一种对多种牛的疫病进行联检的基因芯片以及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检定领域，特别是用于检测牛的血清或者其他组织中是否含有(七种疫病当中的)一种或几种病原体的基因芯片检测试剂盒，其可用于流行病学调查以及动物疾病的辅助诊断检测。
背景技术
牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎这几种牛的疫病非常容易发病，严重威胁着我国畜牧产业的发展。建立一种快速高效检测这几种牛的疫病的方法用以这些疾病的预防和防控十分必要。牛布鲁氏菌、结核、炭疽、FMDV、BVDV、BPIV3、IBRV均易感牛，都可以通过呼吸道和消化道感染。在不同程度上均可造成牛消瘦、母牛流产，甚至导致死亡。目前，我国针对这几种病的检测主要以病原分离、血清学试验和分子生物学检测方法为主。血清学方法包括中和试验和Elisa。这些方法均可有效的检测这几种病，但是无法同时检测几种病原的混合感染。
在生物检定领域经常使用的基因芯片中起本质作用的是其中的基因探针序列，通过点样仪，可以把基因探针序列固定在反应孔中固相基质的特定位置以形成微阵列。进行检测时，需先对样品进行处理：在对样品提取核酸后，对核酸进行扩增，然后与基因芯片共同孵育，使得特异性的扩增产物与基因芯片上的固定基因探针相结合。之后清洗去除未结合的扩增产物，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)，其与特异结合在基因探针上的扩增产物形成复合物。最后清洗掉未结合的SA-HRP，加入化学显色底物TMB，产生肉眼可见的蓝紫色信号，进行扫描拍照。
现有技术中存在的问题为，上述牛的疫病经常合并发生，在此情况下，通常需要使用多种基因芯片检测试剂盒，效率低下且耗费人工，容易发生系统误差。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了：
1.一种核酸序列组合，其包括：
用于检测牛布鲁氏菌病的
SEQ%20ID%20NO1:CTGAACCCGGTTATGCCGTACCTCAC
用于检测炭疽16SRDNA的
SEQ%20ID%20NO2:ATCCCGAGCAAATGATCCCT
用于检测炭疽POX1质粒的
SEQ%20ID%20NO3:TCCAGCACTTGTACTTCGCTT
用于检测口蹄疫的
SEQ%20ID%20NO4:ACGCCGTGGGACCATACAGGA
用于检测传染性牛鼻气管炎的
SEQ%20ID%20NO5:CTCGCGGAGCTGGAGGTGATCAG
用于检测牛病毒性腹泻黏膜病的
SEQ%20ID%20NO6:CATGCCCAAAGCACATCTTAACCT
用于检测牛副流感的
SEQ%20ID%20NO7:TTTAGGACATTCGCCACAC。
2.根据项1所述的核酸序列组合，其还包括：
用于检测牛结核的
SEQ%20ID%20NO8:CATCAGCCTGGCCGCACGAGTTA。
3.一种基因芯片，其包括：
反应孔板，以及
固定在所述反应孔板的各反应孔中的、根据项1或2所述的核酸序列组合。
4.根据项3所述的基因芯片，其还包括：固定在所述反应孔板的各反应孔中的阳性对照点、阴性对照点和质控点。
5.根据项1或2的所述的核酸序列组合以及根据项3或4所述的基因芯片在制备对牛的疫病进行检测的试剂盒中的用途。
6.一种试剂盒，其包括：
如项1或2所述的核酸序列组合或如项3或4所述的基因芯片。
7.根据项6所述的试剂盒，其用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在牛布鲁氏菌病、炭疽，口蹄疫，传染性牛鼻气管炎，牛病毒性腹泻黏膜病以及牛副流感中的任意疾病。
8.根据项6或7所述的检测试剂盒，其中，所述生物样本是牛的全血、血浆或血清。
9.根据项6或7所述的检测试剂盒，其还包括：SSC溶液、SDS溶液、柠檬酸钠溶液、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、TMB的溶液、扩增引物和说明书。
10.根据项6或7所述的检测试剂盒，其中，
所述试剂盒还包括扩增引物，所述扩增引物包括：
第一引物组：
MTB-F(SEQ%20ID%20NO.11)：CTCTGAAATTCGCCTCTGTAGTGC
MTB-R(SEQ%20ID%20NO.12)：CATCTTGCTTCGGCGTGTTCC
BPIV3-F(SEQ%20ID%20NO.13)：ATCTGCAGCAAAATTAGACC
BPIV3-R(SEQ%20ID%20NO.14)：ACTCCWATCATTAGACCTGCTA
Brucella-F(SEQ%20ID%20NO.19)：GTCAAGCAGGGCTTTGAAGG
Brucella-R(SEQ%20ID%20NO.20)：CGTCGTCCAAGCCGTTGT
IBRV-F(SEQ%20ID%20NO.21)：TTGGCGCGGACTACGTGTA
IBRV-R(SEQ%20ID%20NO.22)：CCGTGAGGTTTAGGTCCACAA
BVDV-F(SEQ%20ID%20NO.23)：AGTCGTCARTGGTTCGA
BVDV-R(SEQ%20ID%20NO.24)：ARCACCCTATCAGGCTGT;以及
第二引物组：
Anthrax(POX1)-F(SEQ%20ID%20NO15):TTCTAGTGATAACTTACAACTGCC
Anthrax(POX1)-R(SEQ%20ID%20NO.16)：TTCCATCATTGTCACGGTCT
16srDNA-F(SEQ%20ID%20NO.17)：ACCCGCAACAATACTCAC
16srDNA-R(SEQ%20ID%20NO.18)：AAAACTACCGATGCCGCTA
FMDV-F(SEQ%20ID%20NO.25)：TACAAACCTGTGATGGCTTC
FMDV-R(SEQ%20ID%20NO.26)：TGCCACGGAGATCAACT。
在此，上文述及的七种疫病的探针(其中炭疽对应两种探针)与其英文简称、各个基因探针的序列的对应关系见下述表1：
表1.牛疫病联检试剂盒所采用的基因探针：
本发明的技术效果
在此，选择以上七种疫病的基因探针构建本发明的试剂盒的理由是：牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎这几种牛病非常容易发病，严重威胁着我国畜牧产业的发展。建立一种快速高效检测这几种牛病原的方法用以这些疾病的预防和防控十分必要。牛布鲁氏菌、结核、炭疽、FMDV、BVDV、BPIV3、IBRV均易感牛，都可以通过呼吸道和消化道感染。在不同程度上均可造成牛消瘦、母牛流产，甚至导致死亡。目前，我国针对这几种病的检测主要以病原分离、血清学试验和分子生物学检测方法为主。血清学方法包括中和试验和Elisa。这些方法均可有效的检测这几种病，但是无法同时检测几种病原的混合感染，实验流程较复杂，需要消耗大量的人力和物力，对试验检测仪器也有较高要求。而采用本发明的试剂盒，实现了利用同一试剂盒对七种常见疫病进行检测，灵敏度高，阳性结果相互之间没有干扰;提高了工作效率，降低了检测的人工成本。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的具体实施例。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
在此，在本发明中，牛布鲁氏菌病(本申请中对应基因探针Brucella-P1)是指由布鲁氏菌引起的人畜共患的慢性传染病。其特点是生殖器官、胎膜及多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、不孕、睾丸及关节炎等症状。多种动物对本病均有不同程度的易感性，自然感染以羊、牛和猪常见。可用于布鲁氏菌诊断的血清学技术很多，其中应用最广的血清凝集试验、补体结合试验由于对鉴别诊断有意义，也可使用。其它血清方法例如有虎红平板凝集试验、抗球蛋白试验。一般地，生物样品取自流产母畜的子宫、阴道分泌物、血液、脏器及流产胎儿胃内容物、肝、脾、淋巴结、血液以用来做微生物检查。
在此，炭疽病(本申请中对应基因探针16srDNA-P1以及PA-P1)由炭疽杆菌所致，是一种人畜共患的急性传染病。人因接触病畜及其产品及食用病畜的肉类而发生感染。临床上主要表现为皮肤坏死、溃疡、焦痂和周围组织广泛水肿及毒血症症状，皮下及浆膜下结缔组织出血性浸润;血液凝固不良，呈煤焦油样，偶可引致肺、肠和脑膜的急性感染，并可伴发败血症。自然条件下，食草兽最易感，人类中等敏感，主要发生于与动物及畜产品加工接触较多及误食病畜肉的人员。常用的检验手段有间接血凝法，ELISA(酶联免疫吸附实验)法、酶标-SPA法、荧光免疫法等，用以检测血清中的各种抗体，特别是荚膜抗体及血清抗毒性抗体，一般用于回顾性诊断和流行病学调查之用。阿斯可里沉淀试验，对已腐败或干涸的标本，作细菌培养有困难时可采用本试验。如患者、病畜的病灶痂皮、尸体组织及血液、染菌的皮毛及其制品等标本，加水经煮沸或高压提出抗原成分与炭疽沉淀素血清作环状沉淀试验，以间接证明有无炭疽杆菌感染。
在此，口蹄疫(本申请中对应基因探针FMDV-P1)俗名“口疮”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。常用的检测方法有血清学试验，ELISA是目前检测FMDV感染较为常用的诊断方法，其与补结试验、中和试验及间接血凝抑制、免疫扩散沉淀试验相比较、具有灵敏、快速、价廉等优点。
在此，传染性牛鼻气管炎(本申请中对应基因探针IBRV-P1)又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，是I型牛疱疹病毒(BHV-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。临床表现形式多样，以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。确诊需要依靠实验室诊断，包括病毒分离鉴定和血清学试验。通常检测血清样品中BHV1抗体的方法有病毒中和试验(VN)和各种酶联免疫吸附试验(ELISA)。另外，还有琼脂扩散试验和间接血凝试验。
在此，牛病毒性腹泻/黏膜病(本申请中对应基因探针BVDV-P1)是由病毒引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。传染来源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。BVD病毒与猪瘟病毒在琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光试验中有交叉反应，这两种病毒可能含有共同的可溶性抗原。用BVD病毒接种猪后能产生对低毒力猪瘟病毒的免疫力，但不能抵抗强毒株的攻击。BVD病毒与绵羊边界病病毒在琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光试验中也有交叉反应。
在此，牛副流感(本申请中对应基因探针BPIV3-P1)又称运输热，是一种急性呼吸道传染病。以侵害呼吸器官引起高热，呼吸困难和咳嗽为特征。本病原是牛副流感病毒3型。在巴氏杆菌继发情况下使病情恶化。病牛主要的传染源随病牛鼻分泌物排出经呼吸道感染健牛。长途运输天气骤变，寒冷和疲劳等不利因素可促使发病，故此病多在晚秋和冬季发生。一般潜伏期约2～5天，病牛高热，精神沉郁、厌食、咳嗽、流浆液性鼻液，呼吸困难，发现呼噜声。听诊可听到湿啰音，有时听到胸膛摩擦音，有的病牛可发生粘液性腹泻。严重者可在数小时或3～4天内死亡。
在此，牛结核(本申请中对应基因探针Mycobacterium bovis)是由牛型结核分枝杆菌引起的一种人兽共患的慢性传染病，我国将其列为二类动物疫病。以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征。OIE将其列为B类疫病。在国际贸易中，指定诊断方法为结核菌素试验，目前无替代诊断方法。
在本申请的上下文中，“灵敏度”是：能发生显色反应的最小病原体浓度。
在本申请的上下文中，阳性对照点是生物素(Biotin)，其用于监测芯片的反应过程，如果操作正常则显色，操作错误则不显色。阴性对照点为探针稀释磷酸盐缓冲液(Buffer)。
在本申请的上下文中，反应孔板是指一般基因芯片的基板，其通常由化学性质稳定的聚合物制成，并被划分为若干个反应孔，以供平行进行测试，本申请使用常见的48孔反应孔板。
在本申请的上下文中，“固定”是指所有能使特定的核酸序列附着在基因芯片的基板上的化学或者物理手段。常见的方法例如为DNA-水凝胶共聚法、光化学原位固定法等，在本申请中使用的固定方法是化学原位固定法。
实施例A
本发明的试剂盒可以由于若干张芯片组成，每张芯片可以包括若干个反应孔，具体到每个孔而言，其中的探针点样模式见下述表2：
表2.芯片中每个反应孔中的点样模式
其中，“Biotin”为阳性对照点，“Buffer”为阴性对照点，IC-1、IC-2为质控点，具体而言，使用IC-1、IC-2是为了监测PCR过程。若IC-1、IC-2不显色，则说明扩增不充分，检测出阴性结果不可靠。若IC-1、IC-2充分响应，样品探针无响应，样品阴性结果可靠。Brucella-P1(SEQ ID No.1)、Anthrax-16srDNA(SEQ ID No.2)、Anthrax-pox1(SEQ ID No.3)、FMDV-P1(SEQ ID No.4)、IBRV-P1(SEQ ID No.5)、BVDV-P1(SEQ ID No.6)、BPIV3-P1(SEQ IDNo.7)和Mycobacterium bovis(SEQ ID No.8)为七种疫病的探针，分别代表：牛布鲁氏菌病、炭疽(16srDNA)、炭疽(POX1质粒)、口蹄疫、牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻黏膜病、牛副流感、牛结核。
前述质控点IC-1,IC-2均为核酸探针序列，其中：
IC-1序列为(SEQ ID NO 9):ATTACGGGACCTCTGTACCGATCG
IC-2的序列为(SEQ ID NO 10):CCTCGAGGTCGCCACCTTGA
试剂盒的使用方法是：首先，处理样品：在对样品提取核酸后，对核酸进行扩增：对同一个样品扩增两次，第一次用Brucella-F和Brucella-R一对引物、MTB-F和MTB-R一对引物、BVDV-F和BVDV-R一对引物、BPIV3-F和BPIV3-R一对引物、IBRV-F和IBRV-R一对引物来同时进行扩增，第二次用炭疽的POX1(即Anthrax(POX1)-F和Anthrax(POX1)-R一对引物)、16SrDNA引物(16srDNA-F和16srDNA-R一对引物)及FMDV(FMDV-F和FMDV-R一对引物)的引物来同时进行扩增，具体做法是，对同一个样品，使用两管引物扩增，每管取20μL;扩增反应后与芯片共同温育，使得特异性的扩增产物与芯片上的固定探针相结合。之后清洗去除未结合的扩增产物，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP)，其与特异结合在探针上的扩增产物形成复合物。最后清洗掉未结合的SA-HRP，加入化学显色底物TMB，产生肉眼可见的蓝紫色信号，进行扫描拍照。具体的操作步骤为在提取核酸扩增后，进行如下步骤：
1、芯片杂交
分别取20μL PCR产物，加入到80μL的A液(100mL 20×SSC、10mL 10%SDS加纯水定容至1000mL)即杂交液中中，混合均匀后沸水浴5min。将芯片至于孔板孵育器上47℃预热。将已变性的PCR产物加入到芯片中。47℃，200r/min反应20min。
2、芯片洗涤
将47℃预热好的B液(20mL 20×SSC,10mL 10%SDS加纯水定容至1000mL)即洗涤液，每孔200μL淋洗三遍，47℃孔板孵育器洗10min。
3、SA-HRP反应
A液1:2000稀释SA-HRP，100μL/孔，200r/min，47℃反应10min。
4、显色
A液室温淋洗2次，C液(100mL1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL)室温淋洗2次，加入60μL/孔的TMB直接显色。
5、结果判定
阴性质控点的颜色应不显色，阳性质控点的颜色为明显强于阴性质控点的蓝紫色，两个阳性质控点至少有一个显或深或浅的蓝紫色为有效实验结果。
表3.进行扩增反应时所使用的引物序列：
依照上面部分的描述在单个孔内进行探针点样，具体地，试剂盒包括基因芯片和附件，单张基因芯片为6×8的48孔反应板，为每张基因芯片按如下述表4配备附件：
表4.试剂盒中除芯片以外的附件
实验例A1使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染了牛布鲁氏菌病的牛的血清
使用实施例A的试剂盒对感染了牛布鲁氏菌病的牛的血清进行检测，检测结果表明：牛布鲁氏菌病阳性。
实验例A2使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染了结核的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了结核的牛的血清进行检测，检测结果表明：结核阳性。
实验例A3使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染了炭疽的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了炭疽的牛的血清进行检测，检测结果表明：炭疽的16srDNA和POX1质粒均呈阳性。
实验例A4使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染口蹄疫的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了口蹄疫的牛的血清进行检测，检测结果表明：口蹄疫阳性。
实验例A5使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染了病毒性腹泻黏膜病的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了病毒性腹泻黏膜病的牛的血清进行检测，检测结果表明：病毒性腹泻黏膜病阳性。
实验例A6使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染副流感的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了副流感的牛的血清进行检测，检测结果表明：副流感阳性。
实验例A7使用本发明的基因芯片试剂盒A检测感染了传染性鼻气管炎的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和感染了传染性鼻气管炎的牛的血清进行检测，检测结果表明：传染性鼻气管炎阳性。
实验例A8使用本发明的基因芯片试剂盒A检测同时感染了结核和炭疽的牛的血清
使用实施例A的试剂盒和同时感染了结核、炭疽的牛的血清进行检测，检测结果表明：结核、炭疽16srDNA和POX1均呈阳性。
实验例A9使用本发明的基因芯片试剂盒A检测健康的牛的血清
使用实施例A的试剂盒检测来自健康牛的血清，检测结果为：待检测的七种疫病均呈阴性。
对比例D8使用现有技术的基因芯片试剂盒检测同时感染了结核和炭疽强毒的牛的血清
使用现有技术的试剂盒检测同时感染了结核、炭疽的牛的血清，检测结果为：结核、炭疽16srDNA和POX1三个试剂盒分别显示阳性，其灵敏度与实验例A8的灵敏度相类似，但实验更加耗时、耗费试剂。
十个实验例和一个对比例的实验结果综述在如下表5中：
表5各实验例和对比例的总结
尽管以上对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
序列表
<110>中国兽医药品监察所
<120>一种对多种牛的疫病进行联检的基因芯片以及试剂盒
<130>PB00291
<141>2019-04-11
<160>26
<170>SIPOSequenceListing 1.0
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