趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其是涉及一种趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobactor pylori，H.pylori)是一种定植于胃粘膜的螺旋状革兰阴性杆菌，可以引起从胃炎、胃溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)甚至胃癌等一系列的疾病。世界卫生组织在1994年已将幽门螺杆菌确定为胃癌的I类致癌因子。流行病调查显示幽门螺杆菌感染了世界一半以上的人口，在发展中国家尤为严重。
铋剂与抗生素结合的三联疗法是目前治疗幽门螺杆菌感染的主要方法，但这种治疗方法存在容易引起抗生素耐受、病人依从性差、容易复发等缺点。面对病原微生物感染，疫苗可能是最有效的免疫学防治手段。目前，全球已广泛开展幽门螺杆菌疫苗研究，从全菌形式的传统疫苗到亚单位蛋白或DNA形式的新型疫苗，类型多样，均存在较好的动物保护效果，但大多数仍处于临床前研究阶段。
CD4 T淋巴细胞在抗幽门螺杆菌感染中发挥着重要作用。但幽门螺杆菌激发的保护性CD4 T细胞需要募集到胃粘膜局部才能有效发挥抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用。而在自然感染状态下，幽门螺杆菌激发的免疫应答并不足以有效清除其在胃粘膜的定植，从而使许多幽门螺杆菌感染者几十年或终生都处于带菌状态。
现有幽门螺杆菌疫苗的保护率有待进一步提高。如由第三军医大学研制的口服重组幽门螺杆菌疫苗已完成所有人体临床试验研究并获得国家1.1类新药证书，成为全球首个获批的幽门螺杆菌疫苗，大大推动了此类疫苗发展。该疫苗的Ⅲ期临床试验结果表明：第一年的保护率为71.8％(95％CI 48.2–85.6)，但第二年却锐减到55.0％(95％CI 0.9–81.0)。因此，幽门螺杆菌疫苗的有效性和持久性仍有待于进一步提高。现今的幽门螺杆菌疫苗也普遍存在着其激发的有效应答向胃粘膜局部募集不足的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用，将趋化因子CX3CL1应用于制备疫苗，有助于提高疫苗的持久性和有效性。
本发明的第二目的在于提供一种幽门螺旋杆菌疫苗，缓解了目前幽门螺旋杆菌疫苗有效性和持久性较差，以及激发的有效应答向胃粘膜局部募集不足的问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用。
优选地，所述疫苗包括幽门螺旋杆菌疫苗。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种幽门螺旋杆菌疫苗，该幽门螺旋杆菌疫苗包含幽门螺旋杆菌抗原和趋化因子CX3CL1。
优选地，所述幽门螺旋杆菌抗原包括天然蛋白、重组蛋白、多肽和核酸中的一种或多种。
优选地，所述幽门螺旋杆菌抗原包括5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位中的一种或多种。
优选地，所述5-磷酸腺苷脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
和/或，所述II型柠檬酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
和/或，所述尿素酶B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述趋化因子CX3CL1包括abcam重组趋化因子CX3CL1 ab240868。
优选地，所述幽门螺旋杆菌疫苗包括如下(a)～(g)中的任意一种组合：
(a)5-磷酸腺苷脱氢酶和趋化因子CX3CL1；
(b)II型柠檬酸合酶和趋化因子CX3CL1；
(c)尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(d)5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和趋化因子CX3CL1；
(e)5-磷酸腺苷脱氢酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(f)II型柠檬酸合酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(g)5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1。
优选地，所述疫苗还包括疫苗佐剂。
优选地，所述幽门螺旋杆菌疫苗为重组抗原疫苗、病毒载体疫苗或基因疫苗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用，通过CX3CL1-CX3CR1途径能够募集效应记忆性CD4 T细胞，从而有利于疫苗免疫后对机体产生持久的免疫保护。CX3CL1还能够促进Th1、Th2和Th17效应细胞应答，并降低调节性T细胞的应答，从而提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答水平。
本发明提供的幽门螺旋杆菌疫苗，通过将趋化因子CX3CL1与幽门螺旋杆菌抗原联合使用，能够显著降低幽门螺旋杆菌的定植量，提高胃黏膜中CD4 T细胞的数量以及细胞比例，尤其是提高了效应记忆性CD4 T细胞的比例，降低了抑制性的Treg的比例，能使疫苗有效发挥抗幽门螺杆菌感染的免疫保护作用，并提高了疫苗的持久性；同时还能够促进了Th1、Th2和Th17效应细胞应答，降低Treg细胞的应答，提高了幽门螺旋杆菌疫苗的免疫效果，具有较好的有效性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为免疫攻毒实验后，小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定值量检测结果；
图2为免疫攻毒实验后，胃粘膜CD4 T细胞数量；
图3为免疫攻毒实验后，胃粘膜CD4 T细胞比例；
图4为免疫攻毒实验后，胃粘膜IFN-γ、IL-4、IL-17A和Foxp3 mRNA水平；
图5和图6为免疫攻毒实验后，趋化至胃黏膜的效应记忆性CD4 T(CD3+CD4+CX3CR1+CD25-CD44+CD69-CCR7-T)细胞；
图7为免疫攻毒实验后，趋化至胃黏膜的CD4 T细胞中CD25-CD4 T细胞所占的比例；
图8为免疫攻毒实验后，趋化至胃黏膜的CD4 T细胞中的效应记忆性CD4 T细胞所占的比例。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用。趋化因子是一类对细胞具有趋化作用的细胞因子，趋化因子CX3CL1是CX3C类趋化因子家族成员，CX3CR1是CX3CL1唯一特定受体，CX3CL1-CX3CR1途径能够募集效应记忆性CD4 T细胞，从而有利于疫苗免疫后对机体产生持久的免疫保护。CX3CL1还能够促进Th1、Th2和Th17效应细胞应答，并降低调节性T细胞的应答，从而提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答水平。因此将趋化因子CX3CL1应用于制备疫苗，能够提高疫苗的有效性和持久性。
本发明通过实验发现，将来源于幽门螺旋杆菌的抗原与趋化因子CX3CL1联合使用免疫小鼠，并以幽门螺旋杆菌灌胃后，联合趋化因子CX3CL1的免疫组能够显著降低幽门螺旋杆菌的定植量，提高胃黏膜中CD4T细胞的数量以及细胞比例，尤其是提高了效应记忆性CD4 T细胞的比例，降低了抑制性的Treg的比例；同时将幽门螺旋杆菌的抗原与趋化因子CX3CL1联合使用免疫小鼠后，检测小鼠胃黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17A和Foxp3 mRNA水平，发现IFN-γ、IL-4和IL-17A的mRNA水平均升高，而Foxp3 mRNA水平降低，这说明趋化因子CX3CL1促进了Th1、Th2和Th17效应细胞应答，降低了Treg细胞的应答。从上述可以看出，在至少一些可选的实施方式中趋化因子CX3CL1可以应用于制备含有幽门螺旋杆菌抗原的幽门螺旋杆菌疫苗。
基于上述趋化因子CX3CL1和幽门螺旋杆菌抗原的协同作用，本发明还提供了一种幽门螺旋杆菌疫苗，该幽门螺旋杆菌疫苗包含幽门螺旋杆菌抗原和趋化因子CX3CL1。通过趋化因子CX3CL1对幽门螺旋杆菌抗原的增效作用，本发明提供的幽门螺旋杆菌疫苗由于能够提高胃黏膜中CD4 T细胞中的数量，尤其是能够募集效应记忆性CD4 T细胞，提高了疫苗的持久性；本发明提供的幽门螺旋杆菌疫苗通过提高Th1、Th2和Th17效应细胞应答，降低Treg细胞的应答，有效性更佳。
本发明中，幽门螺旋杆菌抗原为能够诱导机体的免疫系统产生免疫应答的物质，这些物质包括来源于天然幽门螺旋杆菌的物质；或人工合成的，或经人工改造的含有幽门螺旋杆菌抗原表位的物质；或能够表达含有幽门螺旋杆菌抗原表位的前体物质。所述幽门螺旋杆菌抗原的实例包括但不限于从天然幽门螺旋杆菌中分离得到的具有免疫原性的蛋白或多肽；经过基因工程改造的具有幽门螺旋杆菌免疫原性的融合蛋白；人工合成的含有幽门螺旋杆菌抗原表位的多肽；所述幽门螺旋杆菌抗原还可以为核酸，本发明中所述的“核酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。所述核酸可以为自身具有免疫原性的核酸分子，也可以为用于表达含有幽门螺旋杆菌抗原表位的蛋白、融合蛋白或多肽的前体物质。因此本发明也不限制幽门螺旋杆菌疫苗的具体形式，所述幽门螺旋杆菌疫苗可以为但不限于为重组抗原疫苗，病毒载体疫苗或基因疫苗。
在一些优选的实施方式中，所述幽门螺旋杆菌抗原包括5-磷酸腺苷脱氢酶(inosine 5'-monophosphate dehydrogenase，IMPDH)、II型柠檬酸合酶(type II citratesynthase，CS II)和尿素酶B亚单位(urease subunit beta，UreB)中的一种或多种。以5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位作为幽门螺旋杆菌抗原，相比于其他来源于幽门螺旋杆菌抗原的抗原免疫原性更佳。5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位分别独立的可以但不限于为来源于天然幽门螺旋杆菌的蛋白或多肽、经过基因工程改造的融合蛋白、人工合成的含有幽门螺旋杆菌抗原表位的多肽，以及能够表达上述三种物质的核酸等。
在一些优选的实施方式中，5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位分别独立的为蛋白，5-磷酸腺苷脱氢酶的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示；II型柠檬酸合酶的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示；尿素酶B亚单位的氨基酸序列优选如SEQ IDNO.3所示。
本发明中，趋化因子CX3CL1包括天然来源的趋化因子CX3CL1，或经基因工程改造的由表达系统生产的重组趋化因子CX3CL1，或能够表达趋化因子CX3CL1的前体物质，例如能够表达趋化因子CX3CL1的核酸。所述趋化因子CX3CL1优选包括abcam重组趋化因子CX3CL1 ab240868(Recombinant mouse CX3CL1 protein(Active)(ab240868))。
当将趋化因子CX3CL1和幽门螺旋杆菌抗原联合使用时，趋化因子CX3CL1即可以起到对幽门螺旋杆菌抗原的免疫增强作用，因此本发明对幽门螺旋杆菌疫苗中幽门螺旋杆菌抗原和趋化因子CX3CL1的具体用量不作限制，幽门螺旋杆菌抗原和趋化因子CX3CL1的具体用量可以为本领域可接受的免疫有效量。在一些具体的实施方式中以免疫小鼠为例，幽门螺旋杆菌蛋白抗原和重组趋化因子CX3CL1的质量比为4:1，具体的为幽门螺杆菌抗原100μg/只，重组趋化因子CX3CL1 25μg/只。当幽门螺杆菌抗原中含有多种抗原时，各抗原的用量相同，即各抗原以等比例混合后以100μg/只的计量免疫小鼠。
在一些优选的实施方式中，所述幽门螺旋杆菌疫苗的免疫活性物质为趋化因子CX3CL1，以及5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和尿素酶B亚单位中的至少一种的组合，具体的可以为如下(a)～(g)中的任意一种组合：
(a)5-磷酸腺苷脱氢酶和趋化因子CX3CL1；
(b)II型柠檬酸合酶和趋化因子CX3CL1；
(c)尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(d)5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶和趋化因子CX3CL1；
(e)5-磷酸腺苷脱氢酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(f)II型柠檬酸合酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1；
(g)5-磷酸腺苷脱氢酶、II型柠檬酸合酶、尿素酶B亚单位和趋化因子CX3CL1。
在一些可选的实施方式中，所述幽门螺旋杆菌疫苗还可以包含本领域可接受的常规辅料，以进一步提高幽门螺旋杆菌疫苗的免疫原性、稳定性或延长疫苗的保质期等。其中辅料优选包括疫苗佐剂，疫苗佐剂能够非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答，诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高疫苗的免疫原性。
实施例
1.动物免疫及攻毒实验方案
实验动物：雌性BALB/c小鼠，6-8周龄。
分组：IMPDH，IMPDH+CX3CL1，CSII，CSII+CX3CL1，UreB，UreB+CX3CL1，IMPDH+CSII+UreB，IMPDH+CSII+UreB+CX3CL1。幽门螺杆菌抗原100μg/只(若幽门螺杆菌抗原含有多种抗原，各抗原等比例混合)，CX3CL1 25μg/只，等量PBS对照。其中IMPDH的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；CSII的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；UreB的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；趋化因子CX3CL1为购买的商品化产品，Recombinant mouse CX3CL1 protein(Active)(ab240868)，可参考https://www.abcam.com/recombinant-mouse-cx3cl1-protein-active-ab240868.html。
佐剂：弗氏佐剂，100μl/只。
免疫方式：抗原+弗氏佐剂，皮下注射。CX3CL1，腹腔注射。
免疫体积：200μl/只。
免疫方案：皮下免疫3次(第0，2，4周)。第一次用完全弗氏佐剂，第二次用不完全弗氏佐剂，第三次不加佐剂。腹腔注射CX3CL1，6次(第3周起，每周一次)。
末次免疫后一周(即第5周)，1.0×109CFU幽门螺杆菌灌胃，每天一次，连续4天。攻毒后第4周处死小鼠，检测小鼠胃组织中幽门螺杆菌定值量、病理损伤、CD4 T细胞应答，分析其免疫保护效果。
2.小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定值量检测
小鼠胃粘膜幽门螺杆菌定植量采用实时定量Real-time RT-PCR方法进行检测。
(1)、将小鼠安乐死后，解剖取胃。
(2)、用手术剪刀将胃组织剪为碎片，加入1ml无菌生理盐水。
(3)、低温条件下用匀浆仪对胃组织进一步进行匀浆处理。而后用细菌基因组DNA提取试剂盒提取幽门螺杆菌DNA。将上述组织匀浆高速离心，弃上清。
(4)、向沉淀中加入200μl GA缓冲液重悬组织碎片。再加入蛋白酶K20μl，混匀。
(5)、加入GB缓冲液，震荡混匀。
(6)、70℃孵育10分钟，溶液变清亮，瞬时离心。
(7)、加入无水乙醇220μl，震旦混匀，有絮状沉淀析出，瞬时离心。
(8)、将上述混合液全部转移至离心柱CB3中，高速(13200g)离心1分钟。
(9)、依次用缓冲液GD、PW洗涤后，将离心柱转移至新的离心管中并晾干。
(10)、加入200μl去离子水，室温静置2分钟。高速离心1分钟，收集滤液即为目的DNA的水溶液。
(11)、取2μl上述DNA溶液用RT-PCR法对幽门螺杆菌16S rDNA进行定量检测。用不同浓度梯度的幽门螺杆菌16S rDNA标准品作标准曲线，同时设置阳性对照和阴性对照。每个条件设置3个复孔，平均值视为检测样本的DNA浓度。检测结果乘以稀释倍数得到每个小鼠胃中幽门螺杆菌的定植量。最终结果用对数(log10)进行表示。
Real-time RT-PCR所用引物及探针如下表。
Real-time PCR反应体系如下。
Real-time PCR反应条件如下。
3.小鼠胃粘膜淋巴细胞分离
沿胃大弯和胃小弯解剖小鼠胃组织，用无菌PBS轻柔洗涤2次，以去除食物残渣。而后放入10ml Hank's平衡盐溶液(HBSS，不含Ca，My)中，含1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，和2％胎牛血清(FCS)，37℃孵育45min。然后，将所得混合物通过无菌钢网以除去未消化的组织得到单细胞悬液。消化后的单细胞悬液用无菌PBS洗两次后待用。
4.小鼠胃粘膜CD4 T细胞表性型检测
对上述分离的淋巴细胞悬液用荧光标记的单克隆抗体染色。所用抗体有，APClabeled anti-mouse CD3，APC/Cy7 labeled anti-mouse CD4，PerCP/Cy5.5 labeledanti-mouse CX3CR1，FITC labeled anti-mouse CD25，PE/Cy7 labeled anti-mouseCD44，BV421 labeled anti-mouse CD69和PE labeled anti-mouse CCR7 antibodies。染色后用PBS洗涤，并重悬于PBS，用流式细胞仪进行检测。
5.小鼠胃粘膜CD4 T细胞应答水平检测
小鼠胃粘膜IFN-γ、IL-4、IL-17A和Foxp3 mRNA水平采用实时荧光定量PCR方法进行检测。
将上述分离的胃粘膜淋巴细胞用总RNA提取试剂盒提取RNA(步骤依说明书)。
(1)、细胞沉淀溶于裂解液RZ，室温放置5分钟，以使核酸蛋白复合体完全分离。
(2)、加入氯仿200μl，剧烈震荡混匀15秒，室温放置3分钟。
(3)、而后4℃条件下，13200g离心10分钟得三层：无色水相、中间层和黄色有机相。将无色水相转移至新管中继续操作。
(4)、在无色水相中加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，并转移至吸附柱CR3中。
(5)、短暂离心使RNA吸附，弃废液。
(6)、依此用缓冲液RD洗去蛋白，用漂洗液RW洗去杂质。
(7)、将离心柱转移至新的离心管中并晾干。
(8)、加入50μl去离子水，室温静置2分钟。
(9)、高速离心1分钟，收集滤液即为目的RNA的水溶液。
用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应条件如下。
基于上述cDNA用SYBR green掺入法Real-time RT-PCR检测IFN-γ、IL-17A表达水平。设置阳性对照空和阴性对照空，并以β-actin作为内参基因。每个条件设置三个复孔，取平均值作为最后的结果。
RT-PCR所用引物为如下。
Real-time PCR反应体系如下。
Real-time PCR反应条件如下。
实验结果如图1～图8所示：
图1为免疫攻毒后检测了胃粘膜幽门螺杆菌的定植量，用以评价联合使用CX3XL1后是否增强了免疫保护效果。从图1可以看出，将CX3CL1与幽门螺杆菌抗原联合免疫的实验组，相比于单独免疫幽门螺杆菌抗原的实验组胃粘膜幽门螺杆菌的定植量更低，如IMPDH组与IMPDH+CX3CL1组，后者幽门螺杆菌定植量更低，说明免疫保护功能更强，同理对于其它几对对比的结果也说明CX3CL1增强了幽门螺杆菌抗原的免疫保护功能。
图2和图3为分别评价了免疫攻毒实验后，小鼠胃粘膜CD4 T细胞的数量及比例。大量研究已经证明，CD4 T细胞在抗幽门螺杆菌感染中发挥了重要的保护作用。而本实验发现，幽门螺杆菌抗原联合使用CX3CL1后，能够向胃粘膜募集了更多的CD4 T细胞。
图4为用RT-PCR法从mRNA水平检测了免疫攻毒保护实验后小鼠胃粘膜激发的IFN-r、IL-17A、IL-4及Foxp3的水平，其分别是th1、th17、th2和Treg细胞应答的代表性分子。从分子水平说明了，联合使用CX3CL1后，激发了更强的th1(IFN-r)、th2(IL-4)、th17(IL-17A)效应细胞应答，并降低调节性T细胞Treg(Foxp3)的应答。
图5和图6为对免疫攻毒保护实验后募集到小鼠胃粘膜的CX3CR1+的CD4 T细胞进行了免疫表型分析。图6为对图5中B部分的方框区域内的细胞的表型分析，发现联合使用CX3CL1后，通过CX3CL1-CX3CR1途径趋化至胃黏膜的主要是效应记忆性CD4 T细胞(CD3+CD4+CX3CR1+CD25-CD44+CD69-CCR7-T细胞)，该细胞能够增加持久保护作用；另外，CX3CR1是CX3CL1目前已知的唯一受体。由此可以看出将幽门螺杆菌抗原和CX3CL1联合使用，增强了幽门螺杆菌疫苗保护的持久性。
进一步分析免疫攻毒保护实验后，通过CX3CL1-CX3CR1途径募集来的CD4 T细胞中CD25-细胞的比例，CD25分子是具有抑制功能的调节性T细胞Treg的重要表面标志。结果如图7所示，数据说明，联合使用CX3CL1后，募集来的CD4 T细胞主要是效应性的T细胞，而不是抑制性的T细胞，Treg的募集是降低的。说明，CX3CL1促进了效应性CD4 T细胞的募集，并抑制了Treg的募集，从而发挥保护作用。
记忆性T细胞在发挥持久的抗感染免疫中具有重要意义。图8为免疫攻毒实验后，通过CX3CL1-CX3CR1途径趋化至胃黏膜的CD4 T细胞中的效应记忆性CD4 T(CD3+CD4+CX3CR1+CD25-CD44+CD69-CCR7-T)细胞所占的比例，从图8可以看出，联合使用CX3CL1，促进了更多的效应记忆性CD4 T细胞向胃粘膜募集，从而有力于发挥持久的免疫保护。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院第二医学中心
<120> 趋化因子CX3CL1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> 幽门螺旋杆菌（Helicobactor pylori）
<400> 1
Met Arg Ile Leu Gln Arg Ala Leu Thr Phe Glu Asp Val Leu Met Val
1 5 1015
Pro Arg Lys Ser Ser Val Leu Pro Lys Asp Val Ser Leu Lys Ser Arg
202530
Leu Thr Lys Asn Ile Ser Leu Asn Ile Pro Phe Ile Ser Ala Ala Met
354045
Asp Thr Val Thr Glu His Lys Thr Ala Ile Ala Met Ala Arg Leu Gly
505560
Gly Ile Gly Ile Val His Lys Asn Met Asp Ile Gln Thr Gln Val Lys
65707580
Glu Ile Thr Lys Val Lys Lys Ser Glu Ser Gly Val Ile Asn Asp Pro
859095
Ile Phe Ile His Ala His Arg Thr Leu Ala Asp Ala Lys Val Ile Thr
100 105 110
Asp Asn Tyr Lys Ile Ser Gly Val Pro Val Val Asp Asp Lys Gly Leu
115 120 125
Leu Ile Gly Ile Leu Thr Asn Arg Asp Val Arg Phe Glu Thr Asp Leu
130 135 140
Ser Lys Lys Val Gly Asp Val Met Thr Lys Met Pro Leu Val Thr Ala
145 150 155 160
Arg Val Gly Ile Ser Leu Glu Glu Ala Arg Asp Leu Met His Lys His
165 170 175
Lys Ile Glu Lys Leu Pro Ile Val Asp Lys Asp Asn Val Leu Lys Gly
180 185 190
Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Gln Lys Arg Ile Glu Tyr Pro Glu Ala
195 200 205
Asn Lys Asp Asp Phe Gly Arg Leu Arg Val Gly Ala Ala Ile Gly Val
210 215 220
Gly Gln Leu Asp Arg Ala Glu Met Leu Val Lys Ala Gly Val Asp Ala
225 230 235 240
Leu Val Leu Asp Ser Ala His Gly His Ser Ala Asn Ile Leu His Thr
245 250 255
Leu Glu Glu Ile Lys Lys Ser Leu Val Val Asp Val Ile Val Gly Asn
260 265 270
Val Val Thr Lys Glu Ala Thr Ser Asp Leu Ile Ser Ala Gly Ala Asp
275 280 285
Ala Ile Lys Val Gly Ile Gly Pro Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Ile
290 295 300
Val Ala Gly Val Gly Met Pro Gln Val Ser Ala Ile Asp Asn Cys Val
305 310 315 320
Glu Val Ala Ser Lys Phe Asp Ile Pro Val Ile Ala Asp Gly Gly Ile
325 330 335
Arg Tyr Ser Gly Asp Val Ala Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Ser Ser
340 345 350
Val Met Ile Gly Ser Leu Leu Ala Gly Thr Glu Glu Ser Pro Gly Asp
355 360 365
Phe Met Ile Tyr Gln Gly Arg Gln Tyr Lys Ser Tyr Arg Gly Met Gly
370 375 380
Ser Ile Gly Ala Met Thr Lys Gly Ser Ser Asp Arg Tyr Phe Gln Glu
385 390 395 400
Gly Val Ala Ser Glu Lys Leu Val Pro Glu Gly Ile Glu Gly Arg Val
405 410 415
Pro Tyr Arg Gly Lys Val Ser Asp Met Ile Phe Gln Leu Val Gly Gly
420 425 430
Val Arg Ser Ser Met Gly Tyr Gln Gly Ala Lys Asn Ile Leu Glu Leu
435 440 445
Tyr Gln Asn Ala Glu Phe Val Glu Ile Thr Ser Ala Gly Leu Lys Glu
450 455 460
Ser His Val His Gly Val Asp Ile Thr Lys Glu Ala Pro Asn Tyr Tyr
465 470 475 480
Gly
<210> 2
<211> 426
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobactor pylori）
<400> 2
Met Ser Val Thr Leu Val Asn Asn Glu Asn Asn Glu Arg Tyr Glu Phe
1 5 1015
Glu Thr Ile Glu Ser Thr Arg Gly Pro Lys Ala Val Asp Phe Ser Lys
202530
Leu Phe Glu Thr Thr Gly Phe Phe Ser Tyr Asp Pro Gly Tyr Ser Ser
354045
Thr Ala Gly Cys Gln Ser Lys Ile Ser Tyr Val Asn Gly Lys Lys Gly
505560
Glu Leu Tyr Tyr Arg Gly His Arg Ile Glu Asp Leu Val Ala Lys Tyr
65707580
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Tyr Ser Thr His Gln Asn Met His Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌（Helicobactor pylori）
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