一种纯种发酵半夏曲的制备方法
技术领域
本发明涉及中药炮制领域，尤其涉及一种纯种发酵半夏曲的制备方法。
背景技术
半夏曲为半夏加面粉、姜汁等制成的发酵曲剂，具有化痰止咳、健脾温胃等功能。
半夏曲的传统制备方法通常是将半夏或半夏炮制品磨成细粉，与面粉混合均匀，加入姜汁，堆置，使其自然发酵。
但是自然发酵受限于气候、操作人员等不确定因素，不利于半夏曲的产业化生产。
现代化的纯种发酵是仅使用单一菌种进行可控发酵的方法，流程可控，无需受制于气候、操作人员的因素。但纯种发酵的单一菌种与自然发酵的复杂菌群相比，其发酵效果必定有所差别，其产物的品质难以保证。而保证半夏曲品质的纯种发酵方法目前尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种纯种发酵半夏曲的制备方法。
本发明提供了一种半夏曲的制备方法，其特征在于，它是以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对灭菌后的半夏曲曲料进行发酵；
所述半夏曲曲料的配方是：
清半夏140～200份，白矾8～15份，生姜汁15～25份，面粉22～40份；
制备每1mL所述生姜汁需要用0.8～1.2g生姜；
所述发酵条件为：温度36～38℃，相对湿度70％～80％。
优选的，所述发酵条件为：温度37℃；和/或，相对湿度75％。
优选的，所述半夏曲曲料的配方是：清半夏160份，白矾10份，生姜汁20份，面粉32份。
如前述的半夏曲制备方法，每80g清半夏对应的曲料接种(1.8～3)×106个菌体。
优选的，每80g清半夏对应的曲料接种2.4×106个菌体。
如前述的半夏曲制备方法，发酵时间是3天。
如前述的半夏曲制备方法，所述发酵为有氧发酵。
本发明还提供了前述方法制备得到的半夏曲。
本发明还提供了前述半夏曲在制备助消化药中的用途。
本发明还提供了前述半夏曲在制备止咳药中的用途。
本发明还提供了前述半夏曲在制备化痰药中的用途。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用纯种发酵，得到了可以和传统发酵综合品质(气味、内在成分、刺激性、止咳、化痰、消食等指标的加权结果)相当的半夏曲。
2)本发明的半夏曲比传统发酵得到的半夏曲具有更低的刺激性和更好的化痰效果。
3)本发明相比传统发酵，由于菌种单一，其发酵品质更为可控。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：CTFJ(传统发酵)半夏曲干燥品的外观图。
图2：XJFJ(枯草芽孢杆菌发酵)半夏曲干燥品的外观图。
图3：MJFJ(黑曲霉发酵)半夏曲干燥品的外观图。
图4：JMJFJ(季也蒙蔽酵母菌发酵)半夏曲干燥品的外观图。
图5：空白组家兔眼部外观图。
图6：CTFJ(传统发酵)半夏处理组家兔眼部外观图。
图7：XJFJ(枯草芽孢杆菌发酵)半夏处理组家兔眼部外观图。
图8：MJFJ(黑曲霉发酵)半夏处理组家兔眼部外观图。
图9：JMJFJ(季也蒙蔽酵母菌发酵)半夏处理组家兔眼部外观图。
具体实施方式
实施例中，枯草芽孢杆菌的发酵温度为37℃，黑曲霉发酵温度为37℃，季也蒙蔽酵母菌发酵温度为28℃。
实施例1本发明的纯种发酵半夏曲的制备方法
1.曲料处方
清半夏160g，白矾10g，生姜汁20g，面粉32g。
所述生姜汁的制备方法是：鲜生姜切块，加适量清水榨汁，按1g生姜榨成1mL姜汁换算，制成1g/mL的姜汁。
2.发酵曲料制备
取清半夏、白矾粉碎成细粉与面粉混匀，20mL姜汁加水至30～40mL，混匀，搓成团(握之成团，触之即散)，再分装于2个250mL广口瓶中，加塞，用牛皮纸封口，置高压蒸汽灭菌锅中于121℃灭菌20min，放冷后备用。
3.培养基制备
称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 15g，琼脂15～20g，水1L，加热溶解，调pH 7.0～7.2。
充分灭菌后，无菌条件下倒入己灭菌的培养皿中，每皿约15～20mL，冷凝后即制成平板。将制好的平板放入37℃培养箱中培养24h，检查无菌落后使用。
4.微生物纯化
将枯草芽孢杆菌菌液接种到前述培养基中，长出单菌落，用显微镜涂片染色法检查是否为单一微生物，若不纯，反复稀释后接种到前述培养基，培养单菌落检查；直到获得纯培养物。纯培养物在无菌条件下用无菌水从培养基斜面冲洗下来，并稀释至2×105菌体/mL的悬浮液；可选的，悬浮液的浓度为(1.5～2.5)×105菌体/mL。
5.发酵
无菌条件下，将上述悬浮液以每瓶6mL的接种量均匀地接种到已经灭菌的曲料中，加棉塞，置恒温恒湿箱中发酵培养3d，期间相对湿度为75％。发酵结束后，将曲料取出并于冷冻干燥机中冻干，即得。
实施例2本发明的纯种发酵半夏曲的制备方法
1.曲料处方
清半夏140g，白矾8g，生姜汁15g，面粉22g。
2.发酵曲料制备
同实施例1第2节。
3.培养基制备
同实施例1第3节。
4.微生物纯化
同实施例1第4节。
5.发酵
同实施例1第5节。
实施例3本发明的纯种发酵半夏曲的制备方法
1.曲料处方
清半夏200g，白矾15g，生姜汁25g，面粉40g。
2.发酵曲料制备
同实施例1第2节。
3.培养基制备
同实施例1第3节。
4.微生物纯化
同实施例1第4节。
5.发酵
同实施例1第5节。
纯种发酵的菌种对半夏曲发酵及其重要，并非随意选取菌种即可成功得到合格的半夏曲产品。为了进一步说明菌种对半夏曲品质的影响，给出以下实验例。
实验例不同发酵方法的效果比较
(一)方法
1.纯种发酵曲料制备法
处方为清半夏160g，白矾10g，生姜汁20g，面粉32g。取清半夏、白矾粉碎成细粉；生姜榨汁加适量水，与面粉及上述细粉搅匀，，混匀，分装于500mL烧杯中，分别加姜汁和水的混合液体30mL，搓成颗粒状(握之成团，触之即散)，再分装于250mL广口瓶中，加塞，用牛皮纸封口，置高压蒸汽灭菌锅中于121℃灭菌20min，放冷后备用。
2.马铃薯培养基PDA(适合培养霉菌)
称取马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g。将马铃薯去皮，切成块煮沸0.5h，用纱布过滤，加入葡萄糖及琼脂，加热溶化后补足水至1L。
3.牛肉膏蛋白胨培养基(适合培养细菌)
称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaC 15g，琼脂15～20g，水1L，加热溶解，调PH 7.0～7.2。
4.麦芽汁琼脂培养基(适合酵母菌)
称取麦芽汁琼脂粉40g，用水1L加热溶解，pH自然。
以上培养基均经121℃灭菌25min，于无菌条件下将上述已灭菌的各培养基分倒入己灭菌的培养皿中，每皿约15～20mL，冷凝后即制成平板。将制好的平板放入37℃培养箱中培养24h，检查无菌落后使用。
5.发酵
5.1微生物纯化
用实施例1中的微生物纯化方法，对枯草芽孢杆菌、黑曲霉和季也蒙蔽酵母菌进行纯化，得到纯培养物悬液。枯草芽孢杆菌和季也蒙蔽酵母菌的悬液浓度为2×105菌体/mL；黑曲霉的悬液为孢子悬浮液，浓度为2×105孢子/mL。
5.2纯种发酵
同实施例1第5节。
5.3传统发酵
取清半夏、白矾、六神曲粉碎成细粉；20mL生姜榨汁加适量水至30～40mL，与面粉及上述细粉搅匀，制成软硬适宜的小块或颗粒，置37℃的恒温恒湿箱中发酵培养3d(RH75％)。发酵至产生“黄衣”时，取出，冷冻干燥机中冻干，即得。其处方为清半夏160g，白矾10g，六神曲5g，生姜汁20g，面粉32g。
6.评价指标
选择半夏曲饮片外观性状、气味、内在成分、毒性、刺激性和药效等几项综合加权评分作为评价指标。
6.1性状和气味
半夏曲的外观性状为：本品为淡黄色的小块或粗粉；气微，味酸涩、微辣。本品粉末黄白色至淡黄色。半夏曲发酵以遍布“黄衣”为发酵终点，发酵后有明显的香气，所以可根据发酵后样品的色泽程度和香气设计外观性状和气味的评分，性状和气味整体加权评分满分分别为5分，总分10分。
6.2内在成分
课题组前期建立的半夏曲质量标准中规定了半夏曲含量限度控制，按干燥品计算，含含总酸以琥珀酸(C4H6O4)计，不得少于0.35％。有机酸是半夏止咳化痰的主要成分，因此将内在成分的整体加权评分满分定为20分。
6.3刺激性
《中国药典》2015版生半夏【性味与归经】项下指生半夏有毒，生半夏主要有刺激性毒性，半夏曲发酵炮制的主要目的之一就是缓和生半夏的刺激性，所以将发酵后的样品缓和刺激性的程度作为评价指标，整体加权评分满分定为10分。
6.4止咳化痰和消食药效
考虑到中药发酵过程中，药物的内在成分可能存在着含量下降或转化的现象，而本品炮制的目的主要是用于止咳化痰和消食，故在整体加权评分考虑更多的是药效学指标的评价，以对小鼠氨水诱咳实验、酚红排痰实验和胃肠运动试验的保护作用为评价指标，满分分别为20分、10分和30分。
7.检测方法
7.1内在成分有机酸的含量测定
7.1.1标准液的配制
按照按照《中国药典》2015年版四部(通则8006)分别配制氢氧化钠滴定液(0.1mol·L-1)和盐酸滴定液(0.1mol·L-1)，标定后的浓度分别为氢氧化钠0.0998mol·L-1，盐酸0.1000mol·L-1。
7.1.2供试品溶液的制备
取半夏曲粉末(过四号筛)约5g，精密称定，按照《中国药典》2015年版一部清半夏的【含量测定】中样品溶液的制备方法进行制备，即得。
7.1.3测定方法
精密量取25mL供试品溶液，照电位滴定法(通则0701)，进行测定，用盐酸滴定液(0.1mol·L-1)滴定，每消耗1mLNaOH滴定液(0.1mol·L-1)相当于5.904mg的琥珀酸(C4H6O4)。
7.2家兔眼结膜刺激性实验
7.2.1药液制备
分别称取CTFJ(传统发酵)、XJFJ(枯草芽孢杆菌)、MJFJ(黑曲霉)和JMJFJ(季也蒙蔽酵母菌)孢子混悬液发酵的半夏曲粉末(200目)各1g，用生理盐水配制成质量分数20％的混悬液；取过200目筛的药用淀粉以生理盐水配置成质量分数20％的混悬液，上述各样品溶液调节PH值，使其呈中性。
7.2.2家兔眼结膜刺激性实验
随机取体重约1.5kg的家兔15只，分为5组，每组6只眼，别为空白组、CTFJ组、XJFJ组、MJFJ和JMJFJ组。
按如下方法给药：
药物组分别滴加上述样品混悬液2滴到家兔眼中，空白组滴淀粉混悬液2滴作为对照，然后用手轻轻闭合家兔上下眼睑，避免药液溢出家兔眼睛，紧接着轻轻揉家兔的眼睛，使药液与整个眼结膜充分接触，左右眼均揉3min后，立即用生理盐水冲洗家兔眼睛，直到眼中无药物残留，并且没有任何异物，随后观察1～2h内家兔眼睛的情况，每0.5h观察一次，并拍照记录家兔左右眼的刺激反应情况结果按照家兔眼结膜评分标准从血管充血情况，是否水肿和有无分泌物情况三个方面进行评分。
7.3止咳化痰和消食药效研究
7.3.1药液制备
取CTFJ组、XJFJ组、MJFJ组和JMJFJ组孢子混悬液发酵的半夏曲粉末适量，水浴回流两次，每次1h，第一次加10倍量水，药渣第二次加8倍量水，200目纱布过滤，合并两次滤液，减压(60℃)浓缩，浓缩至所需浓度。分别取氢溴酸右美沙芬及羧甲司坦适量，加适量纯水溶解至所需浓度的混悬液，4℃冷藏保存，用时加热至常温。
7.3.2对小鼠氨水诱咳的保护作用
将小鼠按体重，性别随机分为6组，每组10只。分别为空白组，XJFJ组和MJFJ、JMJFJ和氢溴酸右美沙芬组。
按如下方法给药：
动物常规饲养1～3天后，各组分别开始灌胃对应组别药液，模型组灌胃等量蒸馏水，给药剂量20mL·kg-1·d-1，连续给药7d。动物第6d开始禁食不禁水10h，末次(第7d)给药后30min，将小鼠放入500mL烧杯内，烧杯内放入重约250g的棉球，精密移取氨水200μL(浓度25％～28％)至棉球上，同时将小鼠倒扣在烧杯中，观察并记录2min内小鼠第一次咳嗽的时间，记录小鼠咳嗽(小鼠腹肌收缩，同时张大嘴，有时可听见咳嗽声)潜伏期，2min后立即取出棉球，继续观察，记录小鼠2min内咳嗽次数。
7.3.3对小鼠酚红排痰的影响
将小鼠按体重，性别随机分为6组，每组10只。分别为空白组，XJFJ组和MJFJ、JMJFJ和氯化铵组。
按如下方法给药：
动物常规饲养1～3天后，各组分别开始灌胃对应组别药液，空白组灌胃等量蒸馏水，给药剂量20mL·kg-1·d-1，连续给药7天。动物第6天开始禁食不禁水12h，末次(第7天)给药30min后，给小鼠腹腔注射0.5％酚红溶液0.5mL，注射1h后断颈处死，沿甲状软骨剪下一段气管，剪下的气管要求等长，放入离心管中，加入3mL生理盐水和1mol·L-1的氢氧化钠溶液0.2mL，离心(转速2000r·min1)5min，取上清液，于紫外可见分光光度计546nm处测量并记录吸光值，制备标准曲线后计算相应的酚红含量。
酚红标准曲线的制备：取上述配好的酚红适量加水稀释成1mL含酚红100μg，然后顺次稀释成每毫升含酚红0.1、0.3、0.7、1、3、5、10μg，用分光光度计测A值。以酚红剂量为横坐标，A值为纵坐标，各交点连成直线，根据所测出的A值，即可从标准曲线上查出各鼠酚红的排泌量。
7.3.4对小鼠胃肠运动的影响
将小鼠按体重，性别随机分为6组，每组10只。分别为空白组，XJFJ组和MJFJ、JMJFJ和氯化铵组。
按如下方法给药：
动物购回常规饲养1～3天后，各组分别开始灌胃对应组别药液，空白组灌胃等量蒸馏水，给药剂量20mL·kg-1·d-1，连续给药7天。
动物第6天开始禁食不禁水12h，末次(第7天)给药或灌以蒸馏水后1h后各组给予营养半固体糊(3.2g淀粉，3.2g葡萄糖，4g羧甲基纤维素钠，100mL蒸馏水，0.14mL纯黑墨水)0.5mL/只，灌以营养半固体糊20min后分别颈椎脱臼法处死，取贲门至直肠末端胃肠，自幽门括约肌处取胃，将其放入8mL生理盐水中切碎搅匀，室温下静置1h，加入0.5mL 33％三氯乙酸除去蛋白，1 600r/min 30min离心，取4mL的上清液，在620nm出测吸光度(A值)为胃内营养固体糊的残留量，并另外取4只小鼠给予0.5mL营养半固体糊后立即处死，取胃，测其吸光度为基准营养固体糊吸光度。胃排空率(Gastric emptying)％＝(基准吸光度一A胃内吸光度/A基准吸光度)×100％。取出小肠分离肠系膜，剪取幽门至回盲肠部的肠管，置于滤纸上，轻轻将小肠拉成直线，测量墨水前进的距离和小肠的全长(幽门至回盲肠部)的距离。小肠推进率(Intestinal transit)％＝墨水前进的距离/小肠的全长×100％。
(二)结果
1.外观性状评分
以发酵后半夏曲(干燥)的外观性状和气味评价，对不同菌株发酵和传统发酵工艺发酵后的样品进行评分，详见表1。
表1传统发酵与纯种发酵半夏曲样品性状、气味评分
注：性状以黄色最多的XJFJ样品为满分；新香为淡淡的略带霉味的香气，无刺激性，辛香是有刺激味道的味道，气味以具有酒香的XJFJ样品为满分，其余的为相对评分。
2.内在成分评分
传统发酵与不同种孢子混悬液发酵后的样品总酸含量分别全部符合课题组前期完善的半夏曲质量标准草案【含量测定】项下的要求总有机酸含量不得少于0.35％，评分结果，详见表2。
表2传统发酵与纯种发酵半夏曲样品内在成分含量评分
注：以总酸含量最高的CTFJ样品定为满分20分，其它样品为相对评分。
3.家兔眼膜刺激性实验结果评分
由表3和图5～9可知各给药组合空白组对家兔眼结膜表现均为轻度刺激，说明传统发酵和纯种发酵后的半夏曲都可以缓和半夏的刺激性毒性对家兔眼结膜刺激性作用。评分越低药物的刺激性越低，因此以得分最低的XJFJ和MJFJ样品为满分20分，其它样品为相对分值，详见表3。
表3家兔眼结膜评分结果(n＝6)
注：(1)刺激性总分0～5为无刺激；5.1～10为轻度刺激；10.1～20为中度刺激；20.1～30为严重刺激；(2)以缓和刺激性最好的XJFJ和MJFJ样品，定为满分10分，其它样品为相对分值。
4.药效实验结果评分
4.1氨水诱咳实验结果评分
由表4可知，与模型组比较，传统发酵和不同孢子菌悬液发酵后的半夏曲均能延长小鼠咳嗽的潜伏期和减少咳嗽的次数。其中传统发酵工艺发酵的半夏曲同阳性对照药氢溴酸右美沙芬一样能够明显减少小鼠的咳嗽次数(P＜0.05)和延长小鼠咳嗽的潜伏期，纯种发酵工艺发酵的半夏曲有延长小鼠咳嗽潜伏期的趋势。评分结果，详见表5-4
表4传统发酵和纯种发酵半夏曲对小鼠氨水诱咳的影响结果评分
注：(1)与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
(2)以潜伏期最长的MJFJ样品，为满分10分；2min内咳嗽次数最少的CTFJ样品，为满分10分，其它样品为相对分值。
4.2小鼠酚红排痰实验结果评分
由表5可知与空白组比较羧甲司坦组、传统发酵组和不同孢子菌悬液发酵半夏曲组均能增加小鼠排痰量但是没有明显的效果(P＞0.05)。评分结果，详见表5。
表5传统发酵和纯种发酵半夏曲对小鼠酚红排痰的影响结果评分
注：(1)与空白组比较*P＜0.05；
(2)以排痰效果最好的XJFJ样品，为满分10分，其它样品为相对分值。
4.3正常小鼠肠推进、胃排空率试验结果评分
由表6可知，与空白组比较传统发酵和不同孢子菌悬液发酵的半夏曲均能促进正常小鼠的肠推进率和胃排空率，健胃消食片组、CTFJ和XJFJ组可以明显的增加正常小鼠的肠推进率和胃排空率(P＜0.05)，MJFJ和JMJFJ有明显的增加胃排空的效果，增加肠推进率方面也有一定的趋势。
表6传统发酵和纯种发酵半夏曲对正常小鼠肠推进率、胃排空率的影响结果评分
注：(1)与空白组比较*P＜0.05，**P＜0.01；
(2)以肠推进率最大CTFJ样品，为满分15分；以胃排空率最大的JMJFJ样品，为满分15，其它样品为相对分值。
5.传统发酵与纯种发酵评价指标综合评分结果
将外观性状、内在成分含量、刺激性和药效的评分，进行综合，得到总体评分，结果表明，XJFJ样品的整体品质与CTFJ差别不大，但相比MJFJ和JMJFJ更高。结果见表7。
表7传统发酵与纯种发酵评价指标综合评分结果
可见，单独使用枯草芽孢杆菌发酵可以保证半夏曲的品质，结合纯种发酵具有稳定可控的优势，本发明在半夏曲生产应用中具有良好的前景。
