。通常情况下，颅颈动脉夹层主要有以下临床特征：(1)一侧头、面、颈部疼痛;(2)不完全性Horner综合征(眼交感神经麻痹);(3)脑缺血/视网膜缺血或SAH。但临床确诊需要结合传统生化指标(同型半胱氨酸、外周血白细胞、血浆fibrilllin-1水平)以及影像学检查(头颅CT血管成像、数字减影脑血管造影、头颈部磁共振成像)。然而，传统影像学诊断多用于出现临床症状后诊断，对于颅颈动脉夹层疾病的筛查及预防不具备普遍的意义。同时，由于患者首发症状时间跨度大，临床表征多样，病因复杂(环境及遗传因素均有涉及)，导致临床诊断中普遍存在诊断延迟、漏诊及误诊现象。鉴于此，提高诊断准确性对于该病防治具有极其重要临床价值。

　　近年来，现代基因检测技术蓬勃发展，提高了遗传性疾病的分子诊断水平，缩短了诊断时间，降低了检测成本。基因诊断日益受到一线临床工作者的青睐，成为临床医生提高诊断准确性的得力助手。通过对颅颈动脉夹层疾病患者进行基因检测，可帮助医生进行明确诊断，对后续颅颈动脉夹层疾病患者早期个体化防治提供有力证据。

　　二代测序技术是目前公认的重要临床基因检测技术，其具有测序通量高、成本低、可检测突变范围广、灵敏度高等特点(检测灵敏度高达0.1%)。随着二代测序技术突飞猛进的发展，颅颈动脉夹层疾病致病基因突变不断被揭示，但是目前没有一种产品或技术可以一次性检测所有脑血管病相关致病基因突变。因此，开发新的基于二代测序技术检测颅颈动脉夹层致病基因突变的方法十分必要。

　　发明内容

　　针对颅颈动脉夹层致病突变检测技术现状，本发明首要目的是提供一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库，该文库包括85个颅颈动脉夹层致病基因。采用该DNA文库用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。本发明的第二个目的是提供用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库的应用。

　　为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

　　作为本发明的第一个方面，一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库，包括85个颅颈动脉夹层致病基因，其中所述的85个颅颈动脉夹层致病基因如下表所示：

　　作为本发明的第二个方面，一种上述所述的用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，该试剂盒可以用于获取获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息。

　　作为本发明的第二个方面，一种上述所述的用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库在制备诊断装置中的应用。

　　进一步的，所述诊断装置为测序芯片。

　　根据本发明，所述的用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库的应用包括如下步骤：

　　S1.提取检测对象的基因组DNA;

　　S2.对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库;

　　S3.对文库进行定量操作;

　　S4.上机测序;

　　S5.数据分析得到致病位点相关信息;

　　进一步的，步骤S2中的构建文库，具体包括如下步骤：

　　S21.将基因组DNA进行片段化;

　　S22.将片段化的基因组DNA进行末端修复和3'末端添加碱基A;

　　S23.将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以进行有效连接产物的富集;

　　S24.将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物;

　　S25.使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获;

　　S26.将捕获的目标片段分离;

　　S27.加上完整接头获得捕获文库。

　　优选地，S1中的基因组DNA来源于人类。

　　优选地，S1中的提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。

　　优选地，S2和S3中的定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。

　　优选地，S21中对DNA进行片段化的方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。

　　优选地，S24中，使用如SED IQ NO.1和SED IQ NO.2所示的引物序列进行第一次PCR扩增;

　　使用如SED IQ NO.3和SED IQ NO.4所示的引物序列进行第二次PCR扩增。

　　TrueSeq Universal Primer:

　　5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'

　　TrueSeq Primer-Index X:

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA

　　TCT-3';

　　其中，NNNNNN为index标签。

　　优选地，S25中的探针为针对颅颈动脉夹层病相关基因、相关突变点设计得到;捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。

　　优选地，S25中的探针为上述所述的85个颅颈动脉夹层致病基因中的至少一种。

　　优选地，S4中的上机测序通过二代测序平台进行。

　　优选地，S5的具体操作如下：通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进行对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病突变相关信息。

　　与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

　　1、对于早期颅颈动脉夹层患者，未发病时，传统的检测方法无法对其进行确诊，可以采用该DNA温度对其进行诊断，及时发现无痛性颅颈动脉夹层患者及尚未出现临床症状的颅颈动脉夹层患者，对颅颈动脉夹层具有很好的辅助诊断价值。

　　2、本发明的DNA文库覆盖范围广，能够检测85种颅颈动脉夹层的遗传缺陷。

　　3、本发明的DNA文库及其应用，具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。

　　附图说明

　　图1为实施例3的一代测序峰图。

　　图2为实施例4的一代测序峰图。

　　图3为实施例5的一代测序峰图。

　　图4为实施例6的一代测序峰图。

　　具体实施方式

　　以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。

　　本发明的术语：

　　1、“DNA”为脱氧核糖核酸(英文：Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA)是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。

　　2、“Q-PCR”为实时荧光定量核酸扩增(英文：Real-time Quantitative PCR)。一种利用荧光检测达到实时检测PCR状况的PCR技术。

　　3、“reads”为测得的DNA序列。

　　4、“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa(Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等)、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本发明的检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。

　　高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：(1)高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。(2)高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。

　　本发明提供了一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的检测方法，主要技术流程包括提取基因组DNA、文库制备、文库质检定量、上机测序及数据分析。

　　本发明的目标基因捕获的方法不受限制。可以使用PCR富集的方法捕获目标基因。

　　本发明可以使用生物素标记的液相探针与待测样品中的目标区域进行杂交，之后使用链霉亲和素标记的磁珠将杂交产物分离出来，最后通过PCR富集目标区域同时在目标区域两侧连接完整的接头，形成文库。由此，可以将目标基因序列从基因组中捕获并富集。

　　本发明的基因组DNA样本的来源并不受特别限制。以下实施例的基因组DNA样本是从受检人的血浆中分离。更进一步的，基因组DNA样本是从颅颈动脉夹层病患者血浆中分离的。由此，可以有效地对颅颈动脉夹层疾病患者的基因组DNA样本进行检测。

　　本发明使用纯化柱纯化基因组DNA，之后进行凝胶回收电泳，确认DNA质量。

　　本发明的基因组DNA纯化定量之后，取3μg进行DNA片段化，其中使用的片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切、限制性内切酶酶切，优先选用超声破碎。

　　本发明将片段化DNA进行末端修复及3'末端添加碱基A。

　　本发明将3'末端添加碱基A的产物连接扩增接头。

　　本发明将连接产物进行PCR扩增。

　　本发明将生物素标记探针与富集的样品中的目标区域进行杂交。

　　本发明使用链霉亲和素标记磁珠将杂交有目标区域DNA的探针捕获下来。

　　本发明使用PCR富集捕获的目标区域DNA，同时在两端加上完整的文库接头序列。

　　本发明将文库定量，使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit。

　　本发明的探针是针对颅颈动脉夹层相关的85个基因的相关位点进行设计(见表1)。85个基因中，有些是要联合特异，有些是比较新发现的。

　　表1 85个颅颈动脉夹层相关基因

　　本发明使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：

　　Primer F:

　　5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO.1)

　　Primer R:

　　5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO.2)

　　本发明使用Illumina公司通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增，包括一条通用的上游引物，和一条带有标签(Index)序列的下游引物，使用高效的PCR扩增酶进行PCR。使用带有标签(Index)序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。

　　PCR引物序列如下：

　　TrueSeq Universal Primer:

　　5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3';

　　(SEQ ID NO.3)

　　TrueSeq Primer-Index X:

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3';

　　(SEQ ID NO.4)

　　其中，下划线N部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物，用于不同的文库的区分。以下实施例所采用的的碱基组合为TGGTCA。

　　为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行，可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化或琼脂糖胶电泳纯化，优选磁珠纯化。

　　本发明使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量，其中以Ilumina P5、P7作为引物，使用Illumina phix control kit v3作为标准品。

　　本发明通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Miseq平台，并进行数据分析，确定是否存在突变。

　　下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

　　实施例1

　　本实施例是采用Miseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测，具体操作步骤如下：

　　1、按照说明书操作，使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit(高纯度PCR模板制备试剂盒)提取受检人的血浆中的基因组DNA。

　　2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。

　　本实施例中，使用Covaris超声破碎仪，按照标准操作，将3μg DNA片段化。

　　3、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用50μL去核酸酶水洗脱，具体操作如表2所示。

　　表2 磁珠纯化样品的步骤

　　4、使用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4 PNK(T4多聚核苷酸激酶)进行末端修复。反应体系如表3所示。

　　表3 反应体系

　　反应条件为：20℃，30min。

　　5、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品(步骤4中的末端修复产物)，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μL洗脱，具体操作如表4所示。

　　表4 磁珠纯化样品的步骤

　　6、使用Exo(-)Klenow酶对步骤5纯化的DNA样品进行3'端加A碱基。反应体系如表5所示。

　　表5 反应体系

　　反应条件为：37℃，30min。

　　7、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用15μL洗脱，具体操作如表6所示。

　　表6 磁珠纯化样品的步骤

　　8、使用TA DNA连接酶在模板(步骤7纯化的DNA样品)两端加接头序列。反应体系如表7所示。表7 反应体系

　　反应条件为：20℃，15min。

　　9、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μL洗脱，具体操作如表8所示。

　　表8 磁珠纯化样品的步骤

　　10、对连接产物进行扩增，反应体系如表9所示。

　　表9 反应体系

　　PCR反应条件为：98℃预变性2min;98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共循环4次;最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物，即获得两端有接头的PCR产物，用作后序步骤的捕获文库。

　　其中，引物如下：

　　Primer F:

　　5'-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3';(SEQ ID NO.1)

　　Primer R:

　　5'-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。(SEQ ID NO.2)

　　11、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品(步骤10的PCR产物)，磁珠与样品体积比为1.5:1，用30μL洗脱，具体操作如表10所示。

　　表10 磁珠纯化样品的步骤

　　12、使用表1的85个基因的相关位点进行设计的生物素标记的探针与样品(步骤11纯化的PCR产物)杂交，反应体系如表11所示。

　　表11 反应体系

　　其中，library为表1的85个基因的相关位点进行设计的生物素标记的探针中的至少一种。Capture Liprary为步骤11纯化的PCR产物。

　　反应条件为：95℃，5min变性，之后保持在65℃，16-24h。

　　13、使用链霉亲和素标记的磁珠，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如表12所示。

　　表12 步骤

　　14、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。反应体系如表12所示。

　　表12 反应体系

　　PCR反应条件为：98℃预变性2min;98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共循环12次;最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。

　　其中，PCR引物序列如下：

　　TrueSeq Universal Primer:

　　5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3';

　　(SEQ ID NO.3)

　　TrueSeq Primer-Index4:

　　5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'

　　(SEQ ID NO.5)

　　15、使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用30μL去核酸酶水洗脱，具体操作如表13所示。

　　表13 磁珠纯化样品的步骤

　　16、文库质检定量。将上一步得到的文库2.0(Invitrogen)进行定量，使用Q-PCR进行质检。

　　17、上机测序及数据分析。

　　将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。

　　18、数据分析。

　　Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，对于illumina Miseq产生的原始数据进行质控以获得高质量DNA序列数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始变异信息，对原始变异信息进行质控以获得高质量的变异位点，利用clinvar HGMD、GenomAD、1000genome等多个数据库对产生的高质量变异位点进行注释，将注释过的变异位点信息更新到ADMD(Amplicongene Diabetes Mellitus Database)中，并使用ADMD对变异位点进行进一步注释，配合临床表现对可疑位点进行筛选，对于未找到可疑位点的样本进行CNV(拷贝数据变异)筛选，整理诊断报告。

　　实施例2实际验证

　　该先证者病例来源于华山医院神经内科，男性，30周岁。该患者因头晕、脑缺血而入院，影像学诊断为血管狭窄，临床初判为血管狭窄，颅颈动脉夹层。抽取先证者血液样本经由上述捕获测序结果分析，发现先证者存在以上与疾病表型相关性完全符合的变异。具体变异信息如表14所示。

　　表14 变异信息

　　其中：TREX1基因为易感性系统性红斑狼疮、Aicardi-Goutieres综合征、冻疮样狼疮和脑白质营养不良相关性视网膜血管病变相关。该基因导致的这些疾病既有报道为常染色体隐性遗传，又有报道为常染色体显性遗传，假如为常染色体隐性遗传，理论上只有两个等位基因均发生突变(纯合或者复合杂合)才有可能致病;假如为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。先证者在该基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　LDLR基因为家族性高胆固醇血症1型相关。该基因导致的疾病报道为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。先证者在该基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中已有报道，报道表型为：Hypercholesterolaemia，参考文献为：Varret,NAR,26,248,1998，PubMed ID：9399845。理论上可能致病。

　　结果显示：先证者临床影响影像学资料已显示出血管狭窄、路径动脉夹层的表征，故可认为TREX1基因、LDLR基因突变信息可以作为检测颅颈动脉夹层的基因标志。且利用上述方法，一次检测至少检出一种可能致病基因，体现了覆盖全面的特点。

　　实施例3实际验证

　　该先证者病例来源于华山医院神经内科，男性，39周岁。临床初判为血管狭窄，夹层。抽取先证者血液样本经由上述捕获测序结果分析，发现先证者存在与疾病表型相关性完全符合的变异。具体变异信息如下：

　　其中：LOX基因为家族性胸主动脉瘤10型相关。该基因导致的疾病报道为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。先证者在该基因上发现两个杂合变异位点，两个变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中均未有报道。理论上可能致病。

　　FBN1基因为家族性晶状体异位、Geleophysic发育不良2型、马凡脂肪代谢障碍综合征、马凡综合征、MASS综合征、皮肤僵硬综合征、显性Weill-Marchesani综合征2型相关。该基因导致的疾病报道为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中已有报道，报道表型为：Marfan syndrome，参考文献为：Hung,AHG,73,559,2009，PubMed：19839986。理论上可能致病。

　　COL4A5基因为X-连锁的Alport综合征相关。该基因导致的疾病报道为X连锁显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个半合子变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　对变异信息进行一代测序验证，发现先证者相关位置基因确实存在变异，一代测序峰图如图1所示。

　　图1结果显示：先证者临床影像学资料已显示出夹层的表征，经一代测序验证结果与本实验方法获得的结果一致，故可认为LOX基因、FBN1基因、COL4A5基因突变信息可以作为检测颅颈动脉夹层的基因标志。且利用上述方法，一次检测至少检出一种可能致病基因，体现了覆盖全面的特点。

　　实施例4实际验证

　　该先证者病例来源于华山医院神经内科，男性，34周岁。该患者临床初判为双侧椎动脉夹层。抽取先证者血液样本经由上述捕获测序结果分析，发现受检者在产品检测范围内存在与疾病表型相关性较高的变异。具体变异信息如表15所示。

　　表15 变异信息

　　其中：NOTCH1基因为Adams-Oliver综合征5型和主动脉瓣疾病1型。该基因导致的这些疾病为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　EMILIN1基因为结缔组织病伴周围神经病变相关。该基因导致的疾病为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　PKD1基因为多囊肾1型相关。该基因导致的疾病报道为常染色体显性遗传，理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　对变异信息进行一代测序验证，发现先证者相关位置基因确实存在变异，一代测序峰图如图2所示。

　　图2结果显示：先证者临床影像学资料已显示出夹层的表征，经一代测序验证结果与本实验方法获得的结果一致，故可认为NOTCH1基因、EMILIN1基因、PKD1基因突变信息可以作为检测颅颈动脉夹层的基因标志。且利用上述方法，一次检测至少检出一种可能致病基因，体现了覆盖全面的特点。

　　实施例5实际验证

　　该先证者病例来源于华山医院神经内科，男性，34周岁。该患者临床初判为动脉夹层。抽取先证者血液样本经由上述捕获测序结果分析，发现受检者在产品检测范围内存在与疾病表型相关性较高的变异。具体变异信息如表16所示。

　　表16 变异信息

　　对变异信息进行一代测序验证，发现先证者相关位置基因确实存在变异，一代测序峰图如图3所示。

　　图3结果显示：先证者临床影像学资料已显示出夹层的表征，经一代测序验证结果与本实验方法获得的结果一致，故可认为PKD1基因突变信息可以作为检测颅颈动脉夹层的基因标志。且利用上述方法，一次检测至少检出一种可能致病基因，体现了覆盖全面的特点。

　　实施例6实际验证

　　该先证者病例来源于华山医院神经内科，女性，41周岁。该患者临床初判为双侧椎动脉夹层。抽取先证者血液样本经由上述捕获测序结果分析，发现受检者在产品检测范围内存在与疾病表型相关性较高的变异。具体变异信息如表17所示。

　　表17 变异信息

　　其中：GANAB基因为多囊肾病3型相关。该基因导致的这些疾病报道为常染色体显性遗传理论上一个等位基因上发生突变即有可能致病。该样本在此基因上发现一个杂合变异位点，该变异位点在HGMD(人类基因突变数据库)中未有报道。理论上可能致病。

　　对变异信息进行一代测序验证，发现先证者相关位置基因确实存在变异，一代测序峰图如图4所示。

　　图4结果显示：先证者临床影像学资料已显示出夹层的表征，经一代测序验证结果与本实验方法获得的结果一致，故可认为GANAB基因突变信息可以作为检测颅颈动脉夹层的基因标志。且利用上述方法，一次检测至少检出一种可能致病基因，体现了覆盖全面的特点。

　　综上所述，本发明的用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库，该文库包括85个颅颈动脉夹层致病基因。该DNA文库具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。因此在颅颈动脉夹层致病基因领域的检测上具有良好的应用前景。而且，将所述的DNA文库进一步制成诊断试剂盒、诊断芯片等，对于本领域技术人员来说是显而易见的。

　　以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

　　序列表

　　<110> 复旦大学附属华山医院

　　上海昂朴生物科技有限公司

　　<120> 一种用于获取颅颈动脉夹层致病基因突变相关信息的DNA文库及应用

　　<130> 201086

　　<141> 2020-07-08

　　<160> 5

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 35

　　<212> DNA