一株巴达维亚芽孢杆菌BY08及其应用
技术领域
本发明公开了涉及一株巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)，本发明还涉及该巴达维亚芽孢杆菌的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
钾元素是作物生长发育必需的三大营养元素之一，缺钾会影响植物生长、根系发育以及抗病虫害等能力。虽然土壤中钾元素含量丰富，但98％都是以钾长石和云母等矿物形式存在，只有不超过土壤总钾量2％的速效钾是植物可以直接吸收利用的形态(Malinovskaya IM,et al., 1990；Gold-stein AH et al.,1994)。利用微生物溶解土壤中矿物钾是解决土壤缺钾问题的一种经济、有效、环保的措施，这对发展生态农业具有十分重要的意义。
解钾微生物能够分解土壤中的矿物钾，将难溶性的钾矿物转变为可溶性状态并供植物直接吸收利用(谷付旗等，2013)。解钾微生物在土壤中分布范围很广，许多研究者从作物根际土壤、岩石等地筛选出高效的解钾微生物。孙金凤等人(2017)在梨树、农作物及蔬菜等根际土壤中分离获得9株解钾效果较好的解钾菌；陈宇丰等(2015)从海南香蕉园根际土壤中分离、筛选出16株高效解钾菌。
目前，研究报道具有解钾能力的菌株大多为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其中枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)等均具有解钾功能(张爱民等，2015)。Singh等(2010)将具有解钾能力的胶质芽孢杆菌、固氮菌、根瘤菌应用于玉米和小麦，结果显示菌株能改善植株组织中生物量的积累、钾含量以及叶绿素和粗蛋白的含量。Anjanadevi等(2016)将解钾菌——枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌施加于魔芋植株，可极大的提高魔芋块茎的产量。这些结果显示芽孢杆菌在解钾方面的潜力，为挖掘新型解钾微生物资源打下坚实的基础。
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)是于2005年由Jeroen Heyrman等人首次在荷兰的废弃干草田分离获得的新种。Akinyemi等人(2017)从木屑中分离的巴达维亚芽孢杆菌产果胶酶的功能。陈铮等人(2016)首次发现巴达维亚芽孢杆菌可分泌喷他霉素，该霉素可抑制作物立枯丝核菌、水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌等病原菌，且还具有杀害线虫的作用。 Alfonso等(2018)采用平板对峙培养法研究表明，巴达维亚芽孢杆菌对樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)有显著抑制效果。
然而，至今尚未有巴达维亚芽孢杆菌在解钾方面、重金属胁迫、对青枯假单胞菌拮抗作用等方面的报道，因此研究巴达维亚芽孢杆菌对钾长石的活化能力、耐重金属能力以及拮抗能力对于开发新型功能微生物资源具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于根据现有技术中上述问题，提供一株兼具解钾、耐重金属毒性和抑制病原菌功能的巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08。
本发明的第二个目的在于提供巴达维亚芽孢杆菌BY08制备的生物菌剂。
本发明的第三个目的是在于提供巴达维亚芽孢杆菌BY08及其生物菌剂的应用。
为此，本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：
一株巴达维亚芽孢杆菌BY08，保藏编号为CGMCC N0.20024，于2020年06月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。该BY08菌是在广州市白云山植物根际土壤中分离纯化所得，属革兰氏阳性菌，有芽孢，杆状，好氧，在LB固体培养基上培养24h后形成的菌落为不规则形，淡黄色，表面湿润光滑，不粘稠易挑起。采用16S rRNA基因序列进行比对，用Mega软件构建进化系统树，BY08初步鉴定为巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)，菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO:1所示。
采用液体摇瓶和火焰光度计测定，该菌株具溶解钾长石的效果。在加有钾长石的液体解钾培养基培养3天，该菌株释放可溶性钾浓度为11.12mg·L-1。采用平板斑点草坪法(spot-on-lawn assay)测定，与枯草芽孢杆菌模式菌株3610相比较，BY08对番茄青枯病菌RS有一定的抗性；此外，BY08对Cu(II)、Zn(II)、Mn(II)和Pb(II)金属有显著抗性。
本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：
一种含上述的巴达维亚芽孢杆菌BY08发酵液的生物菌剂，所述的巴达维亚芽孢杆菌 BY08数量为3.2×108cfu·mL-1。
该菌剂制备方法为：挑取-80℃甘油冻干管BY08菌株划线在LB培养基上，在37℃生化培养箱中过夜培养。挑取单菌落至LB液体培养基，于180rpm，37℃的摇床中培养12h，得到种子液；将获得的种子液按1％接种量接入新鲜LB液体培养基中，于180转、37℃培养10-14h，得到菌株BY08的发酵液。
本发明的第三个目的通过下述技术方案实现：
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08作为土壤钾活化剂的应用。
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08作为病原菌Rs的拮抗剂的应用。
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08作为土壤重金属修复剂的应用。
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08作为种子发芽促进剂的应用，采用华金甜1号玉米种子，分两个处理组，CK组(不加菌液)和加BY08组，每组处理50颗种子。BY08组将5mL菌悬液和钾长石(106cfu·mL-1)加入放有玉米种子的滤纸片上，CK组加入等量的无菌水和钾长石，于25℃生化培养箱中培养7d。7天后测定种子发芽率、株高和根长。结果表明，玉米种子发芽率、根长与对照相比分别提高了16.6％、14.6％。
巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)BY08作为植物生长促进剂的应用，盆栽试验设置两个处理组，CK组和BY08菌液组，每个处理15株玉米苗，每盆3株，共5盆。加BY08菌液组在玉米移栽时加入BY08菌悬液以及钾长石至玉米的根部，CK组施加等量无菌水和钾长石做对照。7天后测定每个处理所有植株的株高、茎粗、根长、鲜重、叶片数。玉米盆栽试验结果显示，玉米的株高、叶片数、茎粗、鲜重、根长与对照相比分别提高了5.3％、3.1％、10.2％、8.0％和24.20％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出一株(Bacillus bataviensis)巴达维亚芽孢杆菌。此菌株可溶解难溶性钾矿物，并且兼具拮抗，耐重金属的能力，有效促进种子发芽，促进植物生长。本发明是首次挖掘巴达维亚芽孢杆菌的在土壤养分活化、重金属修复、拮抗方面的功能，微生物肥料提供了一种新的菌株资源。
具体表现如下
(1)本发明提供的巴达维亚芽孢杆菌BY08，具有解钾的能力，可溶性钾浓度达11.12mg·L-1。采用平板斑点草坪法测定，与枯草芽孢杆菌模式菌株3610相比较，BY08对番茄青枯病菌Rs有一定的抗性；此外，BY08对Cu(II)、Zn(II)、Mn(II)和Pb(II)金属有显著抗性。
(2)本发明提供的巴达维亚芽孢杆菌BY08能够促进玉米种子发芽，玉米种子发芽率、根长与对照相比分别提高了16.6％、14.6％。
(4)本发明提供的巴达维亚芽孢杆菌BY08能够显著促进玉米植株的生长，施加BY08 的玉米的株高、叶片数、茎粗、鲜重、根长与对照相比分别提高了5.3％、3.1％、10.2％、8.0％和24.20％。
附图说明
图1是BY08芽孢染色的结果，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
图2是BY08系统发育树图。
图3是从广州白云山土壤中筛选得到的不同菌株在液体培养基溶解钾长石，释放出水溶性钾浓度比较结果。
图4是BY08在不同培养基中的生长曲线。
图5是用平板斑点草坪法测定BY08对病原菌Rs的拮抗效果。
图6是BY08在重金属和酸胁迫试验结果：
(a)为Cu(II)金属胁迫结果，(b)为Zn(II)金属胁迫结果，(c)为Cd(II)金属胁迫结果，(d)为HCl酸胁迫结果，(e)为Mn(II)金属胁迫结果，(f)为Fe(III)金属胁迫结果，(g)为Pb(II)金属胁迫结果。
图7是BY08溶血试验结果图。
图8是BY08种子发芽试验和根系发育结果以及数据统计图。
图9是BY08的玉米盆栽试验照片以及15天后玉米各指标的数据统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
以下实施例中除特别说明外，均为本领域中的常规实验方法和操作步骤。
实施例1菌株的分离、纯化
(1)分离
配制解钾固体培养基：葡萄糖5.0g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，三氯化铁0.005g，磷酸三钙2.0g，钾长石2.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，pH为7.0-7.5。
以广东省广州市白云山土壤为筛选土样，准确称取土样10.0g，放入装有90mL无菌水的 250mL三角瓶中(装有玻璃珠5-7颗)，180rpm，摇床振荡30min，使土样充分分散，静置20-30s，取5mL上清液于试管中，90℃加热10min。取100μL溶液加入含有900μL无菌水的2mL离心管中，得到10-2溶液，按照此方法，依次获得10-3、10-4溶液。取100μL10-4的稀释溶液涂布于解钾固体培养基上，置于30℃生化培养箱中培养3-5天。观察是否有菌落生成。
(2)纯化
营养琼脂培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
将在解钾固体培养基生长的BY08在营养琼脂培养基上划线纯化，挑取单菌落接种至LB 液体培养基中，培养12h后，保藏于25％的甘油中，置于-80℃超低温冰箱中保藏。
实施例2特性鉴定
(1)菌落形态特性
在营养琼脂培养基上培养24h后形成的菌落为不规则形，淡黄色，表面湿润光滑，不粘稠易挑起；吲哚阴性。
(2)生长特性
在LB液体培养基中，转速180rpm，温度为37℃，起始pH值为7.0的条件下，培养18h，测得活菌数为3.2×107cfu·mL-1。
(3)革兰氏染色
挑取BY08单菌落于液体LB培养基中培养12h，吸取10μL无菌水于载玻片上，吸取5μL 菌液于加好的无菌水中，混匀，于火焰上进行干燥和固定；结晶紫初染1min，水洗，自然晾干；碘液媒染1min，水洗，晾干；95％的乙醇脱色30s，水洗，晾干；0.5％沙黄复染液复染1min，水洗，晾干，在100倍油镜下镜检观察，菌体呈蓝紫色，见图1(a)，表明BY08为革兰氏阳性菌。
(4)芽孢染色
挑取营养琼脂培养基上培养24h后形成的菌落接种于DSM产孢液体培养基中，在37度℃，转速180rpm，培养12h。取1μL的菌液与20μL的无菌水在载玻片上混匀，涂布自然干燥，通过火焰加热固定，滴加5％孔雀绿染色液，加热，在30s内使其冒蒸汽3-4次，冷却后自来水冲洗30s。加0.5％沙黄复染液，3s后，水洗，待干，用显微镜观察结果。结果见图1(b)，芽孢呈绿色，菌体呈红色，表明BY08具有产芽孢能力。
(5)分子生物学特性
采用试剂盒法(购自百泰克生物技术有限公司)提取BY08总DNA。采用细菌16SrDNA通用引物F27(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和R1492(TAC GGC TAC CTT GTT TCA CTT)，PCR扩增细菌的16SrDNA，20μL的PCR反应体系为：DNA模板1μL，引物1(1mM) 0.5μL，引物2(1mM)0.5μL，ddH2O 10μL，2×Taq PCR Mix 8μL。
PCR反应体系：95℃预变性2min，进入热循环；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸10min。
1.5％琼脂凝胶电泳检测PCR产物的长度和浓度，在1000bp附近出现明显条带，将PCR 扩增产物回收后，测序由广州天一辉远基因科技有限公司完成，将获得的DNA序列输入美国国立生物信息中心NCBI网页上进行Blast比对，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结果发现本发明所述菌株的16SrDNA序列和GenBank中的巴达维亚芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似度为99％(图6)。结合上述平板菌落特性、16SrDNA序列分析结果，初步鉴定该菌为巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)，命名为巴达维亚芽孢杆菌B.bataviensisBY08，菌株的16S rRNA基因序列测定结果如SEQ ID NO:1；所示通用引物27F序列的SEQ ID NO:1；所示通用引物27F序列的SEQ ID NO:2；所示通用引物1492R序列的SEQ ID NO:3。
实施例3 BY08在解钾液体培养基培养下溶解钾长石的效果实验
(1)培养基配制：
①解钾液体培养基：葡萄糖5.0g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，三氯化铁0.005g，磷酸三钙2.0g，钾长石2.0g，蒸馏水1L，pH为7.0-7.5。
②LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，pH7.0-7.5。
③LB固体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，琼脂18.0g， pH7.0-7.5。
(2)待测液制备：
挑取甘油中BY08菌体划线于LB固体培养基平板上，37℃培养12h。将平板上BY08接入含有LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm，摇床培养12h。将培养液转接至新鲜的LB 液体培养基中，在37℃，180rpm的摇床中摇至OD600＝0.4。吸取菌液接种至含有50mL液体解钾培养基的250mL三角瓶中，30℃，180rpm，摇床培养3天。
(3)水溶性钾含量测定
将培养液在8000rpm离心5min，取上清液，采用火焰光度计测定水溶性钾含量，设不接菌为对照，每次处理重复3次。水溶性钾含量变化试验结果见图1。图1的结果表明：BY08与CK对比，培养液中增加了11.12mg·L-1水溶性钾。
实施例4 BY08生长曲线测定
挑取甘油中BY08菌体划线于LB固体培养基平板上，37℃培养12h。将平板上BY08接入含有LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm，摇床培养12h。将培养液转接至新鲜的LB 液体培养基中，在37℃，180rpm的摇床中摇至OD600＝0.4。按照1％接种量，将OD600＝0.4的BY08菌液分别接种于50mL的LB、NB、LBGM三种液体培养基中，在37℃，180rpm的摇床中培养。每隔1h测定培养液的OD值，连续测定12h。生长曲线结果见图4。结果表明，BY08在液体LB中生长最好，其次是NB，最差是LBGM。
实施例5 BY08对青枯假单胞病原菌Rs的拮抗试验
采用平板斑点草坪法(spot-on-lawn assay)测定BY08对病原菌Rs的拮抗效果：分别配置1.5％、0.7％琼脂的CPG培养基。先在培养皿中加入15mL 1.5％CPG培养基，凝固后作为下层平板备用。然后取OD600＝0.4的Rs200μL加到4mL 50℃的0.7％CPG培养基中，混匀后倒入平板，吹干30min。用5mm直径打孔器在平板中心打孔，加50μL OD600＝0.4的BY08、3610、HD02菌株发酵液(3610为阳性对照，HD02为阴性对照)，吹干后，置于30℃培养24h，观察并记录抑菌圈直径。试验结果照片见图5，BY08对Rs的抑菌圈直径为9.52mm，3610 对Rs的抑菌圈直径为10.29mm，HD02对Rs无抑制圈产生。结果表明BY08对病原菌Rs具有显著的拮抗作用。
实施例6 BY08对重金属和酸胁迫的效果实验
(1)培养基配制：
①0.75％LB固体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，琼脂7.5g，pH7.0-7.5。
②1.5％LB固体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1L，琼脂15.0g，pH7.0-7.5。
(2)将平板上BY08菌落接入含有LB液体培养基的试管中，37℃，180rpm，摇床过夜培养。将培养液转接至新鲜的LB液体培养基中，在37℃，180rpm的摇床中摇至OD600＝0.4。取100μL菌液加入至50-60℃的4mL0.75％LB固体培养基中，颠倒混匀倒在1.5％LB固体培养基平板上，在超净工作台上吹20min。将灭菌后的滤纸片放于平板中央，分别在滤纸片上滴加10μL的50、100、200、300、400mM Cu(II)；20、40、60、80、100mM Zn(II)； 10、20、30、40、50mMCd(II)；1、2、3、4、5、6M HCl；20、40、60、80、100mM Mn (II)；200、400、600、800、1000mM Fe(III)以及200、400、600、800、1000mM Pb(II)。吹干后放于37℃生化培养箱中培养24h。用枯草芽孢杆菌模式菌株3610作为对照，记录透明圈直径大小，试验结果比较见图5。
试验结果表明，BY08在Cu(II)、Zn(II)、Mn(II)、Fe(III)、Pb(II)金属的胁迫下，产生的透明圈直径比3610小，说明BY08对Cu(II)、Zn(II)、Mn(II)、Fe(III)、Pb(II) 金属表现出明显抗性；BY08对Cd(II)金属胁迫的抗性与3610相差不大；在低浓度的HCl 胁迫下，BY08的抗性比3610弱，而在高浓度的6M HCl胁迫下，BY08的抗性比3610强。这些试验结果对今后将该菌应用于重金属土壤、酸性土壤等方面提供工作基础。
实施例7 BY08具有溶血安全性
将BY08从LB固体平板上挑取单菌落于液体LB中，在37℃，180rpm过夜培养后，转接于新鲜LB液体培养基，摇至OD600＝0.4，取3μL菌液滴加至血琼脂平板上，于37℃培养 24h，观察有无溶血现象。结果见图6，表明BY08菌株为溶血阴性。
实施例8 BY08促进玉米种子发芽的效果试验
(1)菌悬液制备：
①将菌种活化后接入LB液体培养基，过夜培养后转接至新鲜的LB液体培养基中，摇至 OD600＝1.0；
②将菌液于离心机中离心，转速为8000rpm，离心3min；
③将菌体重悬于含有0.25g钾长石的等量无菌水中；
④用于玉米种子的菌株浓度为107cfu·mL-1的菌悬液。
(2)种子表面消毒处理：用75％乙醇浸泡2min，用无菌水清洗2遍，再用2％次氯酸钠溶液浸泡2min，再用无菌水清洗2-3遍，置于灭菌滤纸上自然晾干。
(3)采用BY08和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第一组采用10mLBY08 菌悬液，第二组采用10mL无菌水作为空白对照，用CK表示)。各处理设2个重复，各重复含25颗玉米种子(随机选取表面灭菌后大小均一的种子)。用灭菌镊子将滤纸放入培养皿中，将菌悬液加入到滤纸片上，将玉米种子放置滤纸片上，于25℃生化培养箱中培养7d，每天浇水适量，每皿的水量相同。7天后测定种子发芽率和根长。试验结果表明，BY08能够促进玉米种子发芽和根系生长(见图7)。与对照相比，种子发芽率和根系长度分别提高了16.6％、 14.6％。
实施例9 BY08促进盆栽玉米生长效果的试验
(1)菌悬液制备：
①将菌种活化后接入LB液体培养基，过夜培养后转接至新鲜的LB液体培养基中，摇至 OD600＝1.0；
②将菌液于离心机中离心，转速为8000rpm，离心5min；
③将菌体重悬于等量无菌水中；
④用于玉米盆栽的菌株浓度为每克土106cfu的菌悬液。
(2)玉米育苗：
玉米种子水洗催芽，用纱布浸润保存水分，放置25℃生化培养箱中，待种子芽长1cm左右移至50孔育苗盆中，每孔1粒。每天浇水适量，待玉米苗长出3片叶子时，备用移苗。
(3)试验设计：
用BY08和空白对照进行效果对比试验，共分2个处理组(第一组加入BY08菌+钾长石，用BY08表示；第二组加入等量的无菌水+钾长石作为空白对照，用CK表示)，每个处理重复5次。各处理每盆装0.9kg土，施用化学肥料尿素、过磷酸钙，施用量分别为每千克土50mgN，25mg P2O5。
移苗前，挑选长势大小均一的玉米苗移至盆中，覆土前将菌悬液施加至玉米根际，每天浇水适量，每盆水量相同，注意不要使水流出盆底以免菌液和肥料损失而误差。移苗后每隔 7天进行拍照(图8)。第15天进行收样，对玉米植株的株高、茎粗、叶片数、根长和鲜重进行测量。结果表明：玉米的株高、叶片数、茎粗、鲜重、根长与对照相比分别提高了5.3％、3.1％、10.2％、8.0％和24.20％。说明加入本发明分离的巴达维亚芽孢杆菌BY08能够显著促进土壤有效钾的释放、提高玉米对土壤钾元素的吸收进而促进植株生长。
序列表
<120> 一株巴达维亚芽孢杆菌BY08及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1417
<212> DNA
<213> Bacillus bataviensis
<400> 1
aagtcgagcg aatcattggg agcttgctcc ctttggttag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata acttcgggaa accggagcta ataccggata 120
atctttttcc tctcatgagg aaaaactgaa agacggtttc ggctgtcact tacagatggg 180
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