一种组合物及使用其治疗及／或预防失智症的用途
技术领域
本发明是关于一种组合物，其包含一第一成分以及一第二成分，其中该第一成分是黄嘌呤(xanthine)及其衍生物的至少一个，该第二成分是二苯基庚烷类(diarylheptanoid)、二苯基庚烷类的衍生物、儿茶素(catechin)、儿茶素的酯类、类黄酮(flavonoid)及异类黄酮(isoflavonoid)的至少一个，且该第一成分视需要与该第二成分以结合成一加合物(adduct)的形式存在。本发明也关于该组合物于治疗及/或预防失智症的应用，包括使用该组合物制备一用于治疗及/或预防失智症的药剂的用途、以及使用该组合物于治疗及/或预防失智症的方法。
背景技术
失智症，是一种包含各种脑部功能退化跟障碍的症候群。罹患失智症的患者会出现语言能力、空间感、计算力、判断力、抽象思考能力、注意力等各方面的功能退化，同时可能出现干扰行为、个性改变、妄想或幻觉等症状。前述症状会随着病程发展而渐趋严重，并逐渐影响患者的日常生活与人际关系，患者于后期甚至无法独立生活而需要照护者全天候陪伴。因此，失智症不仅是患者本身的疾病问题，更会使照护者身心承受巨大的压力。随着全球人口老化，罹患失智症的人数不断增加，高昂的社会照护成本也是不容忽视的问题。
失智症可大分为以下四种类型：退化性、血管性、混合型(退化性及血管性并存)以及可逆型。其中，仅可逆型失智症是因其他疾病所引起的暂时性失智症，可随病因的消失而治愈。退化性失智症则包括阿兹海默症 (Alzheimer’s Disease)、额颞叶型失智症(Frontotemporal lobe degeneration)、路易氏体失智症(Dementia with Lewy Bodies)、帕金森氏症(Parkinson's disease)等，其中路易氏体失智症与帕金森氏症具有相似的病理机制(例如：路易氏体的不正常沉积)，且临床特征非常相似。其他与失智症相关的病理机制则包括：β-类淀粉蛋白沉积、τ蛋白磷酸化、血液及脑部功能障碍、病毒感染等。由于目前尚未了解导致失智症的确切机制，故业界难以设计出有效治疗失智症的药物。
目前针对失智症所开发的药物包括NMDA受体拮抗剂(例如：忆必佳 (memantine))以及乙酰胆碱酶抑制剂(例如：爱忆欣(donepezil)、忆思能(rivastigmine)、佳能忆(galantamine))，然而，前述药物都只能针对单一神经传导物质进行调控，治疗失智症的效果并不显着，至多仅能稍微延缓失智症的进程。因此，临床上亟需一种可针对失智症繁杂的病理机制的综合手段，以有效减轻或反转失智症的症状。
除了上述化学合成药物以外，业者对于失智症的治疗，也朝向植物萃取物的方向进行研究，并发现部分萃取自植物的化合物具有发展成治疗及/或预防失智症的药物的潜力。其中，姜黄素虽因在细胞实验中具有保护神经细胞及降低β-类淀粉蛋白沉积的效果而被视为潜力化合物，然而，后续对失智症患者所进行的临床实验结果却显示，姜黄素并无法有效改善失智症患者的症状(此可参见Goozee等人的文献：Examining the potentialclinical value of curcumin in the prevention and diagnosis of Alzheimer’sdisease,115,449-465，该文献全文并于此处以供参考)。究其原因在于，姜黄素因无法有效通过血脑障壁(blood-brain barrier，BBB)，故其生物利用性(bioavailability)不佳。
发明内容
本发明的一目的，在于提供一种组合物，其包含一第一成分以及一第二成分，其中，该第一成分是黄嘌呤(xanthine)及其衍生物的至少一个，该第二成分是二苯基庚烷类(diarylheptanoid)、二苯基庚烷类的衍生物、儿茶素(catechin)、儿茶素的酯类、类黄酮(flavonoid)及异类黄酮(isoflavonoid) 的至少一个，且该第一成分视需要与该第二成分以结合成一加合物的形式存在。
一般而言，以该第一成分及该第二成分的总重量计，该第一成分占0.025 至25重量百分比。较佳地，以该第一成分及该第二成分的总重量计，该第一成分占0.05至10重量百分比。更佳地，以该第一成分及该第二成分的总重量计，该第一成分占0.1至5重量百分比。其中，若第一成分与第二成分结合成一加合物，则前述重量百分比是指以来自第一成分的部分的重量为分子，加合物的重量为分母，计算所得的百分比。另外，若仅一部分第一成分与第二成分结合成加合物，则该第一成分重量百分比是指以加合物中来自第一成分的部分以及未与第二成分结合的第一成分的总量为分子，第一成分、第二成分以及加合物的总量为分母，计算所得的百分比。
较佳地，根据本发明所提供的组合物中的第一成分是以下的至少一个：咖啡因(caffeine)、胺茶碱(aminophylline)、异丁基-1-甲基黄嘌呤 (3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、副黄嘌呤(paraxanthine)、配妥西菲林(pentoxifylline)、可可碱(theobromine)及茶碱(theophylline)。
于根据本发明所提供的组合物中，在作为第二成分的物料中，该二苯基庚烷类较佳是姜黄素(curcumin)，该二苯基庚烷类的衍生物较佳是类姜黄素 (curcuminoid)、去甲氧姜黄素(demethoxycurcumin)及去二甲氧姜黄素 (bisdemethoxycurcumin)的至少一个，该儿茶素的酯类较佳是表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，该类黄酮较佳是芹菜素 (apigenin)、花青素(anthocyanin)、葱醌(anthraquinone)、槲皮素(quercetin)、及木犀草素(luteolin)的至少一个，以及该异类黄酮较佳是染料木黄酮(genistein)、黄豆甘原(daidzein)及甘胺黄酮(glycitein)的至少一个。
较佳地，根据本发明所提供的组合物还包含一第三成分，其是以下的至少一者：类胡萝卜素(carotenoid)、玉米黄素(zeaxanthin)、番茄红素(lycopene)、胡萝卜素(carotene)、藏花酸(carotenoid crocetin)、类胡萝卜酸(carotenoid acid)及ω-3脂肪酸(ω-3fatty acid)。
本发明的另一目的，在于提供一种使用上述组合物于制备一用于治疗及 /或预防失智症的药剂的用途。较佳地，该失智症是以下的至少一个：阿兹海默症及帕金森氏症。
本发明的又一目的，在于提供一种治疗及/或预防失智症的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的上述组合物。较佳地，该失智症是以下的至少一个：阿兹海默症及帕金森氏症。
本发明的详细技术内容及部分具体实施方案，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域普通技术人员据以明了本发明的特征。
附图说明
图1A至图1F是显示本发明组合物对海马回中CA1区域的Aβ1-42蛋白沉积的影响，其中，图1A是未经处理的SD大鼠，即“控制”组；图1B是以FAB(ferrous amyloid buthionine)溶液灌流处理的SD大鼠，即“FAB”组；图1C是以FAB溶液灌流处理，并以包含姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯及芹菜素的组合物进行腹腔注射的SD大鼠，即“配方1”组；图1D 是以FAB溶液灌流处理，并以包含姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯、花青素及咖啡因的组合物进行腹腔注射的SD大鼠，即“配方2”组；图1E 是以FAB溶液灌流处理，并以包含姜黄素、表没食子儿茶素没食子酸酯、葱醌及咖啡因的组合物进行腹腔注射的SD大鼠，即“配方3”组；图1F显示将图1A至图1E的结果量化后的长条图(比例尺：50微米；*表示与控制组有显着差异，p<0.05；#表示与FAB组有显着差异，p<0.05)。
图2A至图2F是显示本发明组合物对海马回中CA1区域的小神经胶质细胞密度的影响，其中图2A至图2E分别显示上述“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组的结果的照片图，图2F显示将图2A至图2E的结果量化后的的长条图(比例尺：100微米；*表示与控制组有显着差异，p<0.05)。
图3A至图3F是显示本发明组合物对海马回中CA1区域的锥状神经细胞的存活率的影响，其中图3A至图3E分别显示上述“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组的结果的照片图，图3F显示将图3A至图3E的结果量化后的长条图(比例尺：100微米；*表示与控制组有显着差异，p<0.05；#表示与FAB组有显着差异，p<0.05)。
图4A至图4F是显示本发明组合物对海马回中CA1区域的锥状神经细胞的远端顶端树突(distal apical dendrite)的树突棘(dendritic spine)密度的影响，其中图4A至图4E分别显示上述“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组的结果的照片图，图4F显示将图4A至图 4E的结果量化后的长条图(比例尺：10微米；*表示与控制组有显着差异， p<0.05；#表示与FAB组有显着差异，p<0.05)。
图5A至图5E是显示本发明组合物对内侧中隔核(medial septal nucleus) 中胆碱性神经元数量的影响，其中图5A至图5D分别显示上述“控制”组、“FAB”组、“配方2”组及“配方3”组的结果的照片图，图5E显示将图 5A至图5D的结果量化后的长条图(比例尺：200微米；*表示与控制组有显着差异，p<0.05；#表示与FAB组有显着差异，p<0.05)。
图6是显示槲皮素及本发明槲皮素-咖啡因加合物的UV-VIS图谱，其中红线为槲皮素的图谱、蓝线为槲皮素-咖啡因加合物的图谱。
图7是显示芹菜素及本发明芹菜素-咖啡因加合物的UV-VIS图谱，其中红线为芹菜素的图谱、蓝线为芹菜素-咖啡因加合物的图谱。
具体实施方式
以下将描述根据本发明的部分具体实施方案；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的方案来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所具体陈述的内容或权利要求书的内容。
除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“预防”是指抑制或防止一具体病况的发作或维持敏感个体的良好健康状态或建立该个体对疾病的耐受性；所谓“治疗”，不应被解释为治疗一个体直至完全恢复，而应包括将一个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加一个体的恢复速率、改善一具体病况的严重性或提高一患者的生命品质；所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物。
本说明书中所使用的数值范围(例如5至100)应理解为也包含在该范围中的所有有理数以及在该范围中的任何有理数所组成的范围，因此，本说明书中所使用的数值范围是包含介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。
本申请发明人经研究发现，黄嘌呤及其衍生物具有携带其他成分通过血脑障壁的功能，故将黄嘌呤及其衍生物与治疗或预防失智症的潜力化合物并用，可改善该等潜力化合物的生物利用性。
因此，本发明是关于一种组合物，其是包含一第一成分与一第二成分，其中该第一成分是黄嘌呤(xanthine)及其衍生物的至少一个，该第二成分是二苯基庚烷类(diarylheptanoid)、二苯基庚烷类的衍生物、儿茶素 (catechin)、儿茶素的酯类、类黄酮(flavonoid)及异类黄酮(isoflavonoid) 的至少一个，且该第一成分视需要与该第二成分以结合成一加合物的形式存在。本发明也关于该组合物于治疗及/或预防失智症的应用，包括使用该组合物于制备一用于治疗及/或预防失智症的药剂的用途、以及使用该组合物于治疗及/或预防失智症的方法。本发明透过上述第一成分与第二成分之并用，其中的第一成分可以携带第二成分通过血脑障壁，从而达到预防及/或治疗失智症的效果。另一方面，透过一次投予多种不同化合物，可同时针对多种造成失智症的病理机制予以治疗，以提升预防及/或治疗失智症之效益。
于本发明组合物中，作为第一成分的黄嘌呤衍生物可以是甲基黄嘌呤，包含：咖啡因、胺茶碱、异丁基-1-甲基黄嘌呤、副黄嘌呤、配妥西菲林、可可碱、及茶碱。
于本发明组合物中作为第二成分的二苯基庚烷类可以是线性二苯基庚烷类或环状二苯基庚烷类，其中，该线性二苯基庚烷类的具体方案例如姜黄素，该二苯基庚烷类衍生物的具体方案例如类姜黄素、去甲氧姜黄素、去二甲氧姜黄素及其他姜黄素衍生物。
于本发明组合物中作为第二成分的儿茶素及其酯类可自植物萃取而得，举例言之，但不以此为限，可自茶(绿茶或红茶)、苹果皮、梅子、洋葱、榛子、刺槐豆等萃取而得。较佳地，该作为本发明组合物第二成分的儿茶素的酯类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
于本发明组合物中作为第二成分的类黄酮可以是植物或真菌的二级代谢物(即，生物类黄酮)，且在结构上具有二个苯环及一个杂环。举例言之，该类黄酮可以是花黄素(anthoxanthin)、黄酮醇(flavonol)、黄素酮(flavone)、黄烷酮(flavanone)、黄耆甲苷(astragaloside)第I至IV型、黄烷(flavan)、黄烷醇(flavanol)、花青素(anthocyanin)、花色素(anthocyanidin)、新黄酮类(neoflavonoid)、其衍生物、其酯类或前述的组合。于本发明的部分具体实施方案中，是以下的至少一个作为本发明组合物的第二成分中的类黄酮：芹菜素、花青素、葱醌、槲皮素及木犀草素。此外，于本发明组合物中作为第二成分的异类黄酮的具体方案可以为例如：染料木黄酮、黄豆甘原及甘胺黄酮。
于本发明一具体实施方案中，以咖啡因作为第一成分，且以EGCG、花青素及姜黄素作为第二成分。于本发明另一具体实施方案中，以咖啡因作为第一成分，且以EGCG、葱醌及姜黄素作为第二成分。
于本发明组合物中，第一成分与第二成分的含量配比并无特别限制。一般而言，以第一成分及第二成分的总重量计，第一成分占0.025至25重量百分比，较佳为0.05至10重量百分比，更佳为0.1至5重量百分比。于本发明一具体实施方案中，以第一成分及第二成分的总重量计，第一成分占0.5 重量百分比。
该根据本发明所提供的组合物，可视需要还包含一第三成分或与含该第三成分的药物或食品并用，以进一步加强该组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该第三成分对第一成分及第二成分的效益没有不利的影响即可。其中，该第三成分的例子包括，但不限于，类胡萝卜素、玉米黄素、番茄红素、胡萝卜素、藏花酸、类胡萝卜酸及ω-3脂肪酸，可自植物萃取而得，且该植物的例子包括，但不限于，番红花及其类似物(例如：藏红花)、豆类、芹菜、蓝莓、咖啡豆、黑巧克力、南瓜子、青花菜、各种坚果、柑橘及其家族。
于本发明组合物中，第一成分较佳是与第二成分结合成一加合物，以确保该第二成分可有效通过血脑障壁，完整发挥其治疗及/或预防失智症的功效。其中，第一成分与第二成分是通过氢键而结合，因此，该加合物含有第一成分与第二成分的所有原子。第一成分的例子包括黄嘌呤及其衍生物，第二成分的例子包括二苯基庚烷类、二苯基庚烷类的衍生物、儿茶素、儿茶素的酯类、类黄酮及异类黄酮，但不以此为限，只要第一成分与第二成分各别具有可形成氢键的基团(例如：OH及N)即可。
举例言之，但不以此为限，于本发明组合物中，当第一成分与第二成分以加合物的形式存在时，该第一成分可以为咖啡因，该第二成分则为迷迭香酸、山奈酚、槲皮素、氯化飞燕草素与芹菜素的至少一个。于本发明一具体实施方案中，是以咖啡因作为第一成分、且以迷迭香酸作为第二成分而结合成一加合物。于本发明另一具体实施方案中，是以咖啡因作为第一成分、且以山奈酚作为第二成分而结合成一加合物。于本发明又一具体实施方案中，是以咖啡因作为第一成分、且以槲皮素作为第二成分而结合成一加合物。于本发明再一具体实施方案中，是以咖啡因作为第一成分、且以氯化飞燕草素作为第二成分而结合成一加合物。于本发明再一具体实施方案中，是以咖啡因作为第一成分、且以芹菜素作为第二成分而结合成一加合物。
于本发明的部分具体实施方案中，可通过先将选定的第一成分与第二成分溶于溶剂中，其后再将溶剂自反应混合物中移除以提供一用于本发明组合物的加合物。其中，该溶剂的例子包括，但不限于，甲苯、二硫化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙醇及水。视需要地，可于移除混合物中的溶剂之前进行加热、回流等操作，以促进加合物的形成。
根据本发明所提供的组合物可用于治疗及/或预防失智症，包含退化性失智症、血管性失智症、混合型失智症以及可逆型失智症。其中，退化性失智症的例子包括，但不限于，阿兹海默症、帕金森氏症、额颞叶型失智症及路易氏体失智症。
根据本发明所提供的组合物可以是一医药组合物或一食品组合物。其中，该医药组合物可呈任何适宜的形式，并无特殊限制，端视所欲的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，该根据本发明所提供的组合物可呈一经口服、经直肠、经皮、经眼部、经呼吸道、经皮下、经肌肉或经静脉投药的剂型，以施用至有需要的个体。
根据本发明所提供的医药组合物可通过全身或局部投药，且可通过各种药物传递系统(drug delivery system，DDS)进行传递，包括口服药物传递系统(oral drugdelivery system)、直肠药物传递系统(rectal drug delivery system)、经皮药物传递系统(transdermal drug delivery system)、眼部药物传递系统(ophthalmic drugdelivery system)、吸入性药物传递系统(inhalation drug delivery system)等。本发明所提供的组合物也可以输注、注射、植入或手术的方式进行投药。举例言之，但不以此为限，该根据本发明所提供的医药组合物可以通过微脂体(liposome)、微胶囊(microcapsule)、奈米微粒 (nanoparticle)、微针(microneedle)等系统进行传递，以达到提高生物利用率、控制药物释放速度、针对病灶精准投药、减少药物副作用等目的。
视使用形式及用途而定，可选用适宜的载剂以提供该医药组合物，其中，该载剂的例子包括，但不限于，赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂及吸湿剂。
以适于口服的剂型为例，可于根据本发明所提供的医药组合物中含有任何不会不利影响活性成分(即，第一成分及第二成分)的所欲效益的医药上可接受载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土(sugarbentonite)、油(例如橄榄油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油)、聚乙二醇及前述的组合。可利用任何适宜的方法，将该组合物以适于口服投药的剂型提供，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。
有关经直肠投药的医药组合物，也可于其中含有任何不会不利影响活性成分(即，第一成分及第二成分)的所欲效益的医药上可接受载剂，例如：乳糖、玉米淀粉、滑石、纤维素、粉状蔗糖、硬脂酸镁、甘露糖醇、轻硅酐、碳酸镁、碳酸钙、L-半胱氨酸、淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯树胶粉末、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、支链淀粉、糊精及前述的组合。可利用任何适宜的方法，将该医药组合物以适于直肠投药的剂型提供，例如：胶囊剂、锭剂、溶液剂、栓剂等。
有关经皮投药的医药组合物，也可于其中含有任何不会不利影响活性成分(即，第一成分及第二成分)的所欲效益的医药上可接受载剂，例如：水、矿物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液体石蜡脂、去水山梨醇单硬脂酸酯及聚山梨醇酯60。可利用任何适宜的方法，将该医药组合物以适于经皮投药的剂型提供，例如乳液(例如按摩乳液)、乳霜(例如按摩霜)、油状物(例如按摩油)、凝胶(例如水凝胶)、膏状物(例如分散膏、软膏)、洗剂、喷雾剂及贴片(例如微针贴片)等形式提供，但不以此为限。
有关经眼部投药的医药组合物，也可于其中含有任何不会不利影响活性成分(即，第一成分及第二成分)的所欲效益的医药上可接受载剂，例如：界面活性剂、黏度调节剂、渗透压调节剂、缓冲剂及水。可利用任何适宜的方法，将该医药组合物以适于经眼部投药的剂型提供，例如乳剂、油剂、凝胶、软膏、溶液剂、悬浮剂等形式提供，但不以此为限。
有关经呼吸道投药的医药组合物，也可于其中含有任何不会不利影响活性成分(即，第一成分及第二成分)的所欲效益的医药上可接受载剂，例如：糖类、醇类、氨基酸类、磷脂类、界面活性物质、环糊精类、高分子物质(例如：聚乳酸甘醇酸(poly-lactide-co-glycolide，PLGA))、助流剂、抗氧化剂、柠檬酸及其盐及磷酸盐。视需要地，可使用任何适宜的方法将该医药组合物气雾化，以利该组合物进入呼吸道中。举例言之，但不以此为限，该医药组合物可通过雾化器(nebulizer)、喷雾器而施用。
至于适于皮下、肌肉、腹腔或静脉内注射的针剂或点滴剂型，则可于该医药组合物中含有一种或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液、二甲基乙酰胺(dimethyl acetamide，DMA)、聚乙二醇100(PEG100)、PEG200、PEG300、PEG400、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、苯甲醇(benzyl alcohol)、聚氧乙烯蓖麻油 (cremophor)、N-甲基吡咯烷酮(N-Methyl-2-pyrrolidone)以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组合物。或者，将该医药组合物制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型、或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，以提供所欲的注射剂。
至于适于皮下植入、或组织间植入的剂型，则可于本发明所提供的医药组合物中另外含有一种或多种例如赋形剂、安定剂、缓冲剂以及其他载剂等成分，以例如晶片(wafer)、锭剂、丸剂、胶囊等剂型提供，从而得以将该医药组合物植入一个体中。
根据本发明所提供的组合物可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同频率施用，端视投予个体的需求、年龄、体重、健康况状及施用目的而异。可以任何适宜的用量施用本发明所提供的组合物，端视投予个体的需求而异。举例言之，当以口服方式施用至一个体以治疗及/或预防失智症时，以第二成分计，为每天37.5毫克至50克，较佳为每天300毫克至50克。但是，对于失智情形较严重的患者而言，其用量可视实际需要而酌增。此外，也可视实际应用需求，调整第一成分及第二成分于该组合物中的含量。
视需要地，可于根据本发明所提供的医药组合物或食品组合物中另外含有适宜用量的添加剂，例如可提高该组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该组合物可视需要另外含一种或多种其他活性成分，以进一步加强组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分(即，第一成分及第二成分)的效益没有不利的影响即可。
根据本发明所提供的食品组合物可以是健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品或特殊营养食品，且可制成例如乳制品、肉类加工品、面包类、面食品、饼干、口含锭、胶囊、果汁类、茶类、运动饮料、营养饮料等产品，但不以此为限。
根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及特殊营养食品可以一日一次、一日多次、或多日一次等不同频率食用，端视投予个体的年龄、体重及健康状况而异。也可针对特定族群调整根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及特殊营养食品中第一组分及第二组分的含量，较佳为调整至每日应服用的量。举例言之，以第二成分的总重量计，若一个体的建议摄取量为每日总量为500毫克的第二成分，又该保健食品每份含总量为250毫克的第二成分，则该个体每日可食用两份该保健食品。
可于根据本发明所提供的健康食品、保健食品、机能性食品、营养补充食品及/或特殊营养食品的外包装标示建议使用量、特定族群(例如失智症患者、癌症患者、孕妇等)的使用标准及条件、或与其他食品或医药共同服用的建议事项，以利使用者在无医师、药师或相关执事人员指导下可在家自行服用而无安全疑虑。
如上述，本发明也提供一种治疗及/或预防失智症的方法，其包含对一有需要的个体投予一有效量的上述组合物。前述该有需要的个体是指，罹患失智症及/或有罹患失智症的高风险的个体。于前述方法中，所采用的组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。
本发明也提供一种使用上述组合物于制备一用于治疗及/或预防失智症的药剂的用途。于前述用途中，所采用的组合物的投予方案、投予途径、投予形式、施用频率以及相关应用，也如上述的说明。
实施例
[制备实施例]
A.动物模式的建立
将SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠(年龄：2-4个月；体重：300-500克) 分为五组，分别以如下条件进行处理：
(1)“控制”组(正常大鼠；即，非失智症的大鼠，共4只)：饲养于透明鼠笼(容积：43×23×20立方厘米；温度：25±1℃；昼夜时间：各12小时，分别于早上6点及晚上6点亮灯及暗灯；不限制饮水及饮食)中，历时8 周。
(2)“FAB”组(失智症模式大鼠，共7只)：(i)将大鼠麻醉后固定于立体定位仪上；(ii)将大鼠头骨上方的皮肤及肌肉剪开；(iii)以头骨十字缝作为定位点，并依据大鼠脑部定位图谱(Paxions and Watson,1988)将Brain infusion kit 2(购自Alzet)的注射针植入侧脑室(区域座标：前/后：-1毫米、侧：1毫米、深度：4.5毫米)；(iv)将填充有FAB溶液(包含：15微莫耳/升的Aβ1-42蛋白、1毫莫耳/升的硫酸亚铁(FeSO4)及12毫莫耳/升的丁硫氨酸-亚砜亚胺(buthionine sulfoximine，BSO))的Osmotic pump(购自Alzet)连接上注射针，并缝合于大鼠背部的皮下位置；(v)将大鼠饲养于透明鼠笼中，历时8周，期间持续灌流FAB溶液。
(3)“配方1”组(共3只)：比照“FAB”组的步骤进行，但于步骤(v) 的第2周开始，每天以腹腔注射的方式，对大鼠额外投予500毫克/公斤体重的配方1组合物(含有：10重量％姜黄素、10重量％EGCG、5重量％芹菜素以及75重量％N-甲基吡咯烷酮(N-Methyl-2-pyrrolidone)溶液)。
(4)“配方2”组(共5只)：比照“FAB”组的步骤进行，但于步骤(v) 的第2周开始，每天以腹腔注射的方式，对大鼠额外投予500毫克/公斤体重的配方2组合物(含有：5重量％姜黄素、10重量％EGCG、5重量％花青素、 0.1重量％咖啡因以及79.9重量％N-甲基吡咯烷酮溶液)。
(5)“配方3”组(共4只)：比照“FAB”组的步骤进行，但于步骤(v) 的第2周开始，每2天以腹腔注射的方式，对大鼠额外投予大鼠500毫克/公斤体重的配方3组合物(含有：5重量％姜黄素、10重量％EGCG、5重量％葱醌、0.1重量％咖啡因以及79.9重量％N-甲基吡咯烷酮溶液)。
B.样品采集
将[制备实施例A]所提供的各组大鼠麻醉(腹腔注射0.5毫升/100克体重的7％水合氯醛(7％chloral hydrate))后固定于木板上，并以下述步骤处理，以提供后续实验所需的样品：
(a)以心脏采血的方式抽取3-6毫升的血液；
(b)将腹腔、横膈膜及胸腔剪开，暴露出心脏后，将灌流管插入左心室并进入升主动脉、将右心耳剪开以释放血液，再以生理食盐水替换血液；
(c)以2％三氯甲醛(paraformaldehyde，溶于0.1M的磷酸盐缓冲液 (PhosphateBuffer，PB)，pH值7.3)进行灌流，以固定组织；
(d)待组织固定完成，将头骨剪开并取出大脑组织；以及
(e)将前述大脑组织放入添加有0.1M PB缓冲液的培养皿中，再以震荡切片机(vibratome，TPI，St.Louis,Missouri)以冠状切片方式取出如下组织 (1)-(4)：
组织(1)：自注射点位置起1000微米的脑组织厚切片(包含内侧中隔核 (medialseptal nucleus))；
组织(2)：自大脑海马回前端起1500微米的脑组织厚切片(包含海马回)；
组织(3)：自切下组织(2)的位置再切2片350微米的脑组织切片；以及
组织(4)：剩余组织。
[动物实验]
实施例1：本发明组合物对海马回中CA1区域的Aβ1-42蛋白沉积的影响
已知失智症患者脑中会有大量的Aβ1-42蛋白沉积，这些不正常的蛋白沉积会导致脑部神经讯息的传导被破坏，进而造成患者认知功能及记忆功能的损伤。为了解本发明组合物是否可以有效降低Aβ1-42蛋白的沉积，进行以下实验。
(1-1)切片处理
取[制备实施例B]所提供的各组大鼠的组织(2)(包括“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组)，以4％三氯甲醛 (溶于0.1M的磷酸盐缓冲液)溶液固定1天后，浸泡于30％蔗糖溶液(溶于 0.1M的磷酸盐缓冲液)中，并以冷冻切片机将其连续切片成30微米厚的切片。
(1-2)染色处理
将(1-1)所提供的切片移入含有10％NGS(normal goat serum)及0.1％ Triton的0.1M PBS中，反应1小时后，将切片移入含有兔抗-Aβ1-42抗体(rabbit anti-Aβ1-42antibody)(1：100)及1％NGS的PBS中，置于4℃下反应20小时。其后，切片以0.1M PBS清洗3次，并置入含有山羊抗-兔抗体(goat anti-rabbit antibody)(1：200)及1％NGS的PBS中，于室温下反应1小时后，再以PBS 清洗3次。
(1-3)呈色处理
将(1-2)所提供的切片移入含有0.05％DAB(3,3-diaminobenzidinetetrahydrochloride，购自Sigma,St.louis,Missouri)及0.01％H2O2的0.05M Tris 缓冲液(pH 7.4)中，置于室温下反应至DAB呈色物质出现。接着，切片以0.05M Tris缓冲液清洗1次，并以0.1M PBS清洗2次。
(1-4)封片及观察
将(1-3)所提供的切片依序贴于载玻片上，阴干后依序以85％、95％以及100％(体积/体积)酒精脱水、再以二甲苯透明化。接着，以Permount 及盖玻片进行封片。最后，以10倍目镜、40倍物镜观察，并拍摄3片随机切片的右脑。结果示于图1A至1E、并以图1F显示将图1A至图1E的结果量化后的长条图。
(1-5)结果分析
由图1A至1F可知，相较于“控制组”，“FAB”组的海马回中CA1区域的Aβ1-42蛋白沉积密度较高，显示FAB溶液会增加Aβ1-42蛋白的沉积，诱发失智症。另一方面，相较于“FAB”组，“配方1”组的海马回中CA1区域的Aβ1-42蛋白沉积密度不仅没有降低，甚至增加。然而，相较于“FAB”组，“配方 2”组及“配方3”组的海马回中CA1区域的Aβ1-42蛋白沉积密度则明显较低。
前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(例如“配方 2”及“配方3”)确实可有效降低失智症模式大鼠的Aβ1-42蛋白沉积密度，帮助恢复脑部神经讯息传导，有助于失智症患者的认知功能及记忆功能的恢复。
实施例2：本发明组合物对海马回中CA1区域的小神经胶质细胞密度的影响
已知小神经胶质细胞是巨噬细胞的一种，其负责在中枢神经系统中进行吞噬作用，清除病原体或受损的神经元。由于失智症患者的脑部有许多受损的神经元与不正常的蛋白质堆积，因此，小神经胶质细胞会持续聚集并处于活化的状态，而释放促发炎物质。然而，过量的促发炎物质也会造成神经元受损，加剧失智症的症状。为了解本发明组合物是否可以有效抑制小神经胶质细胞的聚集与活化，进行以下实验。
(2-1)切片处理
取[制备实施例B]所提供的各组大鼠的组织(2)(包括“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组)，比照(1-1)的方式进行处理。
(2-2)染色处理
将(2-1)所提供的切片移入含有10％NRS(Normal rabbit serum)及0.1％ Triton的0.1M PBS中，反应1小时后，将切片移入含有山羊抗-Ibal抗体(goat anti-Ibalantibody)(1：1000)及1％NRS的PBS中，并置于4℃下反应18小时。其后，切片以0.1M PBS清洗3次，并置入含有兔抗-山羊抗体(rabbit anti-goat antibody)(1：200)及1％NRS的PBS中，于室温下反应1小时后，再以PBS清洗3次。接着，将切片移入含有抗生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶复合物(Avidin-Biotin-HRP complex；购自：Vector,Burlingame,California)的0.1M PBS中，反应1小时。
(2-3)呈色处理
取(2-2)所提供的切片，比照(1-3)的方式进行呈色处理。
(2-4)封片及观察
将(2-3)所提供的切片依序贴于载玻片上，阴干后依序以85％、95％以及100％(体积/体积)酒精脱水、再以二甲苯透明化。接着，以Permount 及盖玻片进行封片。最后，以10倍目镜、20倍物镜观察，并拍摄3片随机切片的右脑海马回CA1颗粒层。结果示于图2A至2E、并以图2F显示将图2A至图2E的结果量化后的长条图。
(2-5)结果分析
由图2A至2F可知，相较于“控制”组，“FAB”组的海马回中CA1区域的小神经胶质细胞密度较高。另一方面，相较于“FAB”组，“配方1”组的海马回中CA1区域的小神经胶质细胞的密度不仅没有降低，甚至增加。然而，相较于“FAB”组，“配方2”组及“配方3”组的海马回中CA1区域的小神经胶质细胞密度则明显较低。
前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(例如“配方 2”及“配方3”)确实可有效抑制失智症模式大鼠的小神经胶质细胞的聚集与活化，故可防止失智症患者的神经元继续受损，减缓失智症患者的症状。
实施例3：本发明组合物对海马回中CA1区域的锥状神经细胞的存活率的影响
已知海马回与记忆的储存密切相关，海马回CA1区域的锥状神经细胞的退化或死亡，容易导致失智症的发生。一般来说，若可提升锥状神经细胞的存活率，将有助于延缓失智症的发病。为了解本发明组合物是否可以有效提升海马回CA1区域的锥状神经细胞的存活率，进行以下实验。
(3-1)切片处理
取[制备实施例B]所提供的各组大鼠的组织(4)(包括“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组)，比照(1-1)的方式进行处理。
(3-2)染色处理
委托台湾中兴大学兽医系诊断中心，对(3-1)所提供的切片进行H&E 染色处理。结果示于图3A至3E、并以图3F显示将图3A至图3E的结果量化后的长条图。
(3-3)结果分析
由图3A至3F可知，相较于“控制”组，“FAB”组的海马回中CA1区域的锥状神经细胞的存活率较低。然而，相较于“FAB”组，“配方2”组的海马回中CA1区域的锥状神经细胞的存活率明显较高，“配方1”组及“配方3”组则无明显差异。
前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(例如“配方 2”)确实可有效提升失智症模式大鼠的锥状神经细胞的存活率，有助于延缓失智症的发病。
实施例4：本发明组合物对海马回中CA1区域的锥状神经细胞的远端顶端树突的树突棘密度的影响
已知树突是神经细胞负责接收讯息的构造，树突上的树突棘密度越高，讯息的接收越顺畅。当树突棘密度降低，将导致认知功能及记忆功能下降。为了解本发明组合物是否可以有效提升树突棘的密度，进行以下实验。
(4-1)细胞内染料注射(可参见Chen等人的文献，The effect of epiduralcompression on cerebral cortex:a rat model.J Neurotrauma.2003Aug；20(8): 767-780.)
取[制备实施例B]所提供的各组大鼠的组织(3)(包括“控制”组、“FAB”组、“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组)，置于含有10-7M DAPI(4,6-diamidino-2-phenyl-indole，购自：Sigma,St.louis,Missouri)的0.1M PB缓冲液中，反应30分钟。接着，将组织置于直径2厘米的承载槽内、并以中间有方形洞的滤纸压住组织。然后，以含有DAPI的0.1M PB缓冲液浸润该组织，再将承载槽置于正立萤光显微镜(固定载物台，购自：Olympus,Tokyo, Japan)下。以20倍目镜观察切片，可观察到因DAPI染色而发出蓝色萤光的细胞核(390-420,FT425,LP450)。
以外径/内径为1.0/0.75毫米的硼硅玻璃管(购自：WPI,Florida)及玻璃电极制作器(型号：P87/PC、购自：Sutter,San Rafael,California)拉制玻璃电极。将LY染料(Lucifer yellow，购自：Sigma,St.louis,Missouri)填充入玻璃电极中，填充长度1厘米。将填有染料的电极架上水压式三轴向微距操作器(3-axial hydraulicmicromanipulator，购自：Narishige,Tokyo,Japan) 的银丝电极，再将电极连接至微量电流控制器(Axoclamp，购自：Axon,Foster city,California)。
在萤光显微镜下，将玻璃电极利用三轴向微距操作器刺入体感觉运动皮质第五层及海马回CA1锥体神经细胞的细胞体。利用微量负电流将染料注入细胞内，直至整个细胞的树突末端都充满染料为止。为避免震动，用于前述操作的整套仪器固定于防震桌上。完成染色的组织以4％三氯甲醛(溶于0.1M PB缓冲液中)溶液固定一天以上。
(4-2)切片处理
取(4-1)所提供的组织，依序以下列不同浓度的蔗糖(溶于0.1M PB缓冲液中)溶液浸泡：5％蔗糖溶液(20分钟)；20％蔗糖与10％甘油溶液(20 分钟)；20％蔗糖与10％甘油溶液(20分钟)。待组织下沉后，以冷冻切片机进一步将组织切成60微米厚的连续切片。
(4-3)染色处理
将(4-2)所提供的切片移入含有2％牛血清蛋白(Bovine serum albumin，购自：Sigma,St.louis,Missouri)的0.1M PBS中反应1小时。接着，将切片移入含有生物素化的兔抗LY(biotinylated rabbit anti-LY)抗体(1：400，购自： Molecular Probes,Eugene,Oregon)及2％牛血清蛋白的PBS中，于4℃下反应 18小时。其后，切片以0.1M PBS冲洗3次(每次10分钟)，再置入含有生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶复合物的0.1M PBS中反应1小时。然后，以 0.1M PBS冲洗切片2次(每次10分钟)、以0.05M Tris缓冲液冲洗切片1次(每次10分钟)。
(4-4)呈色处理
取(4-3)所提供的切片，比照(1-3)的方式进行呈色处理。
(4-5)封片及观察
将(4-4)所提供的切片依序贴于载玻片上，阴干后依序以85％、95％以及100％(体积/体积)酒精脱水、再以二甲苯透明化。接着，以Permount 及盖玻片进行封片。最后，以100倍的油镜观察各组切片、并随机拍摄15个树突片段，并以10微米为一单位计算海马回CA1的椎体细胞远端顶端树突的树突棘密度。结果示于图4A至4E、并以图4F显示将图4A至图4E的结果量化后的长条图。
(4-6)结果分析
由图4A至4F可知，相较于“控制”组，“FAB”组的海马回中CA1区域椎体细胞的远端顶端树突的树突棘密度较低。另一方面，“配方1”组、“配方2”组及“配方3”组的海马回中CA1区域椎体细胞的远端顶端树突的树突棘密度皆高于“FAB”组。
前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(例如“配方 2”及“配方3”)确实可有效提升失智症模式大鼠椎体细胞的远端顶端树突的树突棘密度，有助于失智症患者的认知功能及记忆功能的恢复。
实施例5：本发明组合物对于内侧中隔核中胆碱性神经元数量的影响
已知胆碱性神经元负责分泌脑中重要的神经传导物质，乙酰胆碱。当胆碱性神经元数量减少，乙酰胆碱的分泌量随的下降，造成记忆功能衰退，从而导致失智症的发生。一般来说，若可提升内侧中隔核中胆碱性神经元的数量，将有助于防止记忆功能衰退。为了解本发明组合物是否可以有效提升胆碱性神经元的数量，进行以下实验。
(5-1)切片处理
取[制备实施例B]所提供的各组大鼠的组织(1)(包括“控制”组、“FAB”组、“配方2”组及“配方3”组)，比照(1-1)的方式进行处理。
(5-2)染色处理
将(5-1)所提供切片移入含有10％NHS(Normal horse serum)及0.1％ Triton的0.1M PBS中，反应1小时后，将切片移入含有山羊抗-ChAT抗体(goat anti-ChAT antibody)(1：100)及1％NHS的PBS中，并置于4℃下反应18小时。其后，切片以0.1M PBS清洗3次，再置入含有兔抗-山羊抗体(rabbit anti-goat antibody)(1：200)及1％NHS的PBS中，于室温下反应1小时后，再以PBS清洗3次。
(5-3)呈色处理
取(5-2)所提供的切片，比照(1-3)的方式进行呈色处理。
(5-4)封片及观察
将(5-3)所提供的切片依序贴于载玻片上，阴干后依序以85％、95％、以及100％(体积/体积)酒精脱水、再以二甲苯透明化。接着，以Permount 及盖玻片进行封片。最后，以10倍目镜、10倍物镜观察，并拍摄3片随机切片的右脑。结果示于图5A至5D、并以图5E显示将图5A至图5D的结果量化后的长条图。
(5-5)结果分析
由图5A至5E可知，相较于“控制”组，“FAB”组的内侧中隔核中胆碱性神经元数量明显较低。然而，相较于“FAB”组，“配方2”组及“配方3”组的内侧中隔核中胆碱性神经元数量皆明显较高。
前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(例如“配方 2”及“配方3”)确实可有效提升失智症模式大鼠内侧中隔核中胆碱性神经元的数量，有助于防止失智症患者的记忆功能衰退。
[人体实验]
实施例6：本发明组合物对失智症患者的影响
(6-1)患者#1
表1是行为评估-神经精神量表(NPI-Q)，评估者是针对患者的行为以及精神状态进行评估(共有12个项目，且依严重性及发生频率进行评分)。评估-神经精神量表(NPI-Q)的得分可作为失智程度的分类标准，其中，得分为10分以下属于“正常”、得分为10至40属于“轻度至中度失智症”、得分为40分以上则属于“中度至重度失智症”。
使一阿兹海默症患者每天服用2颗胶囊(每颗胶囊中含有400毫克的本发明组合物，成分及比例分别为：姜黄素＝24.9重量％、EGCG＝49.7重量％、花青素＝24.9重量％、咖啡因＝0.5重量％)，持续三个月。分别于实验开始时(即，尚未服药前)、实验开始一个月(即，持续服药一个月)及实验结束时(即，持续服药三个月)纪录该患者的NPI-Q分数。结果示于下表1。
表1
由表1可知，相较于尚未服药时，服用本发明组合物一个月即可有效改善患者的行为以及精神状态。持续服用本发明组合物三个月更可将患者的 NPI-Q分数降低至低于10分(即，可视为“正常”)。前述结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物确实可有效治疗及/或预防失智症。
(6-2)患者#2
使一阿兹海默症患者每天服用2颗胶囊(每颗胶囊中含有400毫克的本发明组合物，成分及比例分别为：姜黄素＝24.9重量％、EGCG＝49.7重量％、花青素＝24.9重量％、咖啡因＝0.5重量％)，持续五个月。分别于实验开始时(即，尚未服药)及实验结束时(即，持续服药五个月)纪录该患者于以下评估的得分：认知功能评估量表(Mini-Mental StateExamination，MMSE)、简易心智状态问卷(Short Portable Mental State Questionnaire，SPMSQ)、行为功能评估量表(Behavior Test)、情绪状态评估量表(Geriatric DepressionScale， GDS)、巴氏量表(Barthel index)、工具性日常生活活动量表(InstrumentalActivities of Daily Living，IADL)。结果示于下表2。
表2
其中，SPMSQ的评估项目包含定向感、个人基本资料、远程记忆力及计算力等(总计10题；每答错一题，分数增加1分)。IADL则是用于评估较复杂、需要较高能力的生活料理事项(包括购物、洗衣、处理财务等；每项虽皆可分为3至5等级，但得分则仅以“1”或“0”计算，例如：会洗所有的个人衣物与只会洗小件衣物虽被分为不同等级，但皆视为具有洗衣能力，故得分皆为“1”)。为使最后所呈现的IADL分数能更精确反应患者的状况，以完全不具有独立生活的能力(即，每项生活料理事项皆被分为最高等级)的患者作为100％，评估受试者的IADL百分比，百分比越低表示受试者越具有独立生活的能力。
由表2可知，受试者持续服用本发明组合物五个月后，其SPMSQ分数及 IADL百分比皆明显下降。前述结果显示，患者持续服用本发明组合物五个月即可于记忆力、独立生活的能力等不同面向获得有效改善。
[加合物合成]
实施例7：第一成分与第二成分结合成一加合物
(7-1)第一成分：咖啡因/第二成分：迷迭香酸(Rosemaric acid)
于室温下，将0.1毫莫耳(milimol)的迷迭香酸(溶于甲苯中)与比其稍微多一些(较迷迭香酸多出10％(莫耳数/莫耳数))的咖啡因混合，其后将所获得的混合物置于含有2至3毫升甲苯的10毫升圆形烧瓶中，再将该烧瓶置于回流装置下，加热至60℃，反应1小时(于此期间，定时自混合物中抽取一小部分进行薄层层析法(Thin layer chromatography)检测)，以获得通过氢键结合而形成的咖啡因迷迭香酸盐(Caffeinium rosemarinate)加合物。前述加合反应的示意如下：
反应结束后，待混合物冷却至室温，将其分成两份，分别进行以下两种操作，以分离出所形成的咖啡因迷迭香酸盐加合物。其中一份以冷冻干燥法去除溶剂，接着，将所获得的固体加入石油醚(light petroleum ether)中摇晃混合，以去除过量咖啡因，最后，进行离心并于50℃下干燥至恒重。另一份以石油醚进行稀释，并取出沉淀于下方的盐类，接着，将所获得的固体加入石油醚中摇晃混合，以去除过量咖啡因，最后，进行离心并于50℃下干燥至恒重。
(7-2)第一成分：咖啡因/第二成分：山奈酚(Kaempferol)
于室温下，将0.1毫莫耳(milimol)的山奈酚(溶于甲苯中)与比其稍微多一些(较山奈酚多出10％(莫耳数/莫耳数))的咖啡因混合，其后将所获得的混合物置于含有2至3毫升甲苯的10毫升圆形烧瓶中，再将该烧瓶置于回流装置下，加热至60℃，反应1小时(于此期间，定时自混合物中抽取一小部分进行薄层层析法检测)，以获得通过氢键结合而形成的山奈酚-咖啡因加合物。前述加合反应的示意如下：
反应结束后，待混合物冷却至室温，对其进行以下操作，以分离出上述反应所形成的加合物。以冷冻干燥法去除大部分的溶剂，接着，将剩余的混合物以制备型薄层层析法进行纯化，以去除过量的咖啡因。将起始点上的层带(band)刮除，并以甲苯清洗，最后，进行过滤及离心并于50℃下干燥至恒重。
(7-3)第一成分：咖啡因/第二成分：槲皮素(Quercetin)
在氮气氛围、室温下，将槲皮素(101.46毫克，0.3毫莫耳)、咖啡因(58.23 毫克，0.3毫莫耳)与2毫升的甲醇混合搅拌，历时12小时，以获得一混合物。将固体过滤出后，置于真空且150℃的环境下干燥3小时，即可获得通过氢键结合的槲皮素-咖啡因加合物“QUECAF”(熔点：245.95℃)。前述加合反应的示意如下：
以Gold S53 UV-VIS光谱仪(spectrometer)，对槲皮素及上述槲皮素-咖啡因加合物进行测量，以获得二者的UV-VIS图谱，结果示于图6。如图6所示，相较于槲皮素(红线)，槲皮素-咖啡因加合物(蓝线)在250奈米及300 奈米波长处的吸光度皆较低。
(7-4)第一成分：咖啡因/第二成分：氯化飞燕草素(Delphinidin chloride)
在氮气氛围、室温下，将氯化飞燕草素(66.3毫克，0.1毫莫耳)、咖啡因(19.4毫克，0.1毫莫耳)与1毫升的水混合搅拌，历时16小时，以获得一混合物。以冷冻干燥法去除溶剂后，即可获得通过氢键结合的“氯化飞燕草素-咖啡因加合物(Delphinidin chloride-caffeine adduct)”(须避光储存)。
前述加合反应的示意如下：
(7-5)第一成分：咖啡因/第二成分：芹菜素(Apigenin)
在氮气氛围、室温下，将芹菜素(81.07毫克，0.3毫莫耳)、咖啡因(58.23 毫克，0.3毫莫耳)与2毫升的甲醇混合搅拌，历时12小时，以获得一混合物。将固体过滤出后，置于真空且150℃的环境下干燥3小时，即可获得通过氢键结合的芹菜素-咖啡因加合物“Apigenin-caffeine adduct”。前述加合反应的示意如下：
以Gold S53 UV-VIS光谱仪(spectrometer)，对芹菜素及上述芹菜素-咖啡因加合物进行测量，以获得两者的UV-VIS图谱，结果示于图7。如图7所示，相较于芹菜素(红线)，芹菜素-咖啡因加合物(蓝线)在250奈米及300 奈米波长处的吸光度皆较低。
于前述实施例中所提及的百分比(％)，除非特别注明，否则是表示重量/体积(w/v)百分比。举例言之，30％蔗糖溶液是指体积为100毫升的溶液(包含溶质及溶剂)中含有30克的蔗糖。
上述动物实验结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物(其中，该第一分子与第二分子视需要可以结合成一加合物)确实可有效降低 Aβ1-42蛋白沉积密度、抑制小神经胶质细胞的聚集与活化、提升锥状神经细胞的存活率、提升椎体细胞远端顶端树突的树突棘密度、提升内侧中隔核中胆碱性神经元的数量，故具有防止神经元受损、帮助恢复脑部神经讯息传导、防止失智症患者的记忆功能衰退、帮助恢复认知及记忆功能、减缓失智症患者的症状、及延缓失智症的发病的功效。此外，人体实验结果显示，本发明含有第一成分及第二成分的组合物可有效改善失智症患者的行为以及精神状态、以及改善患者的记忆力及独立生活的能力。因此，本发明组合物可用于治疗及/或预防失智症。
