一种阿法骨化醇在制备干预皮肤光损伤外用制剂中的应用
技术领域
本发明具体涉及一种阿法骨化醇在制备干预皮肤光损伤外用制剂中的应用。
背景技术
在日常情况下，人体部分皮肤会暴露于日光下。由于不同的生活方式和工作类型，过度的日光暴露会引起皮肤的一系列损伤，这主要是由日光中的紫外线、特别是中波紫外线(UVB)的过度照射而引起。UVB的波长290～320nm，具备中等穿透力，日光中含有的UVB大部分被臭氧层所吸收，只有不足2％能到达地球表面，在夏天和午后会特别强烈。UVB对人体具有红斑作用，虽然能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成，但长期或过量照射会诱发皮肤出现红斑、水疱、炎症、粗糙、增厚、色素沉着、毛细血管扩张、光老化等一系列急、慢性反应。
皮肤经历光损伤后，表皮出现厚度变异，伴有局灶的萎缩或增生，以及黑色素沉着。真皮出现由纤维功能降低和成纤维细胞增生能力减弱而带来的角质化倾向。随损伤程度不同，可以诱发从轻到重的一系列皮肤疾病，这主要包括一些光敏性皮肤病(如日光疹、光化性皮炎等)、光线加剧性皮肤病(如痤疮、黄褐斑等)、甚至光线致癌(如日光性角化症、鳞状细胞癌等)。该类疾病易反复、难治愈、容易诱发癌变，严重危害着人民群众的身心健康，是皮肤病领域一项研究难题。目前针对皮肤光损伤和光损伤性皮肤病的防护主要是避免过度日晒，使用防晒霜和防晒措施；对于较为恶性的光线致癌疾病例如日光性角化症的治疗可供选择的手段更少，且对皮肤副作用伤害较大，临床效果有限，亟待出现新的治疗分子治疗药物。
阿法骨化醇是维生素D的活性代谢产物，在调节钙平衡和骨骼代谢中起重要作用。阿法骨化醇可通过肝脏中的25-羟化酶激活，并在全身和成骨细胞中发挥维生素D作用。它在肠、骨、甲状旁腺、肌肉和大脑中发挥独特的多效作用。阿法骨化醇可以增加小肠和肾小管对钙的重新收，抑制甲状旁腺增生，减少甲状旁腺素合成与释放，抑制骨吸收；还可增加转化生长因子和胰岛素样生长因子的合成，促进胶原和骨基质蛋白合成；另外，该药物还能调节肌肉钙代谢，促进肌细胞分化，增强肌肉力量，增加神经肌肉协调性，减少跌倒倾向。基于这些药理机制，目前阿法骨化醇主要用于改善维生素D代谢异常所致的症状(如低钙血症、抽搐、骨痛及骨损害)，还可用于骨质疏松症。到目前为止还未见将阿法骨化醇用于修复皮肤光损伤的报道。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本专利发明人在实验中，偶然发现阿法骨化醇在干预皮肤光损伤方面显示出较好的活性。基于实验数据，本发明提供了一种阿法骨化醇或含有阿法骨化醇的有关外用制剂在预防和/或治疗皮肤光损伤的药物中的用途。
技术方案：一种阿法骨化醇在制备预防和/或治疗皮肤光损伤的外用药物中的用途，所述的阿法骨化醇，具体结构如下：
作为优化：所述外用药物是用于促进成纤维细胞增殖的物质。
作为优化：所述外用药物是抑制基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3表达的物质。
作为优化：所述外用药物是抑制细胞外基质降解的物质。
作为优化：所述外用药物可增加表皮厚度，改善真皮层弹性纤维和胶原纤维排列的物质。
作为优化：所述外用药物是增加表皮厚度，改善真皮层弹性纤维和胶原纤维排列的物质。
作为优化：皮肤光损伤是指紫外线导致的皮肤损伤。
一种预防和/或治疗皮肤光损伤的外用制剂，阿法骨化醇或阿法骨化醇与可接受的辅料经一定制备过程而形成的外用制剂，所述的外用制剂是由以下成分按如下百分比质量构成：阿法骨化醇3.5％、纯净水44-49％、1，2-丙二醇9-10％、乙醇5-6％、聚二甲基硅氧烷7％、PEG 800025％、尼泊金甲酯0.5％。
一种根据所述的预防和/或治疗皮肤光损伤的外用制剂的制备方法，制备方法如下：
(1)将处方量的阿法骨化醇、1，2-丙二醇、乙醇和尼泊金甲酯加热至50℃充分溶解成澄清透明溶液，为混合物A；
(2)将纯净水、聚二甲基硅氧烷和PEG 8000加热至50℃后，机械搅拌充分均化，为混合物B；
(3)趁热在高速搅拌下降混合物A缓缓加入混合物B中，搅拌均匀后降温至室温，即得本实施例所述外用制剂。
一种根据所述的预防和/或治疗皮肤光损伤的外用制剂的使用方法，取适量直接外用涂抹于皮肤，一天一次，无需清洗，使用前可涂抹保湿霜。
有益效果：本发明中的阿法骨化醇可提高成纤维细胞的增殖活性；还可抑制MMP-1和MMP-3的表达，减少细胞外基质的降解；并且可以显著减轻皮肤光损伤症状；可用于制备干预皮肤光损伤的外用药品，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明的小鼠皮肤HE染色示意图；
其中，图a是正常小鼠皮肤；图b是对照组小鼠皮肤(即只接受UVB照射，无阿法骨化醇干预)；图c是实验组小鼠皮肤(即接受UVB照射和阿法骨化醇干预)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种有代表性的干预皮肤光损伤的外用制剂，它是由以下成分构成的：阿法骨化醇3.5％、纯净水49％、1，2-丙二醇10％、乙醇5％、聚二甲基硅氧烷7％、PEG 800025％、尼泊金甲酯0.5％。上述各物质百分比为质量比。
制备方法如下：
(1)将处方量的阿法骨化醇、1，2-丙二醇、乙醇和尼泊金甲酯加热至50℃充分溶解成澄清透明溶液，为混合物A；
(2)将纯净水、聚二甲基硅氧烷和PEG 8000加热至50℃后，机械搅拌充分均化，为混合物B；
(3)趁热在高速搅拌下降混合物A缓缓加入混合物B中，搅拌均匀后降温至室温，即得本实施例所述外用制剂。
使用方法：取适量直接外用涂抹于皮肤，一天一次，无需清洗，使用前可涂抹保湿霜。
实施例2
一种有代表性的干预皮肤光损伤的外用制剂，它是由以下成分构成的：阿法骨化醇3.5％、纯净水44％、1，2-丙二醇9％、乙醇6％、聚二甲基硅氧烷7％、单硬脂酸甘油酯15％、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)15％、尼泊金甲酯0.5％。上述各物质百分比为质量比。
制备方法如下：
(1)将处方量的阿法骨化醇、1，2-丙二醇、乙醇和尼泊金甲酯加热至50℃充分溶解成澄清透明溶液，为混合物A；
(2)将纯净水、聚二甲基硅氧烷、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)加热至50℃后，机械搅拌充分均化，为混合物B；
(3)趁热在高速搅拌下降混合物A缓缓加入混合物B中，搅拌均匀后降温至室温，即得本实施例所述外用制剂。
使用方法：取适量直接外用涂抹于皮肤，一天一次，无需清洗，使用前可涂抹保湿霜。
本发明通过以下对比试验例1-2来说明本发明的具体优势，具体如下：
对比试验例1阿法骨化醇干预光损伤的细胞实验
(1)建立细胞光损伤模型
取小儿包皮，采用常规方法分离成纤维细胞培养，传代至3-5代后冻存，细胞复苏后接种于培养皿，培养基中加入50mg/L的8-甲氧沙林(8-MOP)，照射时弃培养基，以含50mg/L的8-MOP的PBS漂洗2次后行UVA辐照，照射一次剂量为9J/cm2，连续照射21天。显微镜下观察细胞均出现损伤的特征改变：即细胞变大，胞内颗粒增加，胞质空泡化及增殖延缓。
(2)实验药物：阿法骨化醇
(3)促进成纤维细胞的增值活性(％)
实验方法：将UVA照射后的成纤维细胞按6×105个/孔接种于96孔板中，培养24小时后加入10μL浓度分别为0.01％，0.02％和0.04％的阿法骨化醇，继续培养24小时后加入10μL/孔的CCK-8试剂，孵育3小时后用酶联免疫检测仪测定450nm的吸光度(A)值。重复3次。
细胞活力(％)＝[A(试验组)-A(0)]/[A(空白对照)-A(0)]×100％；
其中，A(试验组)表示有细胞、CCK-8溶液和阿法骨化醇的孔的吸光度；A(0)表示有CCK-8溶液，而无细胞和阿法骨化醇的孔的吸光度；A(空白对照)有细胞、CCK-8溶液，而无阿法骨化醇的孔的吸光度。
表1不同浓度阿法骨化醇对成纤维细胞增殖的影响
由表1可知，阿法骨化醇作用于成纤维细胞后，可提高细胞增殖活性，且提高程度具有统计学意义(p<0.05)。
(4)抑制基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3)的表达
试验分为四组，分别为未处理组(未予阿法骨化醇和UVA辐照处理的正常对照组)、阿法骨化醇处理组(成纤维细胞+0.01％阿法骨化醇)、UVA处理组、UVA+阿法骨化醇处理组(UVA辐照后予以0.01％阿法骨化醇处理)，培养48小时后取细胞上清液，提取后按照ELISA试剂盒说明加样、温育、洗涤后加酶、温育、洗涤，最后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中MMP-1、MMP-3浓度。
表2阿法骨化醇对MMP-1和MMP-3表达的影响
由表2可知，阿法骨化醇可抑制MMP-1和MMP-3的表达，而MMP-1和MMP-3是分解细胞外基质成分的重要酶：其中MMP-1主要水解I，II和III型胶原；MMP-3水解底物则比较广泛，包括胶原、蛋白多糖和明胶等。因此抑制二者活性可减少细胞外基质的降解。
对比试验例2阿法骨化醇干预光损伤的动物实验
(1)建立动物光损伤模型
先用剪刀和电动剃须刀剔除小鼠背部毛发，充分暴露其背部皮肤后进行UVB(300mJ/cm2)辐照小鼠，每天一次，连续3天，造模结束，造模成功的小鼠背部皮肤出现明显红斑鳞屑改变。
(2)实验分组
建模成功后的小鼠共20只，对照组和试验组各10只。对照组不予处理，试验组隔日局部给予浓度为3.5％的阿法骨化醇外用制剂(实施例1)，共给药2周。
(3)对小鼠背部UVB照射区域进行皮肤损伤状况评分(评分细则见表3)，结果如表4所示：
表3小鼠背部UVB照射区域皮肤损伤状况评分标准
表4阿法骨化醇对光损伤小鼠背部皮肤损伤状况评分的影响
由表4可知，阿法骨化醇治疗3次后可以显著改善皮肤光损伤情况，显著减轻红斑、溃烂、褶皱、脱屑等损伤状态。
(4)将小鼠处死后取材，进行HE染色显示，如图1(a-c)所示：正常小鼠角质层完整细致(图1a)；对照组小鼠表皮中角质层出现一定程度脱落、部分真皮层出现空洞状态及纤维化状态(图1b)；与之相比，实验组极大改善了皮肤状态，角质层开始复原，角质层下方表皮和真皮结构排列完整(图1c)。
通过上述的实验结果说明，阿法骨化醇可提高成纤维细胞的增殖活性；还可抑制MMP-1和MMP-3的表达，减少细胞外基质的降解；并且可以显著减轻皮肤光损伤症状；可用于制备干预皮肤光损伤的外用药品，具有广阔的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
