一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽及制备方法和应用
技术领域
本项发明具体涉及一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽及制备方法和应用。
背景技术
抗生素的滥用及过度使用已经对人类的健康造成了极大的威胁，产生了越来越严重的耐药性问题。因此，开发其他抗菌物质迫在眉睫。抗菌肽由于其对细胞膜的非特异性靶向性而显示出广谱的抗菌活性成为很有前途的候选药物。然而，抗菌肽的广泛应用和临床医用仍受到一些限制，包括对宿主细胞的严重毒性，抗菌活性弱，细胞选择性较差等问题。
近年来，新型自组装抗菌肽成为各界研究的热点，多肽通过超分子自组装形成纳米纤维、纳米管、囊泡及胶束等纳米聚集体，具有易自组装且结构稳定、生物相容性良好、细胞毒性小、可生物降解且降解产物易被吸收代谢等优点，被广泛应用于纳米药物、药物传递、3D细胞培养、组织工程等。研究表明，抗菌肽的抗菌活性往往与其自组装能力密切相关，自组装能提高局部抗菌肽浓度，且自组装抗菌肽主要作用于细菌的细胞膜，通过物理破膜作用而导致细胞破裂和死亡，不易产生耐药性。但现阶段，人们对自组装抗菌肽结构与活性的关系认识还不够深入，全新设计肽分子开发出具有高效治疗选择能力的抗菌药物是一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽F2I-LL及制备方法和应用，该抗菌肽具有自组装能力，高抗菌活性以及低细胞毒性；解决了天然抗菌肽强毒性细胞选择性差的问题。
本发明的目的通过如下技术实现：一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽F2I-LL，含有发卡结构的DPG转角单元，其序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、如上所述的一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽FI-LL的制备方法如下：将FF与Ile结合，引入发卡结构的DPG转角单元，稳定内部疏水结构，使FFDPGII成为疏水组装基序，促进分子组装及与细胞膜的疏水作用，并结合抗菌肽设计所需要的氨基酸组成，选取正电荷氨基酸精氨酸，疏水性氨基酸亮氨酸作为重复二元序列单元分布于两侧，保证其发挥抗菌功能所需要的疏水性和正电荷数，获得低毒有组装潜力并有高抗菌活性的抗菌肽F2I-LL其序列如SEQ ID No.1所示；
2、如上所述的一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽F2I-LL在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。
本发明将二苯基丙氨酸二肽FF与Ile结合，引入发卡结构的DPG转角单元，稳定内部疏水结构，使其成为疏水组装基序，结合抗菌肽设计所需要的氨基酸组成，选取正电荷氨基酸精氨酸，疏水性氨基酸亮氨酸作为重复二元序列单元分布于两侧，保证其发挥抗菌功能所需要的疏水性和正电荷数，最大化利用了发卡抗菌肽细胞选择性高的特点，该抗菌肽被pH＝0.7、离子强度为10mM的缓冲液PBS稀释，水浴加热，具备组装能力。本发明抗菌肽F2I-LL根据抑菌和溶血活性计算治疗指数发现，其治疗指数高达98.84，具有较高的细胞选择性。抗菌肽F2I-LL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌等8种菌种都具有强抑菌活性，对血细胞产生很低溶血作用。综上所述，抗菌肽F2I-LL是一种具有较高应用价值且具有组装潜力的抗菌肽，与天然抗菌肽相比，大大降低了细胞毒性，提高细胞选择性。
附图说明
图1为抗菌肽F2I-LL的质谱图；
图2为抗菌肽F2I-LL的1,8-ANS荧光图谱；
具体实施方式
实施例1抗菌肽的设计及制备合成
将二苯基丙氨酸二肽FF与Ile结合，引入发卡结构的DPG转角单元，稳定内部疏水结构，使其成为疏水组装基序，结合抗菌肽设计所需要的氨基酸组成，选取正电荷氨基酸精氨酸，疏水性氨基酸亮氨酸作为重复二元序列单元分布于两侧，保证其发挥抗菌功能所需要的疏水性和正电荷数，全新设计获得抗菌肽F2I-LL，其氨基酸序列如表1所。
表1抗菌肽FI-LL的氨基酸序列
F2I-LL的电荷数为+5，疏水值为0.716，疏水力矩为0.198。通过在抗菌肽的C端酰胺化增加一个正电荷，N端乙酰化增加稳定性。采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到该条多肽；经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备。
实施例2
1抗菌肽的抑菌活性
将肽配置成为2.56mM/L储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2、表3所示。
表2F2I-LL对革兰氏阴性菌的抑菌活性
表3F2I-LL对革兰氏阳性菌的抑菌活性
2、组装性质表征
1,8-ANS作为荧光探针，用来检测多肽的自组装能力。将多肽储备液(2.56mM)用10mM PBS缓冲液(PH＝7.0)稀释成测试所需浓度，90度水浴加热2h。以DMF为溶剂配制1,8-ANS溶液，浓度为20μM现配现用，1mL多肽溶液加1μL 1,8-ANS溶液，共孵育10-15min后，转移到样品池中。实验中以1mL H2O加1μL 1,8-ANS溶液为对照组，用荧光分光光度计测各浓度1,8-ANS的荧光光谱图。设定测试参数，激发波长为369nm，发射波长为440-550nm。整个操作过程注意避光，防止荧光猝灭。
结果如图2所示，抗菌肽浓度在2-4μM时，荧光强度没有明显变化，16μM时开始明显增强，说明F2I-LL有一定的组装潜力。
3、溶血活性测定和治疗指数
采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到3mL PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS溶液洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μl红细胞悬液与用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h后取出，4℃，1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值，每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照，50μl红细胞加50μl PBS作为阴性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。
抗菌肽对不同细胞的选择性作用通过治疗指数来评价。抗菌肽的治疗指数为抗菌肽最小溶血浓度与最小抑菌浓度几何平均数的比值。如抗菌肽在最高测定浓度128μM仍未表现出抑菌活性，则256μM将用于计算抗菌肽最小抑菌浓度的几何平均数。同样，如抗菌肽在最高测定浓度128μM仍未表现出溶血活性，则256μM将作为最小溶血浓度用于计算治疗指数。治疗指数越大，表明该抗菌肽对细菌具有更高的抑菌活性，同时又保持较低的细胞毒性，说明抗菌肽具有更高的细胞选择性。溶血活性和治疗指数结果见表4。
表4FI-LL的溶血活性和治疗指数
F2I-LL在最大测定浓度128μM未表现出溶血活性，计算治疗指数为98.84，具有较高的细胞选择性。以上结果表明将所设计的抗菌肽F2I-LL具有较高的替代抗生素发展的潜力。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种有自组装潜力的生物相容性抗菌肽及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Arg Leu Arg Phe Phe Pro Gly Ile Ile Arg Leu Arg Leu
1 5 10
