一类异戊烯基砜酰胺类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及天然药物医药技术领域，尤其涉及一类从五叶山小橘叶中提取到的异戊烯基砜酰胺类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
五叶山小橘(Glycosmis pentaphylla)是芸香科(Rutaceae)山小桔属(Glycosmis)植物,为中国的传统傣药,具有补土健胃、强身健体、除风通血止痛等功效。在印度传统医学中，五叶山小橘可以治疗咳嗽、风湿病、贫血、关节炎、黄疽等病症。在孟加拉国的加济布尔地区，五叶山小橘被用于预防各种癌症。对五叶山小橘植物化学的研究表明，其主要的化学成分以生物碱类化合物为主，已报道的有吖啶酮、咔唑、喹诺酮、喹唑啉、呋喃-吡啶、咔唑吲哚型等结构类型；而非生物碱成分研究较少，目前报道的有黄酮、黄烷酮、酚醛苷、异黄酮苷、对苯二酚双糖苷等。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一类从五叶山小橘叶中分离纯化得到的异戊烯基砜酰胺类化合物及其制备方法和应用。
本发明提供一类异戊烯基砜酰胺类化合物，所述异戊烯基砜酰胺类化合物从五叶山小橘叶中分离纯化得到，所述异戊烯基砜酰胺类化合物的结构通式如式(Ⅰ)所示：
其中，化合物1：
化合物2：
化合物3：
化合物4：
化合物5：
本发明还提供了上述异戊烯基砜酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、称取干燥的五叶山小橘叶，粉碎，利用乙醇浸提，然后减压浓缩，得到乙醇浸膏；
S2、向乙醇浸膏中加入甲醇溶解，然后加入石油醚萃取，减压回收溶剂，得到甲醇提取物；
S3、对甲醇提取物进行聚酰胺柱层析，梯度洗脱，得到组分Fr.I、Fr.Ⅱ、Fr.Ⅲ、Fr.Ⅳ、Fr.V，对得到的组分Fr.Ⅱ进行硅胶柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到组分Fr.IIA、Fr.IIB、Fr.IIC、Fr.IID、Fr.IIE、Fr.IIF、Fr.IIG、Fr.IIH、Fr.III、Fr.IIJ、Fr.IIK、Fr.IIL、Fr.IIM；利用甲醇和水得到的组分Fr.ⅡE进行反相C18柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到组分Fr.IIE1、Fr.IIE2、Fr.IIE3、Fr.IIE4、Fr.IIE5、Fr.IIE6、Fr.IIE7；对得到的组分Fr.IIE2进行硅胶柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到组分Fr.IIE2a、Fr.IIE2b、Fr.IIE2c、Fr.IIE2d、Fr.IIE2e、Fr.IIE2f、Fr.IIE2g；
对得到的组分Fr.ⅡE2d进行高效液相色谱纯化，等度洗脱，得到化合物2；
对得到的组分Fr.ⅡE2e进行反相高效液相色谱纯化，等度洗脱，得到化合物1；
对得到的组分Fr.ⅡE3进行高效液相色谱纯化，等度洗脱，得到化合物3和化合物4；
对得到的组分Fr.ⅡE4进行硅胶柱层析，梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到组分Fr.IIE4a、Fr.IIE4b、Fr.IIE4c、Fr.IIE4d、Fr.IIE4e、Fr.IIE4f、Fr.IIE4g、Fr.IIE4h，对得到的组分Fr.ⅡE4d进行高效液相色谱纯化，等度洗脱，得到化合物5。
进一步地，步骤S3中，对甲醇提取物梯度洗脱的条件为：利用纯化水和乙醇按照两者体积比1:0、7:3、1:1、3:7、1:19进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.II梯度洗脱的条件为：利用二氯甲烷和甲醇按照两者体积比100:1、20:1、9:1、8:2、0:1进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE梯度洗脱的条件为：利用甲醇和水按照两者体积比1:0、7:3、1:1、3:7、0:1进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE2梯度洗脱的条件为：利用石油醚和乙酸乙酯按照两者体积比9:1、6:4、2:8、0:1进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE2d等度洗脱的条件为：利用乙腈和甲酸水溶液(甲酸水溶液中：甲酸的体积含量为1‰，余量为水)按照两者体积比60:40以3mL/min的流速进行等度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE2e等度洗脱的条件为：利用乙腈和水按照两者体积比45:55以3mL/min的流速进行等度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE3等度洗脱的条件为：利用乙腈和水按照两者体积比62:38以3mL/min的流速进行等度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE4梯度洗脱的条件为：利用石油醚和乙酸乙酯按照两者体积比9:1、7:3、4:6、0:1进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S3中，对组分Fr.IIE4d等度洗脱的条件为：利用乙腈和甲酸水溶液(甲酸水溶液中：甲酸的体积含量为1‰，余量为水)按照两者体积比70:30以3mL/min的流速进行等度洗脱。
上述异戊烯基砜酰胺类化合物能够应用于制备抗胃癌药物、抗肝癌药物或抗结肠癌药物。
上述异戊烯基砜酰胺类化合物能够应用于制备抗炎药物。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明通过对药用植物五叶山小橘的甲醇提取物进行分离纯化，得到5种新化合物，综合运用多种波谱分析方法，确定其为异戊烯基砜酰胺类化合物；通过对得到的化合物1-5进行抗增殖活性评价，发现化合物1-5对三种癌细胞(SGC7901、HCT-116、HepG-2)均有一定程度的抑制作用，其中化合物1、化合物4对SGC7901有显著抑制作用，优于阳性对照药顺铂；通过对化合物1-5的抗炎活性评价，发现化合物1-5对炎症因子NO的显著抑制作用均明显优于阳性对照药地塞米松；本发明为开发新的抗肿瘤药物和抗炎药物提供了备选化合物，对山小橘属植物的综合开发利用具有非常重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1制备异戊烯基砜酰胺类化合物的提取分离流程图；
图2为本发明实施例1制得的化合物1的1H-NMR(600MHz,CD3OD)谱图；
图3为本发明实施例1制得的化合物1的13C-NMR(150MHz,CD3OD)谱图；
图4为本发明实施例1制得的化合物1的DEPT(Distortionless Enhancement byPolarization Transfer，无畸变极化转移技术)(θ＝90°)谱图；
图5为本发明实施例1制得的化合物1的DEPT(θ＝135°)谱图；
图6为本发明实施例1制得的化合物1的HSQC(Heteronuclear Singular QantumCorrelation，异核单量子关系)谱图；
图7为本发明实施例1制得的化合物1的HMBC(1H detected heteronuclearmultiple bond correlation,1H的异核多碳相关谱)谱图；
图8为本发明实施例1制得的化合物1的1H-1H COSY(Correlation spectroscopy，相关谱)谱图；
图9为本发明实施例1制得的化合物1的ROESY(Rotating Frame OverhauserEffect Spectroscopy,旋转坐标系NOE谱)谱图；
图10为本发明实施例1制得的化合物1的UV谱图；
图11为本发明实施例1制得的化合物1的HR-ESI-MS(High ResolutionElectrospray Ionization Mass Spectroscopy，高分辨电喷雾电离质谱)谱图；
图12为本发明实施例1制得的化合物2的1H-NMR(600MHz,CD3OD)谱图；
图13为本发明实施例1制得的化合物2的13C-NMR(150MHz,CD3OD)谱图；
图14为本发明实施例1制得的化合物2的DEPT(θ＝90°)谱图；
图15为本发明实施例1制得的化合物2的DEPT(θ＝135°)谱图；
图16为本发明实施例1制得的化合物2的HSQC谱图；
图17为本发明实施例1制得的化合物2的HMBC谱图；
图18为本发明实施例1制得的化合物2的1H-1H COSY谱图；
图19为本发明实施例1制得的化合物2的ROESY谱图；
图20为本发明实施例1制得的化合物2的UV谱图；
图21为本发明实施例1制得的化合物2的HR-ESI-MS谱图；
图22为本发明实施例1制得的化合物3的1H-NMR(600MHz,CD3OD)谱图；
图23为本发明实施例1制得的化合物3的13C-NMR(150MHz,CD3OD)谱图；
图24为本发明实施例1制得的化合物3的DEPT(θ＝90°)谱图；
图25为本发明实施例1制得的化合物3的DEPT(θ＝135°)谱图；
图26为本发明实施例1制得的化合物3的HSQC谱图；
图27为本发明实施例1制得的化合物3的HMBC谱图；
图28为本发明实施例1制得的化合物3的1H-1H COSY谱图；
图29为本发明实施例1制得的化合物3的ROESY谱图；
图30为本发明实施例1制得的化合物3的UV谱图；
图31为本发明实施例1制得的化合物3的HR-ESI-MS谱图；
图32为本发明实施例1制得的化合物4的1H-NMR(600MHz,CD3OD)谱图；
图33为本发明实施例1制得的化合物4的13C-NMR(150MHz,CD3OD)谱图；
图34为本发明实施例1制得的化合物4的DEPT(θ＝90°)谱图；
图35为本发明实施例1制得的化合物4的DEPT(θ＝135°)谱图；
图36为本发明实施例1制得的化合物4的HSQC谱图；
图37为本发明实施例1制得的化合物4的HMBC谱图；
图38为本发明实施例1制得的化合物4的1H-1H COSY谱图；
图39为本发明实施例1制得的化合物4的ROESY谱图；
图40为本发明实施例1制得的化合物4的UV谱图；
图41为本发明实施例1制得的化合物4的HR-ESI-MS谱图；
图42为本发明实施例1制得的化合物5的1H-NMR(600MHz,CD3OD)谱图；
图43为本发明实施例1制得的化合物5的13C-NMR(150MHz,CD3OD)谱图；
图44为本发明实施例1制得的化合物5的DEPT(θ＝90°)谱图；
图45为本发明实施例1制得的化合物5的DEPT(θ＝135°)谱图；
图46为本发明实施例1制得的化合物5的HSQC谱图；
图47为本发明实施例1制得的化合物5的HMBC谱图；
图48为本发明实施例1制得的化合物5的1H-1H COSY谱图；
图49为本发明实施例1制得的化合物5的ROESY谱图；
图50为本发明实施例1制得的化合物5的UV谱图；
图51为本发明实施例1制得的化合物5的HR-ESI-MS谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
实施例1：
本实施例1提供了一类从五叶山小橘叶中提取到的异戊烯基砜酰胺类化合物的制备过程，具体步骤为：
步骤S1、称取干燥的五叶山小橘叶12kg，粉碎，放置在渗漉桶中用90％的乙醇浸提3次，每次浸提后均在室温下浸泡24小时，浸提结束后，减压浓缩，得到乙醇浸膏860g；本实施例1中使用的五叶山小橘叶采自云南西双版纳，经云南西双版纳傣族自治州民族医药研究所鉴定为芸香科山小橘属植物五叶山小橘Glycosmis pentaphylla(Retz.)Correa的叶；
步骤S2、向乙醇浸膏中加入甲醇溶解，然后利用石油醚萃取，减压回收溶剂，得到石油醚提取物100g和甲醇提取物740g；
步骤S3、对甲醇提取物进行聚酰胺柱层析，利用纯化水和乙醇按照两者体积比1:0、7:3、1:1、3:7、1:19进行梯度洗脱，顺序得到5个组分Fr.I(100.9g)、Fr.Ⅱ(89.7g)、Fr.Ⅲ(84.9g)、Fr.Ⅳ(37.6g)、Fr.V(50.0g)；对得到的组分Fr.II进行硅胶柱(200-300目)层析，利用二氯甲烷和甲醇按照两者体积比100:1、20:1、9:1、8:2、0:1进行梯度洗脱，利用TLC(thin-layerchromatography，薄层色谱法)检测合并相似组分，得到13个组分Fr.IIA、Fr.IIB、Fr.IIC、Fr.IID、Fr.IIE(9.27g)、Fr.IIF、Fr.IIG、Fr.IIH、Fr.III、Fr.IIJ、Fr.IIK、Fr.IIL、Fr.IIM；对得到的组分Fr.IIE进行反相C18硅胶柱层析，利用甲醇和水按照两者体积比1:0、7:3、1:1、3:7、0:1进行梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到7个组分Fr.IIE1、Fr.IIE2(3.34g)、Fr.IIE3(190mg)、Fr.IIE4(0.5g)、Fr.IIE5、Fr.IIE6、Fr.IIE7；对得到的组分Fr.IIE2进行硅胶柱(200-300目)层析，利用石油醚和乙酸乙酯按照两者体积比9:1、6:4、2:8、0:1进行梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到7个组分Fr.IIE2a、Fr.IIE2b、Fr.IIE2c、Fr.IIE2d(960mg)、Fr.IIE2e(109.9mg)、Fr.IIE2f、Fr.IIE2g；
对得到的组分Fr.IIE2d利用半制备柱YMC-Pack ODS-A(250×10mm,5μm)进行HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱)纯化，利用乙腈和甲酸水溶液(甲酸水溶液中：甲酸的体积含量为1‰，余量为水)按照两者体积比60:40以3mL/min的流速进行等度洗脱，取保留时间tR＝14.5min的组分，即为化合物2，其重量为65.0mg；
对得到的组分Fr.IIE2e利用半制备柱YMC-Pack ODS-A(250×10mm,5μm)进行反相HPLC纯化，利用乙腈和水按照两者体积比45:55以3mL/min的流速进行等度洗脱，取保留时间tR＝32.0min的组分，即为化合物1，其重量为15.0mg；
对得到的组分Fr.IIE3利用半制备柱YMC-Pack ODS-A(250×10mm,5μm)进行HPLC纯化，利用乙腈和水按照两者体积比62:38以3mL/min的流速进行等度洗脱，取保留时间tR＝19.4min的组分，即为化合物3，其重量为13.0mg；取保留时间tR＝21.9min的组分，即为化合物4，其重量为6.8mg；
对得到的组分Fr.IIE4进行硅胶柱(200-300目)层析，利用石油醚和乙酸乙酯按照两者体积比9:1、7:3、4:6、0:1进行梯度洗脱，利用TLC检测合并相似组分，得到8个组分Fr.IIE4a、Fr.IIE4b、Fr.IIE4c、Fr.IIE4d(40mg)、Fr.IIE4e、Fr.IIE4f、Fr.IIE4g、Fr.IIE4h；对得到的组分Fr.IIE4d利用半制备柱YMC-Pack ODS-A(250×10mm,5μm)进行HPLC纯化，利用乙腈和甲酸水溶液(甲酸水溶液中：甲酸的体积含量为1‰，余量为水)按照两者体积比70:30以3mL/min的流速进行等度洗脱，取保留时间tR＝14.5min的组分，即为化合物5，其重量为2.0mg。
上述步骤的流程图见图1。
对上述制得的化合物1-化合物5的结构鉴定、活性实验过程如下：
一、结构鉴定：
对得到的化合物1-化合物5进行高分辨质谱、紫外光谱、旋光、核磁共振分析，从而确定化合物1-化合物5的结构。
化合物1-化合物5的理化数据及波谱数据如下：
化合物1：无色油状；HRESIMS m/z 456.18130[M+Na]+(calculated forC23H31NO5SNa:456.18151)；UV(MeOH)λmax nm(logε):235(3.65),260(3.63)；结构式为
化合物2：无色油状；HRESIMS m/z 456.18137[M+Na]+(calculated forC23H31NO5SNa:456.18151)；UV(MeOH)λmax nm(logε):235(3.74),260(3.71)；结构式为
化合物3：无色油状；HRESIMS m/z 486.22864[M+Na]+(calculated forC25H37NO5SNa486.22847)；UV(MeOH)λmax nm(logε):235(3.64),260(3.60)；结构式为
化合物4：无色油状；HRESIMS m/z 486.22849[M+Na]+(calculated forC25H37NO5SNa486.22847)；UV(MeOH)λmax nm(logε):230(3.77),270(3.70)；
化合物5：无色油状；HRESIMS m/z 450.23120[M+H]+(calculated forC24H36NO5S450.23087)；UV(MeOH)λmax nm(logε):235(3.91),275(3.39)；结构式为
表1：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的中英文命名
表2：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5的13C(150MHz)NMR数据(Record in CD3OD)
a:s-cis-conformer(74％),b:s-trans-conformer(26％)。
表3：化合物1、化合物2和化合物3的1H(600MHz)NMR数据(Record in CD3OD)
a:s-cis-conformer(74％),b:s-trans-conformer(26％)。
表4：化合物4和化合物5的1H(600MHz)NMR数据(Record in CD3OD)
a:s-cis-conformer(74％),b:s-trans-conformer(26％)。
二、抗增殖活性实验：
对实施例1制得的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5进行抗增殖活性实验：
材料与试剂：二甲亚砜和顺铂购自美国Sigma公司；高糖DMEM培养基和青霉素-链霉素溶液购自美国GE公司；0.25％胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
供试肿瘤细胞株：人胃癌细胞SGC7901、人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HCT-116，三种肿瘤细胞株均购自中国科学院(上海)细胞库。
实验方法：CCK-8法。CCK-8属于MTT的升级产品，在电子耦合试剂作用下，可以被活细胞线粒体内脱氢酶还原成橙黄色的甲臜产物，该产物水溶性高，且颜色的深浅与细胞毒性成反比，与细胞增殖成正比。通过检测450nm处的吸光度强弱，就可以知道细胞死亡或存活情况。
本实验通过CCK-8法测试化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5对三种肿瘤细胞(SGC7901、HCT-116、HepG2)的抗增殖活性，具体操作为：首先使用浓度为20μM的化合物1-5样品与肿瘤细胞作用，CCK-8孵育后通过检测450nm处的吸光度计算化合物1-5样品对肿瘤细胞生长的抑制率，抑制率>50％的样品表明化合物样品对肿瘤细胞的抗增殖作用较为明显。再使用不同浓度的化合物1-5样品与肿瘤细胞作用，求得其IC50值，与阳性药比较，判断其抗增殖活性强弱。
取培养至对数生长期的肿瘤细胞，调整肿瘤细胞浓度至5×103个mL-1，按每孔100mL接种于96孔板。在37℃、5％CO2的培养条件下培养12h。细胞贴壁后，吸出96孔板中的培养液，将待测化合物1-5样品溶液按20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM的浓度梯度加入200mL，另设一组阳性对照药和一组DMEM培养基空白对照组，置于37℃、5％CO2的培养箱内培养24h。然后取出96孔板，吸出培养液，将含10％CCK-8溶液的培养液按每孔100μL加入96孔板中，在37℃、5％CO2的培养箱内孵育1h。最后取出96孔板置于全波长酶标仪中检测450nm波长下的吸光度。
抗增殖活性实验结果见表5。
表5：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5对三种肿瘤细胞抗增殖活性的IC50值/μM(
从表5可知，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5对三种肿瘤细胞均有抑制作用。其中化合物1和化合物4对SGC7901有显著的抗增殖作用，优于阳性对照药顺铂；化合物5对SGC7901的抗增殖作用与顺铂相当；化合物3对HCT-116的抗增殖作用与顺铂相当。
三、抗炎活性实验：
对实施例1制得的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5进行抗炎活性实验：
材料与试剂：LPS、二甲亚砜和地塞米松购自美国Sigma公司；高糖DMEM培养基和青霉素-链霉素溶液购自美国GE公司；0.25％胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒和一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
供试肿瘤细胞株：巨噬细胞RAW 264.7。
实验方法：经LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞会释放一定的炎症因子-NO，炎症因子NO在体内和水溶液中极易被氧化，在镉的作用下最终都以NO22-的形式存在。NO22-可与Griess试剂发生重氮反应，生成有色化合物，且NO22-浓度与呈色反应强度成正比，通过检测540nm处的吸光度，并制作标准曲线，通过曲线可求得样品中的NO含量。
本实验通过CCK-8法测试浓度为20μM时化合物1-5对巨噬细胞的毒性实验，对于浓度为20μM时对RAW264.7有明显的毒性(细胞存活率<80％)的化合物调整至适当的浓度，使其细胞存活率>80％。再将化合物1-5按不同浓度作用于LPS诱导的巨噬细胞，用Griess法测定NO浓度得到NO抑制率，并求得其IC50值。
将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞调整密度至5×103个/mL，每孔100μL接种于96孔板。在37℃、5％CO2的培养条件下培养过夜后，吸出96孔中的培养液，然后每孔加入200μL含有不同浓度梯度化合物1-5(20μM,10μM,5μM,2.5μM,1.25μM)的培养液，设置空白孔和对照孔。24h后，吸出培养液，加入含10％CCK-8溶液的培养液100μL。37度孵育1h，在450nm波长下检测吸光度，计算细胞存活率。在保证RAW264.7细胞存活率不受单体化合物影响的条件下，即细胞存活率大于80％才能展开抗炎活性研究。将RAW264.7细胞按照上述实验的条件接种于96孔板中。12h后，吸出培养液，加入1μg·mL-1LPS以及不同浓度的单体化合物共同作用，单独加入LPS的为模型组。37℃、5％CO2孵育24h。采用Griess法检测细胞培养上清中NO的含量，吸取50μL的细胞培养上清，与反应试剂混合，用酶标仪检测540nm处的OD值，空白对照组为等量DMEM培养液。通过标准曲线将吸光度换算成浓度计算NO抑制率。用graphpad prism5.0计算IC50。
抗炎活性实验结果见表6。
表6：化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎活性的IC50值/μM(
从表6可知，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5对LPS诱导的RAW264.7细胞产生的NO均有显著的抑制作用，其中化合物4的抑制作用最大，约为阳性对照药地塞米松的60倍。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
