表皮葡萄球菌及其用途
技术领域
本发明涉及皮肤护理技术领域，具体涉及一种用于分解皮肤表层甘油三酯的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)及其用于制备护肤品或者化妆品的用途。
背景技术
皮肤覆盖于人体表面，保护着体内各种器官和组织免受外界有害因素的损伤。皮脂是皮肤重要的组成成分之一，在维护皮肤的屏障功能、防止透皮水丢失和外界环境物质的侵入方面发挥了至关重要的作用。当皮脂成分或含量发生变化时，皮肤正常的生理功能—尤其是皮肤的屏障功能会受到影响。
人体皮脂总量一般占皮肤总重量的3.5％-6.0％，但含量最低的情况可仅为0.3％，最高可达10.0％。皮脂为油状半流态混合物，含有多种脂类，主要成分为甘油三酯、脂肪酸、磷脂和酰化胆固醇等。皮脂腺是附属于皮肤的一个重要腺体，是产生皮脂的主要部位，其遍及身体以及手和脚掌中，在面部的密度可高达400-900个腺体/cm2。
临床上根据皮肤表面脂质量的多少，将人类皮肤粗略地分为：油性皮肤、组合性皮肤、干性皮肤和中性皮肤等类型。
1)油性皮肤。油性皮肤是由皮脂腺过多的功能引起的。当皮肤中存在过多的皮脂时，皮肤表现为较厚的质地、油腻和光亮的外观，以及存在扩张的孔和皮肤缺陷。
2)组合性皮肤。其特征在于同时存在干燥和油腻的区域，通常，油性区域位于前额、鼻子和下巴上(称为T区)。T区外面的部分通常是干燥区域，这归因于该区域的皮肤较薄，因此有较多的脱屑。
3)干性皮肤。皮脂缺乏意味着不能够保持足够的水合作用，这使得脆弱的皮肤具有较高的脱屑和细皱纹的倾向。由于显示出不可察觉的毛孔，所以屏障功能的能力降低意味着对有害外部因素例如UV(紫外线)、寒冷和风等的敏感性更高。
4)中性皮肤。由于适量的皮脂能够保持良好的水分平衡，所以这种皮肤呈现出良好的弹性和抗性，几乎没有可见的毛孔，但具有均匀的肤色。
用Sebumeter测量发现油性皮肤的人平均皮脂分泌率(mean of sebum excretionrate，MSER)明显高于干性皮肤的人，该差异具有统计学意义。油性皮肤的人，皮脂腺的分泌功能比较旺盛，容易出现一些相应的皮肤疾病，如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。因此，控制皮脂腺分泌、适时恰当的分解过多的油脂是使这类皮肤保持健康、美观的关键。
控制皮肤表层油脂的现有技术包括：
1.利用天然矿物粉末处理，常用的矿物粉末有：钛白粉、二氧化硅、硅藻土、高岭土、滑石粉、绿石泥、深海泥以及火山灰等。优点：颗粒的微观内部具有无数细小的空隙，附着在皮肤上后能吸收大量的油脂，有利于通透被皮脂堵塞的毛孔，使有效成分得以直接作用在皮脂腺体上。缺点：原料难采集，价格较高。
2.利用硫酸铝钾、氯化铝、硫酸铝和硫酸锌等处理。优点：收紧扩张毛孔的收敛剂类添加剂能使表皮绷紧，毛孔缩小，呈现出细腻外观。缺点：较短时间内呈现效果，使用一段时间后对皮肤有损。
3.利用植物提取物：例如绣线菊提取物来处理。优点：可抑制皮脂合成催化剂—5α-还原酶的合成，减少皮脂分泌。缺点：制作工序复杂，成本较高。
近年来，将微生物应用于面部皮肤的护理及保养已有人在研究。利普泰公司(Lipotec,S.A.U)所组织的实验表示，安替卡尔盐单细胞菌(Halomonas anticariensis)的外泌多糖具有脂解作用，可用于解除皮肤表层的脂质堆积。但具体效果还不是很清楚。
发明内容
为解决上述问题，本发明实施例提供一种表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，菌种保藏号为GDMCC No:60607。
本发明实施例还提供一种皮肤护理产品，该皮肤护理产品包括上述表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
本发明实施例提供的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)及其相关产品具有以下优点：1.原料来源广泛，生产成本低廉：表皮葡萄球菌WHG2019031201来源于健康儿童的面部皮肤表层，且采集的9名儿童均具有该菌株。该菌株以无性二分裂方式繁殖，具有较强的繁殖能力，较短时间内能产生大量菌体。2.副作用低，可长期使用：以表皮葡萄球菌WHG2019031201菌株分泌物、提取物或代谢物为主要成分的护肤品、化妆品相较以化学物质为主要成分的产品，具有较低的副作用及致敏性，可应用于敏感或非敏感性肌肤，具有较大的应用范围。3.具有较强的油脂分解能力：据相关实验结果可得出，150μL OD值为0.5的菌体对浓度为5‰的油脂降解率为49.25％，具有较强的油脂分解能力。4.产业应用前景广阔：2018年对中国女性皮肤问题的问卷调查结果显示，组合性皮肤的女性比例为40％，油性皮肤的女性比例位居其次，达到23％。随着大气污染，电波辐射的不断增强，皮肤所处的环境越来越恶劣，各种不同的肌肤问题不断出现，每年有超过90％的女性被皮肤问题所困扰。本发明所涉及的表皮葡萄球菌具有原料来源广泛、生产成本低廉、副作用低且具有较强的油脂分解能力的优点，可用于皮肤护理产品。
附图说明
图1为本发明提供的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201显微形态图；
图2为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201在血琼脂平板培养基的菌落形态图；
图3为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201基于16S rDNA序列的系统发育树；
图4为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201分解油脂使中性红指示剂变红的结果；和
图5为本发明实施例中分解油脂实验中阴性对照和阳性对照的结果。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)WHG2019031201,于2019年3月13日送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进行保藏，微生物保藏号：GDMCC No.60607。
本发明提供的菌株是从健康儿童面部皮肤表层分离筛选获得，该菌株分泌物能将皮肤表层皮脂中的甘油三酯分解为甘油和脂肪酸，由此使皮肤表层呈现弱酸性，起到保护皮肤、控制面部表层过多皮脂的作用。同时可预防某些由于面部皮脂过多而出现的皮肤疾病，如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。
本发明的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的生物学指标如下：
1.Staphylococcus epidermidis WHG2019031201细菌菌株的形态特征
表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201为革兰氏阳性球形菌，直径为1.0μm左右，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，不能运动，图1显示了本发明提供的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201显微形态。菌体在血琼脂培养基上呈灰白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐，图2显示了本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201在血琼脂平板培养基的菌落形态图。
2.Staphylococcus epidermidis WHG2019031201细菌菌株的生理生化特性
1)精氨酸双水解酶、磷酸酶、尿素酶实验呈阳性；
2)能够利用D-半乳糖、D-麦芽糖、乳糖、蔗糖发酵产酸；
3)6.5％NaCl耐受生长、O/129耐受、奥普托欣耐受。
3.细菌菌株的16S鉴定及系统发育分析
基于系统发育树分析，本发明的菌株表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201与已知的Staphylococcus epidermidis strain Fussel(NR036904.1，表面葡萄球菌)、Staphylococcus epidermidis strain NBRC 100911(NR113957.1，表面葡萄球菌)相聚在一个大的分支中，且进化距离小于1，结果证明该菌株为表面葡萄球菌。图3为本发明的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201基于16S rDNA序列的系统发育树，其中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。
4.根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株WHG2019031201的形态特征、生理生化特性以及系统发育分析，鉴定WHG2019031201为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
以下通过具体实施例对本发明进行进一步阐述。
1.表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201的分离、筛选及鉴定
分离：
(1)选择具有健康皮肤的儿童9名，取无菌植绒拭子在装有1.5ml菌群保存液的离心管内沾湿植绒拭子，在儿童额头5cm×5cm面积内采样，横竖往返均匀涂擦各20次，并随之转动植绒拭子，随后折断植绒拭子头，将植绒拭子头投入离心管内，放入4℃冰箱内保存，随后送往实验室。
(2)于实验室通风橱中点燃酒精灯，在酒精灯旁操作，防止其他细菌污染。
(3)左手打开平板皿约30°，将涂擦皮肤的拭子用无菌镊子夹起，然后分别在血琼脂平板培养基上用Z字划线法接种，放入35℃恒温培养箱培养24h，24h后观察生长情况。该步骤共分离得到细菌单株共55株。
其中血琼脂平板培养基组分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、脱纤维羊血50mL、琼脂15.0g、蒸馏水1L、1M NaOH、1M HCL。
第一次筛选：
(1)用记号笔在上述血琼脂平板底部划五部分，并标上需要接种的菌的编号。
(2)用一次性接种环取少量菌(分离得到的55株细菌单株)在平板对应菌编号位置用Z字法划线接种。
(3)将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。(阴性对照：大肠杆菌；阳性对照：金黄色葡萄球菌)
筛选结果：图4为筛选得到的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201分解油脂使中性红指示剂变红的图片；图5为上述油脂实验中阴性对照和阳性对照的结果图片，其中阴性对照钟大肠杆菌-中性红指示剂无变色；阳性对照中金黄色葡萄球菌-中性红指示剂变红。观察结果时，注意观察平板上，如菌苔出现红色斑点，即说明油脂已被水解，此为阳性，未出现红色斑点则为阴性。该步骤筛选得到具有脂解能力的菌株共38株。
油脂平板培养基(花生油)组分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、花生油10.0g、1.6％中性红水溶液1mL、琼脂15.0-20.0g、蒸馏水1000mL、PH值7.2。
花生油主要成分：油脂、不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸)、饱和脂肪酸(软脂酸、硬脂酸、花生酸)等。花生油常用于具有脂解能力细菌的筛选和测定。
第二次筛选：
(1)用记号笔在上述花生油油脂平板底部划五部分，并标上需要接种的菌的编号。
(2)用一次性接种环取少量菌(分离得到的55株细菌单株)在平板(油脂平板培养基(猪油))对应菌编号位置用Z字法划线接种；
(3)将接种完的平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。(阴性对照：大肠杆菌；阳性对照：金黄色葡萄球菌)
结果：观察结果时，注意观察平板上，如菌苔出现红色斑点，即说明油脂已被水解，此为阳性，未出现红色斑点则为阴性。该步骤筛选得到具有脂解能力的菌株共40株。
油脂平板培养基(猪油)组分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、猪油10.0g、1.6％中性红水溶液1mL、琼脂15.0-20.0g、蒸馏水1000mL、PH值7.2。
猪油主要成分：甘油三酯(与人体皮肤皮脂中的甘油三酯相近)、饱和脂肪酸(硬脂酸、软脂酸)、胆固醇等。
将第一次及第二次筛选得到的菌株进行统计，共有36株对2种油脂均具有分解能力的菌株，其中7株为具有相同分解能力且16S序列组成相近的表面葡萄球菌，编号为WHG2019031201。
菌株种属常规鉴定
参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京：科学出版社，2001:349-398)中介绍的方法对WHG2019031201菌株的形态及生理生化特性进行测定，测定结果如下：
(1)WHG2019031201菌株在血琼脂平板培养基上生长24h后，菌落呈灰白色，不透明，表面湿润光滑，边缘整齐，如图2所示。
(2)通过显微镜观察表明：WHG2019031201菌株为球状，直径为1.0μm左右，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，不能运动，革兰氏染色为阳性，如图1所示。
(3)WHG2019031201菌株的生理生化特征见表1。
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
(4)WHG2019031201菌株的16S rDNA鉴定
以菌株WHG2019031201的材料，使用Omega D3350Bacterial DNA Kit进行DNA提取，并以产物为扩增模板，采用以下引物对：
正向引物(Forward primer)27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
反向引物(Reverse primer)1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
进行PCR扩增反应，其中PCR扩增反应体系为：2×PCR Mix 25μL、正反向引物(10mM)各2.0μL、DNA模板3.0μL，去离子灭菌超纯水18.0μL，总体积为50.0μL。PCR反应条件：95℃预变性，3min；95℃变性，30s；55℃退火，30s；延伸72℃，45s；72℃总体延伸，5min(共30个循环)。
PCR扩增产物由ABI-3730xl测序仪进行测序。测得的read1、read2序列用软件ChromasPro(Version 2.1.8)编辑得到一条完整的序列。登录NCBI基因库对该序列进行同源比对，使用MEGA7.0的最大简约法(Maximum-parsimony；MP)对该序列以及具有同源性的24序列一起构建系统发育树。基于系统发育树分析，发现该菌株表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201与Staphylococcus epidermidis strainFussel(NR036904.1，表面葡萄球菌)、Staphylococcus epidermidis strain NBRC 100911(NR113957.1，表面葡萄球菌)相聚在一个大的分支中，且进化距离小于1，结果证明该菌株为表面葡萄球菌。(图3)
结合《常见细菌鉴定手册》，对照菌株WHG2019031201的形态特征及生理生化特性及系统发育分析，确认该菌株为表面葡萄球菌StaphylococcusepidermidisWHG2019031201。
本发明的表面葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201菌株已于2019年3月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏培养基为血琼脂培养基(哥伦比亚血琼脂：胰酪蛋白胨12.0g、牛肉蛋白胨15.0g、氯化钠5.0g、玉米淀粉1.0g、琼脂12.0g、粘菌素10.0mg、萘啶酸15.0mg、去离子水1L、脱纤维羊50mL、1M NaOH、1M HCL)，培养温度35℃。
2.表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201菌株的油脂降解率的测定
(1)挑取一菌环活化后的表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidisWHG2019031201菌株菌苔，接种于装有10mL NB培养基的玻璃管中，37℃培养24h，获得菌悬液。其中NB培养基成分：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，PH7.0-7.2。
(2)将150μL菌悬液转接至含有50mL不同浓度油脂培养基(液体)的离心管中，37℃，200rpm，振荡20h，进行油脂降解。不同浓度的油脂培养基分别为：5.0‰、8.0‰、10.0‰、15.0‰、20.0‰。其中该油脂培养基成分：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、辛癸酸甘油三酯(人类皮肤中甘油三酯的一种)(5.0、8.0、10.0、15.0、20.0)g、蒸馏水1000mL，PH值7.2。
(3)将振荡分解20h后的液体培养基进行高速离心处理(12000rpm，10min)，去除菌体，获得上清液。
(4)将上清液中加入15mL正己烷进行萃取，重复两次。
(5)在萃取液中加入适量无水MgSO4以充分吸收水分，再放于离心机中进行中速离心(6000rpm，5min)，吸取上清液至蒸馏瓶中。
(6)将温度计放于蒸馏瓶上方，点燃酒精灯进行加热，将正己烷(沸点：69℃)与剩余辛癸酸甘油三酯(沸点：456℃)进行分离。
(7)将分离完成的剩余液体置于60℃恒温箱中烘干，称取质量。
(8)油脂降解率的计算：降解率(％)＝(A-B)÷A×100％。式中：A为未接菌对照管的残余油质量；B为接种管的残油质量。降解率测定结果见表2，显示了表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis WHG2019031201同一浓度菌液对不同浓度油脂的降解率实验结果。
表2降解率实验结果比较
由表2的数据可以看出，油脂降解率在5‰浓度时降解率最高。
另有实验证明，上述筛选的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的分泌物能将皮肤表层皮脂中的甘油三酯分解为甘油和脂肪酸，使皮肤表层呈现弱酸性，起到保护皮肤，控制面部表层过多皮脂的作用。同时该分泌物可用于预防某些由于面部皮脂过多而出现的皮肤疾病，如寻常痤疮、脂溢性皮炎等。
因此，本发明筛选得到的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的分泌物可以用于化妆品和护肤品领域，以及用于制备由油脂分泌过多引起的皮肤病的药物，尤其是外用药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳微健康基因科技有限公司
<120> 表皮葡萄球菌及其用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
