茶纳米簇的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及新型功能纳米材料技术领域，具体涉及一种以红茶为原料提取制备茶纳米簇的方法以及茶纳米簇在制备增敏抗生素药物中的应用。
背景技术
在医疗机构和社区中，金黄色葡萄球菌是引起传染病的最常见病原体之一。感染可能很严重，并引起脓肿，肺炎，中毒性休克综合征，脑膜炎和败血症，这已成为对公众健康的主要威胁。但是，特别是肺炎，全世界每年有超过一百万的儿童死于肺炎，这远远超过了疟疾，麻疹和艾滋病造成的死亡人数总数。尽管肺炎影响全世界儿童的健康，但问题主要集中在非洲，亚洲和南美等发展中国家。常规抗生素抑制这种现象显示出巨大的潜力。然而，近年来，随着对具有所有已知的β-内酰胺类抗生素耐药性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现和迅速普及，常规抗生素已逐渐失效并面临着淘汰的问题，导致使肺炎的治疗更加困难。
一种方法是寻找新的抗菌药物，但是临床上要使用一种新药物需要30年或更长时间，在此期间，将消耗大量的人力，物力和财力。但是，细菌对新药产生耐药性不会超过两周。为了解决治疗肺炎的紧急需求，我们仍然依靠传统抗生素，如阿莫西林，青霉素和头孢西丁。另一种方法是使用万古霉素治疗严重感染或增加传统抗生素的浓度，这将引起严重的不良反应，并可能引起比细菌感染本身更严重损害。因此，我们迫切的需要开发更好的治疗方法，并且必须找到一种使MRSA对常规抗生素重新敏感而无副作用的方法。
为了解决这个问题，已经研究了各种策略，包括使用抗菌助剂。这些小分子可以抑制细菌对常规抗生素的耐药机制，并有效提高细菌对药物的敏感性，恢复其临床实用性。在世界卫生组织(WHO)建议的基本购物清单中，β-内酰胺类抗生素是最常用的抗生素之一。MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药的最重要机制是β-内酰胺酶的大量表达，它可以水解β-内酰胺类抗生素。由于合成抗菌佐剂的毒性和药代动力学差异，因此限制了这些佐剂的应用。天然产物已成为抗菌药物敏化剂的重要来源。现有研究曾报道，茶叶中的表儿茶素没食子酸酯(ECG)可以抑制β-内酰胺酶活性，但是抑制酶活性的效率相对较低。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种茶纳米簇(TNCs)，TNCs在抑制β-内酰胺酶活性方面的表现比ECG更强，且具有良好的生物相容性，无毒副作用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种从红茶中提取茶纳米簇的方法，具体包括以下步骤：
S1、将茶叶浸没到去离子水中，置于反应釜内，在70-85℃中反应5.5-7.5小时，冷却后离心，过滤上清液；
S2、将过滤后的溶液倒入透析袋中，去离子水作为透析液，在持续搅拌下透析3-5天；离心收集上清液；
S3、步骤S2的上清液放入容器中，蒸发浓缩，再真空干燥，即得茶纳米簇。
在上述技术方案中，步骤S1所述离心参数为：13000-15000转/分钟和30-40分钟；所述过滤过程中所用过滤网的大小为100-220nm。
在上述技术方案中，步骤S2所述离心参数为：13000-15000转/分钟和30-40分钟。
在上述技术方案中，所述透析袋的相对分子质量为1000-2000。
在上述技术方案中，所述蒸发浓缩的温度为75-85℃，真空干燥的温度为55-65℃。
本发明第二方面提供了上述茶纳米簇在制备增敏抗生素药剂中的应用；进一步地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；更进一步地，所述应用具体为：在β-内酰胺类抗生素治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染过程中，所述茶纳米簇可用于制备增敏β-内酰胺类抗生素的佐剂。
本发明的有益效果为：本发明从红茶中提取制备茶纳米簇的方法简单，原料便宜，非常适用于大规模生产和商用，而且该工艺中不会产生环境污染，制备的茶纳米簇的尺寸均匀，约3nm左右，故具有良好的穿透细菌细胞膜的能力；经实验验证，茶纳米簇具有良好的增敏抗生素性能并且能协同β-内酰胺类抗生素高效快速的治疗耐药细菌感染。茶纳米簇具有良好的生物相容性和生物降解性，在协同β-内酰胺类抗生素治疗细菌感染后，没有任何的副作用。
附图说明
图1为茶纳米簇的HR-TEM图；
图2为TNCs组成成份分类和比例关系图；
图3为与茶纳米簇或/和抗生素混合培养的细菌的增长曲线图；
图4为较高浓度抗生素混合培养的细菌的生长曲线图；
图5与茶纳米簇或/和抗生素混合培养后的细菌的TEM图；
图6为茶纳米簇和抗生素的A549毒性的LDH检测结果图；
图7为不同浓度茶纳米簇的A549毒性的LDH检测结果图；
图8为TNCs和抗生素混合后的溶血实验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1茶纳米簇的提取
用天平称取5g的红茶加入到在60mL的去离子水中，搅拌直至红茶浸没在去离子水之中。将溶液放入100mL的反应釜中，将反应釜放在80摄氏度的马弗炉中，反应6小时。待马弗炉冷却后，将溶液吸入到100mL的烧杯中，溶液进行离心(15000转/分钟、30分钟)收集沉淀。然后取上清液用220nm的过滤头过滤，去除溶液中的大颗粒。
将溶液倒入到1000分子量的透析袋里面，然后将透析袋放入2L的烧杯里，将去离子水到入到烧杯里面。将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌，每12小时更换一次去离子水，一共透析3天。透析完后，溶液进行离心(15000转/分钟、30分钟)收集上层清液。
将上层清液倒入烧杯，将烧杯放置在80摄氏度恒温的水浴锅里面，蒸发浓缩到接近10mL后，分装在若干个10mL离心管(先称重)。将装有溶液的离心管放入65摄氏度的烘箱中真空干燥，干燥后取出离心管称量，储存在氩气环境的手套箱。
采用HR-TEM对干燥后得到的茶纳米簇进行检测，结果如图1所示：图a)具体为通过超声使茶纳米簇分散在水中所拍的图；图b)为通过对HR-TEM图片进行分析统计得出的粒径分布图，从图中可知茶纳米簇的粒径为3.06nm左右。
采用HPLC-MS分析茶纳米簇，可知其组成包括：儿茶素(CA)，没食子儿茶素(GC)，没食子儿茶素(CG)，没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)，表儿茶素(EC)，表没食子儿茶素(EGC)，表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，各组分的比例具体参见图2。
实施例2茶纳米簇的增敏试验
β-内酰胺抗生素(Amo)的种类有很多，本实施例中选择了最常用的β-内酰胺抗生素之一，即阿莫西林钠。
将实施例1制备的茶纳米簇溶解在去离子水中，配成1mg/mL的溶液，将溶液简单分散后，放入细胞粉碎机里超声分散(100W，20分钟)。
将阿莫西林钠溶解在去离子水，配成1mg/mL的溶液，然后以一定的比例混合成茶纳米簇为64μg/mL和阿莫西林钠为16μg/mL混合液。
将茶纳米簇(64μg/mL)、阿莫西林钠(16μg/mL)单独或混合使用，分别与MRSA共同培养24h，并检测细菌量，结果如图3所示，我们可以观察到Amo(1×MIC，即16μg/mL的阿莫西林钠)与对照之间没有明显差异，这表明该浓度下的Amo对MRSA无效。Amo稍微抑制了细菌的生长。然而，将TNCs与Amo组合使用后，细菌的生长曲线变得明显慢于其他组，并且与Amo(1×MIC)组相比，24h时的CFU mL-1降低了约三个数量级；这表明在TNCs的帮助下，无效的Amo重新激活了其抗MRSA的活力。其原因为：TNCs与β-内酰胺酶结合，使得β-内酰胺酶不能与β-内酰胺抗生素结合；故β-内酰胺类抗生素不会被水解，β-内酰胺类抗生素可以成功地达到青霉素结合蛋(PBP)并抑制细菌细胞壁的合成，最终杀死细菌。
将茶纳米簇(64μg/mL)、阿莫西林钠(32μg/mL)单独或混合使用，分别与MRSA共同培养24h，并检测细菌量，结果如图4所示。与对照相比，Amo和TNCs-Amo(2×MIC)的细菌生长曲线显着下降，混合组的CFU/mL在24h时比抗生素减少了三个数量级。重要的是，TNCs-Amo(2×MIC)组几乎在24小时内杀死了所有细菌。
采用TEM检测与不同溶液混合共培养的MRSA，结果如图5所示。Amo组和混合组之间存在很大差异，混合组内细菌内部几乎所有结构均被破坏，这显示出混合组细菌已经死亡，而其他组细菌内结构完整。
采用A549细胞检测不同溶液的毒性，结果见图6，在1、3、7天内，所有的溶液都没有任何的毒性，显示出了TNCs和抗生素混合后有非常好的生物相容性。
采用A549细胞检测不同浓度的茶纳米簇的毒性，结果见图7，当TNCs的浓度高达2048μg/mL时，A549细胞的活性仍然可以达到95％以上，显示出TNCs有非常好的生物安全性，对细胞没有任何的副作用。
用新西兰大白兔的血验证茶纳米簇与阿莫西林钠的混合液对血细胞的毒性和溶液情况，实验中以PBS组为阴性对照，而1％Triton-100为阳性对照，结果如图8所示：TNCs、Amo和TNCs-Amo，这3组的溶血率均小于10％，相比于阳性对照来说，这3组对血细胞几乎没有什么毒性。这表现出了TNCs和抗生素混合能进行静脉注射来治疗耐药细菌感染。
实施例3
使用TNCs(64μg/mL)和Amo(16μg/mL)混合溶液为药剂，治疗感染MRSA肺炎的小鼠，采用局部雾化方式。局部雾化可以有效避免副作用以及在身体其他部位的药物利用率低。小鼠恢复健康后，小鼠体内未出现任何副作用。即使在大型动物实验中(如仔猪)，TNCs仍未显示任何副作用。说明了TNCs是治疗MRSA感染的肺炎，并且能成为协同β-内酰胺类抗生素的有希望的候选者。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
