褪黑素在制备骨髓间充质干细胞动员剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及褪黑素在制备骨髓间充质干细胞动员剂中的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）是当前医药研究领域应用最为广泛的多能干细胞。因其具备良好的体外扩增能力以及强大的多向分化潜能，BMSCs已成为治疗诸多退行性疾病如骨关节炎、骨质疏松、椎间盘退行性变的关键种子细胞。
然而，在实际临床应用与转化过程中，BMSCs的提取和分离仍存在诸多的局限性。首先，BMSCs的临床应用伴随着更长的周期和更多的不确定因素，而目前常规制备方法获取的细胞产量往往过低，难以满足临床的需求。此外，常规分离获取的细胞常伴随着增殖和分化能力的下降以及细胞干性难以维持等问题，导致其在实际临床应用时难以获得满意的疗效。因此，亟需更为有效的方式在体内对细胞进行干预，增加骨髓间充质干细胞的增殖和分化能力进而为实际治疗创造条件。
细胞动员（Cell mobilization）为解决上述的难题提供了可能。动员是指通过使用特定的干细胞动员剂或动员方法促使骨髓中的BMSCs向外周血迁移，BMSCs的体内动员一方面避免了体外培养再输注治疗带来的污染风险，另一方面也能最大限度地保留干细胞的体内活性。在造血干细胞移植领域，细胞动员已经被大量研究同时在临床治疗中取得了满意的疗效。但对于BMSCs动员剂的研究结果却不尽如人意，目前报道的动员剂均难以实现对BMSCs的有效动员。因此，对BMSCs动员剂的深入探索研究具有重要意义。
发明内容
基于当前BMSCs动员剂的匮乏以及动员方式的不足，本发明的目的在于提供一种BMSCs的动员方法，并初步证实了基于褪黑素的动员方式能有效实现骨髓中BMSCs向外周血的迁移，同时动员后的BMSCs较对照组具有更强大的增殖能力和成骨分化能力，提示了褪黑素及其相关制剂可以作为一种BMSCs的有效动员剂提高细胞产量的同时保证细胞的活力，为干细胞的临床治疗提供了新的参考。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
褪黑素在制备骨髓间充质干细胞动员剂中的应用。
进一步的，所述骨髓间充质干细胞动员剂用于干细胞移植治疗。
一种骨髓间充质干细胞动员剂，包括以上所述的褪黑素。
本发明所述的骨髓间充质干细胞动员剂的剂型为注射剂。
本发明选取SD大鼠作为实验动物，分组如下：传统提取组（20只），尾静脉注射0.9%的生理盐水，频率为每日一次，干预时间为一周；褪黑素动员组（20只），尾静脉注射10mg/kg的褪黑素溶液，频率为每日一次，干预时间为一周。
获取两组大鼠的外周血细胞进行传代培养，通过对比两组BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD29、CD90的表达水平，评估褪黑素对骨髓中BMSCs向外周血动员的效果；通过对比两组BMSCs的增殖能力评估褪黑素动员组细胞的增殖能力；通过对比两组BMSCs的成骨分化能力评估褪黑素作为动员剂对BMSCs的定向分化能力。
有益效果：本发明提供了一种骨髓间充质干细胞动员剂，并通过实验结果证实了褪黑素对骨髓间充质干细胞具有良好的动员效果，在褪黑素动员组的外周血细胞中，CD29和CD90高表达而CD34和CD45低表达，这与骨髓来源的BMSCs相似，从而说明褪黑素能实现骨髓中BMSCs向外周血的有效动员；同时褪黑素动员组外周血的BMSCs具有较强的增殖能力和成骨分化水平。因此，褪黑素作为骨髓间充质干细胞动员剂能实现骨髓中BMSCs向外周血的有效动员，并且能够有效提高外周血中BMSCs的增值能力和定向分化能力，其作为BMSCs良好的动员剂有望应用于组织工程和再生医学，为今后大规模、高效率实施干细胞治疗提供新的希望。
附图说明
图1 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs表面抗原CD34的柱形图。
图2 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs表面抗原CD45的柱形图。
图3 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs表面抗原CD29的柱形图。
图4 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs表面抗原CD90的柱形图。
图5 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs增殖能力的柱形图。
图6 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs茜素红染色图。
图7 为传统提取和褪黑素动员后提取的BMSCs茜素红定量的柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
将褪黑素粉末（Sigma）使用无水乙醇配置成250mM的储存液，再加入0.9%的生理盐水稀释，保证乙醇的终浓度<10%，减少乙醇对实验结果的干扰。
实施例2
实验动物选取SD大鼠，分组如下：传统提取组（20只），尾静脉注射0.9%的生理盐水，频率为每日一次，干预时间为一周；褪黑素动员组（20只），尾静脉注射10mg/kg的褪黑素溶液，频率为每日一次，干预时间为一周。
实施例3
将分离获取的外周血细胞进行传代培养，采用流式细胞检测技术检测不同组间外周血的CD29、CD34、CD45、CD90的表达，观察褪黑素动员剂对BMSCs的动员效果。
将外周血来源的BMSCs接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、1%双抗的α-DMEM培养基培养。待扩增至P2代时，使用0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min并计数细胞量，将细胞浓度调整至5×106/mL。使用阴性对照以及不同标志物（CD29、CD34、CD45、CD90）抗体对细胞表面标志物进行检测。37℃培养箱中孵育30min，使用无菌PBS清洗3次。将细胞转移至流式检测管中并加入500μL PBS重悬，使用流式细胞仪检测并采用FLOWJO软件进行数据分析。结果显示（图1-4），相较于传统提取组，褪黑素动员组高表达CD29和CD90，而低表达CD34和CD45，提示外周血的BMSCs与骨髓来源的BMSCs相似，从而说明褪黑素能实现骨髓中BMSCs向外周血的有效动员。
实施例4
将分离获取的外周血细胞进行传代培养，采用CCK-8细胞增殖技术检测不同组间外周血的BMSCs的增殖能力，观察褪黑素动员剂对BMSCs增值能力的作用。
将外周血来源的BMSCs接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、1%双抗的α-DMEM培养基培养。待扩增至P2代时，使用0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min并计数细胞量，按1000/cm2接种于96孔板，每组6孔。采用完全培养基于37℃、5% CO2中培养1周。每3天更换一次培养基，于第1、3、5、7天分别加入含10% CCK-8试剂的无血清α-DMEM溶液，置于37℃、5% CO2培养箱中避光孵育1h。结束孵育后，使用分光光度计在450nm处检测各组的吸光度值（OD）。结果显示（图5），相较于传统提取组，褪黑素动员组细胞增殖能力显著增加，说明褪黑素作为动员剂能有效提高BMSCs的增值能力。
实施例5
将分离获取的外周血细胞进行传代培养，采用茜素红染色检测不同组间外周血的BMSCs的成骨分化能力，观察褪黑素动员剂对BMSCs多向分化能力的作用。
将外周血来源的BMSCs接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、1%双抗的α-DMEM培养基培养。待扩增至P2代时，使用0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min并计数细胞量，按3000/cm2接种于12孔板，每组3孔。采用成骨诱导培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.2 mM抗坏血酸、100 nM地塞米松、10 mM β-glycerophosphate）于37℃，5%CO2中培养3周。每3天更换一次培养基，于第21天检测钙沉积水平。在孔板中加入4%多聚甲醛固定，使用PBS清洗3次。加入预先配置的茜素红染液，室温孵育10分钟，于倒置显微镜下观察并拍照。同时加入1%的高氯酸溶解沉淀物，使用分光光度计在420nm处检测各组的吸光度值（OD）。结果显示（图6、7），相较于传统提取组，褪黑素动员组成骨分化能力显著增强，说明褪黑素作为动员剂能有效提高BMSCs的定向分化能力。
通过以上实验结果本发明得出以下结论：（1）基于褪黑素的动员方法能实现骨髓中BMSCs向外周血的有效动员；（2）基于褪黑素的动员方法能有效提高BMSCs的增值能力；（3）基于褪黑素的动员方法能有效提高BMSCs的定向分化能力。
综上所述，本发明创新性地提出了一种基于褪黑素的BMSCs的动员方法并取得了较好的效果，提示褪黑素可作为BMSCs良好的动员剂应用于组织工程和再生医学，为今后大规模、高效率实施干细胞治疗提供了新的希望。
