来源于微球菌属细菌的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及来源于属于微球菌属(genus Micrococcus)的细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及通过使用来源于属于微球菌属的细菌的纳米囊泡来诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病等等的方法，以及包括所述纳米囊泡的用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物。
背景技术
自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物组之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性病已经改变疾病模式，成为决定生活质量和人类寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性疾病，癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、代谢性疾病和神经精神疾病已成为国家公共卫生的重要问题，成为决定人类寿命和生活质量的主要疾病。这些顽固性慢性疾病的特征是伴随由致病因子引起的免疫功能障碍的慢性炎症。
众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息地中的细菌、古细菌和真核生物。
我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、低分子化合物、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。由细菌局部分泌的来源于细菌的囊泡经粘膜上皮细胞吸收，从而引起局部炎症反应，而穿过上皮细胞的囊泡经淋巴管系统吸收，从而分布在各个器官中，并且免疫和炎性反应在分布有囊泡的器官中受到调节。
例如，来源于致病性革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的囊泡在经血管吸收时局部诱导结肠炎，并通过血管内皮细胞炎性反应促进全身性炎症反应和凝血。另外，这些囊泡被吸收到胰岛素作用于其上的肌肉细胞等中，以引起胰岛素耐受性和糖尿病。相反，来源于有益细菌的囊泡可通过调节由致病囊泡导致的免疫功能和代谢功能障碍来调节疾病。
作为对诸如来源于细菌的囊泡等因素的免疫反应，以白介素(IL)-17细胞因子的分泌为特征的Th17免疫反应发生，其中当暴露于来源于细菌的囊泡时分泌IL-6，从而诱导Th17免疫反应。由Th17免疫反应引起的炎症以嗜中性粒细胞浸润为特征，并且在炎症发生的过程中，从炎症细胞(如巨噬细胞等)分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在疾病的发展中起着重要的作用。
属于微球菌属的细菌(其是属于微球菌科的革兰氏阳性细菌)在自然界中广泛分布，例如在水、灰尘、土壤等中广泛分布。其中，已知滕黄微球菌(Micrococcus luteus)在有毒的有机污染物(例如吡啶)中生长时会产生核黄素，并通过叶黄素色素吸收紫外线。还已知，属于微球菌属的细菌是从乳制品和啤酒中分离出来的，并在干燥或高盐分的环境中生长，尽管没有形成孢子，但细菌在冰箱中的冷藏温度下能长时间生存。然而，尚未报道属于微球菌属的细菌在细胞外分泌囊泡，特别是没有报道将其用于诊断和治疗癌症、心血管疾病、过敏性/慢性肺部疾病、痴呆或代谢性疾病的应用。
发明内容
【技术问题】
为了解决上述问题，经过执行深入研究，本发明的发明人通过宏基因组分析证实，与正常人相比，在来源于患有胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的患者的样品中，来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的含量显著降低。还证实了，当从滕黄微球菌(其是属于微球菌属的细菌)分离囊泡并用其处理巨噬细胞时，由致病性囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制，从而根据这些发现完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种提供用于诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的信息的方法，
此外，本发明的另一个目的是提供用于预防、减轻或治疗胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的组合物，其包括作为活性成分的来源于属于微球菌属的细菌的囊泡。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于属于所述微球菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病。
另外，本发明提供了一种诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于属于所述微球菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病。
作为本发明的一个示例性实施方案，步骤(a)中的样品可以是血液。
作为本发明的另一个示例性实施方案，步骤(b)中的成对的引物可以是SEQ IDNo.1和2的引物。
此外，本发明提供了用于预防或治疗胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡。
在本发明的一实施方案中，药物组合物可以包含眼用组合物。
另外，本发明提供了一种用于预防或减轻胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡。
另外，本发明提供了一种用于预防或治疗胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的吸入组合物，其包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡。
另外，本发明提供了一种用于预防或减轻特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮或脱发的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡。
此外，本发明提供了一种预防或治疗胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡的药物组合物。
此外，本发明提供了来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡在预防或治疗胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病中的用途。
作为本发明的又一示例性实施方案，囊泡的平均直径可以为10至200nm。
作为本发明的另一个示例性实施方案，囊泡可以从属于微球菌属的细菌中天然或人工地分泌。
作为本发明的另一个示例性实施方案，来源于属于微球菌属的细菌的囊泡可以是来源于滕黄微球菌的囊泡。
【有益效果】
本发明人证实肠细菌没有被吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡通过上皮细胞被吸收到体内，全身地分布，并通过肾脏、肝脏和肺从体内排泄，以及证实了通过宏基因组学分析来源于患者的血液中存在的细菌的囊泡，来源于患有胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的患者的血液中存在的属于微球菌属的细菌的囊泡与在正常人中的相比显著减少。还证实了，当体外培养滕黄微球菌(其是属于微球菌属的细菌)并从中分离囊泡，然后在体外将分离的囊泡施用于炎性细胞时，致病性囊泡引起的炎性介质的分泌被显著抑制，因此，可以预期，来源于属于微球菌属的细菌的囊泡可以有效地用于诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的方法，以及用于预防、减轻或治疗上述疾病的组合物等等。
附图说明
图1A是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(EV)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(EV)的分布模式的一系列照片，并且图1B是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。
图2是在对胃癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图3是在对胰腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图4是在对胆管癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图5是在对乳腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图6是在对卵巢癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图7是在对膀胱癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图8是在对心肌梗塞患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图9是在对心肌病患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图10是在对房颤患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图11是在对变异型心绞痛患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图12是在对慢性阻塞性肺病(COPD)患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图13是在对痴呆患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图14是在对糖尿病患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较了来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图15示出了将用来源于滕黄微球菌的囊泡和大肠杆菌EV(其为致病性囊泡)处理的巨噬细胞(Raw264.7细胞)之间的IL-6和TNF-α(其为炎性介质)的分泌程度进行比较的结果，以评估来源于滕黄微球菌的囊泡对诱导炎症的作用。
图16示出了评价来源于滕黄微球菌的囊泡在先用该囊泡进行预处理然后用大肠杆菌EV(其是致病性囊泡)处理之后，对大肠杆菌EV所引起的作为炎性介质的IL-6和TNF-α的分泌的影响的结果，以评估来源于滕黄微球菌的囊泡对抗炎和免疫调节的作用。
具体实施方式
本发明涉及来源于属于微球菌属的细菌的囊泡及其用途。
本发明的发明人通过宏基因组分析证实，与正常个体相比，来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的含量在来源于患有胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的患者的临床样品中显著减少，由此证实，可以确诊这些疾病。另外，通过从滕黄微球菌中分离囊泡并分析其特性，证实了该囊泡能够用作用于预防、减轻或治疗诸如胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的组合物等等。
因此，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析将其中来源于属于所述微球菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病。
如本文所使用的，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和/或糖尿病是否发生，疾病的程度等。
如本文所使用的，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。
来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(OMV)不仅具有内毒素(脂多糖)，而且具有毒性蛋白和细菌DNA和RNA，以及来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸之外还具有肽聚糖和脂磷壁酸，它们是细菌的细胞壁成分。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由微球菌属细菌天然分泌的或人工产生的，呈球形，平均直径为10至200nm。
如本文所用，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是一个从形成一个完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是一种技术的目标，该技术通过一种快速序列分析方法，通过分析所有DNA和RNA来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢，而与物种无关。
在本发明中，样品可以是血液，但不受限于此。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防、治疗或减轻胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的组合物，其包含作为活性成分的来源于属于所述微球菌属的细菌的囊泡。该组合物包括食品组合物、吸入剂组合物、化妆品组合物和药物组合物。
另外，在本发明中，食品组合物包括健康功能性食品组合物，并且药物组合物可以包括眼用组合物，但是本发明不受限于此。
如本文所用，术语“预防”是指抑制胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和/或糖尿病等等或者通过施用根据本发明的组合物来延迟其发作的所有行为。
如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、脱发、黄斑变性、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病等等的症状的所有行为。
如本文所用，术语“减轻”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有行为。
可通过使用选自离心、超高速离心、高压处理、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械分解、化学处理、通过过滤器的过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳的一种或多种方法，从包含属于微球菌属的细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和浓缩所获得的囊泡之类的过程。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’sliterature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。
本发明的药物组合物可以根据目标方法口服施用或可胃肠外施用(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内施用)，并且施用剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式以及给药途径和周期而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括以下的因素确定：患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物，以及其他医学领域众所周知的因素。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且通常是每1千克体重施用0.001至150mg该组合物，优选每1千克体重施用0.01至100mg该组合物，可以每天或隔天给药，或者每天给药一次至三次。然而，由于有效量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少，因此给药剂量并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
在本发明的吸入组合物中，可以将活性成分直接添加到吸入剂中，或者可以与其他成分组合使用，并且可以根据常规方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或治疗)适当地确定。
本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。
除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，像典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的化妆品组合物不仅可以包括来源于属于微球菌属的细菌的囊泡，而且可以包括化妆品组合物中常用的成分，并且可以包括例如一般的佐剂，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和草药以及载体。
另外，本发明的组合物除了包含来源于微球菌属的细菌的囊泡以外，还可以包含在不通过与来源于微球菌属细菌的囊泡反应而不利地影响皮肤保护效果的范围内长期使用的有机紫外线阻断剂的混合物。有机紫外线阻断剂可以选自由甘油基PABA、甲酚曲唑三硅氧烷(drometrizole trisiloxane)、甲酚曲唑(drometrizole)、三油基二没食子酸酯(digalloyl trioleate)、苯基二苯并咪唑四磺酸二钠(disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate)、二乙基己基丁酰胺三嗪酮(diethylhexyl butamidotriazone)、二乙氨基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯(diethylamino hydroxyl benzoylhexyl benzoate)、DEA-甲氧基肉桂酸酯(DEA-methoxycinnamate)、劳森(Lawson)和二羟基丙酮(dihydroxyacetone)混合物、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基苯酚(methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol)、4-甲基亚苄基樟脑、邻氨基苯甲酸甲酯(methyl anthranilate)、二苯甲酮-3(氧苯甲酮)、二苯甲酮-4、二苯甲酮-8(二氧苯甲酮)(benzophenone-8(dioxyphebenzone))、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、双乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪、肉桂酸酯、乙基二羟丙基PABA、辛二烯、乙基己基二甲基PABA、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基己酯(ethylhexyl salicylate)、乙基己基三嗪酮(ethylhexyltriazone)、对甲氧基肉桂酸异戊酯(isoamyl-p-methoxycinnamate)、聚硅氧烷-15(亚苄基丙二酸盐聚硅氧烷)(polysilicon-15(dimethicodiethylbenzal malonate))、对苯二亚甲基二樟脑磺酸(terephthalylidene dicamphor sulfonic acid)及其盐、TEA-水杨酸酯和对氨基苯甲酸(PABA)组成的群组中的一种或多种。
产品的示例(本发明的化妆品组合物可以添加到其中)包括化妆品，例如收敛剂，皮肤柔软剂，滋养爽肤水，各种面霜，香精，面膜(packs)，粉底等，清洁剂，洗面奶，肥皂，护理剂，美容液等。本发明的化妆品组合物的具体制剂包括皮肤乳液、皮肤柔软剂、皮肤爽肤水、收敛剂、乳液、乳霜、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、香精、滋养香精、面膜、肥皂、洗发水、清洁泡沫、清洁乳液、清洁霜、润肤露、沐浴露、乳液、口红、化妆底、粉底、粉饼、散粉、眼影膏等。
在本发明的一个实施方案中，通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，证实了，尽管细菌不是通过肠粘膜吸收的，但是来源于细菌的囊泡在给药后5分钟内被吸收并全身分布，且通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。
在本发明的另一示例性实施方案中，通过使用从正常个体的血液中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析，所述正常个体的年龄和性别与患有胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的患者匹配。结果证实，与正常个体的样品相比，在患有胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆和糖尿病的患者的临床样品中，来源于属于微球菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例3至15)。
在本发明的另一实施方案中，评估了从培养的滕黄微球菌菌株分泌的囊泡是否表现出免疫调节和抗炎作用，并且通过评估由用不同浓度的来源于滕黄微球菌的囊泡处理、然后用作为炎性疾病的致病因子的来源于大肠杆菌的囊泡处理的巨噬细胞分泌的炎症介质，证实由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被来源于滕黄微球菌的囊泡有效地抑制(参见实施例18)。
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例
实施例1.肠道细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠道细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行实验。将50μg剂量的小鼠胃中的带有荧光标记的每种肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡施用至胃肠道，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1A所示，细菌不被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时。
此外，为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药12小时后收集血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1B所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、肌肉和脂肪中，但是细菌没有被吸收。
实施例2.临床样品中来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
首先将临床样品(例如血液)放入10ml试管中，通过离心(3,500×g，10分钟，4℃)使悬浮物沉降，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到Centriprep管(离心过滤器50kD)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kD的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90Ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(PBS)中。
通过将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将DNA在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用Nanodrop定量DNA的量。此后，为了确认提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。
[表1]
使用16S rDNA引物对通过上述方法提取的DNA进行扩增，然后进行测序(IlluminaMiSeq测序仪)，结果以标准流程图格式(SFF)文件输出，使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后确认用于阅读的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(Phred分数<20)已删除。对于操作分类单元(OTU)分析，通过使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个OUT的门、纲、目、科和属级上进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes(QIIME)的16S RNA序列数据库(108,453个序列)对在该属级上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析。
实施例3.来源于胃癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从66例胃癌患者和198例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胃癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表2和图2)。
[表2]
实施例4.来源于胰腺癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从176例胰腺癌患者和271例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胰腺癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表3和图3)。
[表3]
实施例5.来源于胆管癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从79例胆管癌患者和259例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胆管癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表4和图4)。
[表4]
实施例6.来源于乳腺癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从96例乳腺癌患者和192例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自乳腺癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表5和图5)。
[表5]
实施例7.来源于卵巢癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从137例卵巢癌患者和139例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自卵巢癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表6和图6)。
[表6]
实施例8.来源于膀胱癌患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从91例膀胱癌患者和176例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自膀胱癌患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表7和图7)。
[表7]
实施例9.来源于心肌梗塞患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从57例心肌梗塞患者和163例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自心肌梗塞患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表8和图8)。
[表8]
实施例10.来源于心肌病患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从72例心肌病患者和163例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自心肌病患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表9和图9)。
[表9]
实施例11.来源于房颤患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从34例房颤患者和62例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自房颤患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表10和图10)。
[表10]
实施例12.来源于变异型心绞痛患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从80例变异型心绞痛患者和80例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自变异型心绞痛患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表11和图11)。
[表11]
实施例13.来源于COPD患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从205例COPD患者和231例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自COPD患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表12和图12)。
[表12]
实施例14.来源于痴呆患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从67例痴呆患者和67例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自痴呆患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表13和图13)。
[表13]
实施例15.来源于糖尿病患者的血液中的细菌的囊泡的宏基因组学分析
从61例糖尿病患者和122例正常个体的血液样品中存在的囊泡中提取基因，两组的年龄和性别均匹配，使用实施例2的方法对其进行宏基因组分析，然后对从来源于属于微球菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自糖尿病患者的血液中的来源于属于微球菌属的囊泡显著减少(参见表14和图14)。
[表14]
实施例16.从滕黄微球菌培养液中分离囊泡
基于以上实施例，培养了滕黄微球菌菌株，然后从中分离囊泡并分析了所分离的囊泡的特性。于37℃的有氧室内，在MRS(de Man-Rogosa and Sharpe)培养基中培养菌株滕黄微球菌，直至吸光度(OD600)达到1.0至1.5，然后进行继代培养。随后，回收包含该菌株的培养上清液，并在10,000g和4℃下离心20分钟，然后将菌株移出并通过0.22μm过滤器过滤。通过使用具有100kDa Pellicon 2盒式滤膜(Merck Millipore，美国)的MasterFlex泵系统(Cole-Parmer，美国)经由微滤将过滤的上清液浓缩至50ml的体积。将浓缩的上清液再次用0.22μm的过滤器过滤。此后，通过使用BCA测定法对蛋白质进行定量，并对获得的囊泡进行以下实验。
实施例17.来源于滕黄微球菌的囊泡的炎症诱导作用
为了检查来源于滕黄微球菌的囊泡对炎性细胞中炎性介质(IL-6和TNF-α)分泌的影响，用不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml)的来源于滕黄微球菌的囊泡处理了Raw264.7细胞(一种小鼠巨噬细胞系)，然后进行ELISA。
更具体地说，将以4×104个细胞/孔的密度分配到48孔细胞培养板中的Raw 264.7细胞在Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)无血清培养基中用不同浓度的来源于滕黄微球菌的囊泡进行处理，并且培养12小时。随后，将细胞培养液收集在1.5ml管中，并以3,000×g离心5分钟，收集上清液并保存在-80℃，然后进行ELISA。
为了进行ELISA，将捕获抗体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释，然后按照工作浓度将其50μl等分试样分配到96孔聚苯乙烯平板中，然后使其在4℃下反应过夜。随后，将样品用100μl PBST(含0.05％Tween-20的PBS)溶液洗涤3次，然后将RD(含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS)溶液分装成100μl等分试样，然后在室温下封闭1小时，接着将样品和标准品按照浓度分装成50μl等分试样，并在室温下反应2小时。然后，将样品和标准品用100μl PBST洗涤3次，接着用RD稀释检测抗体，并根据工作浓度将稀释的溶液分装成50μl等分试样，并使其在室温下反应持续2个小时。
之后，将样品和标准品用100μl PBST洗涤3次，然后将链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)(R&D Systems，美国)在RD中稀释至1/40，并将稀释后的溶液分装成50μl等分试样并使其在室温下反应20分钟。最后，将样品和标准品用100μl PBST洗涤3次，然后将四甲基联苯胺(TMB)底物(SurModics，美国)分装成50μl等分试样，接着当在5分钟至20分钟后显色时，将1M硫酸溶液分装成50μl等分试样，从而终止反应，并使用SpectraMax M3酶标仪(Molecular Devices，美国)测量450nm处的吸光度。
结果，如图15所示，已经证实，与作为病原性囊泡的大肠杆菌EV相比，当用来源于滕黄微球菌的囊泡处理巨噬细胞时，炎性介质的分泌显著减少。
实施例18.来源于滕黄微球菌的囊泡的抗炎作用
基于上述实施例17的结果，为了研究来源于滕黄微球菌的囊泡对炎性细胞中炎性介质的分泌的影响，在用不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)的来源于滕黄微球菌的囊泡处理作为小鼠巨噬细胞的Raw 264.7细胞后，通过处理来源于作为炎性疾病发病机理的囊泡的大肠杆菌的囊泡(E.coli EV)来测量分泌的炎性介质(IL-6、TNf-α等)的量。更具体地，在将Raw 264.7细胞以1×105细胞/孔等分分到24孔细胞培养板中之后，将细胞在DMEM完全培养基中培养24小时。之后，将培养上清液收集在1.5ml试管中，并以3,000g离心5分钟，回收上清液并在4℃下保存，然后进行ELISA分析。结果，如图14中所示，证实了当对来源于滕黄微球菌的囊泡进行预处理时，显著抑制了来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌。这些结果表明，来源于滕黄微球菌的囊泡能够有效地抑制由病原囊泡(例如来源于大肠杆菌的EV)引起的炎症反应。
提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅是说明性的，而不是限制性的。
【工业适用性】
根据本发明的来源于属于微球菌属的细菌的囊泡不仅可以使用在用于诊断胃癌、胰腺癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、心肌梗塞、心肌病、房颤、变异型心绞痛、慢性阻塞性肺病(COPD)、痴呆或糖尿病的方法中，而且可以作为预防、减轻或治疗上述疾病的组合物，因此有望有效地用于相关的医疗、化妆品和食品工业领域。
<110> MD保健株式会社
<120> 来源于微球菌属细菌的纳米囊泡及其用途
<130> MPO19-079CN
<150> KR 10-2018-0024895
<151> 2018-02-28
<150> KR 10-2019-0022167
<151> 2019-02-26
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
