光动力联合药物的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及制备治疗包虫病药品技术领域，是一种光动力联合药物的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
包虫病（Hydatid disease）又称棘球蚴病（Echinococcosis），是棘球绦虫的幼虫寄生于人体而引起的一种人畜共患寄生虫传染病，是一个世界范围的重要公共安全问题。该疾病常见于我国北部、北美、欧洲、俄罗斯等地。其中，我国主要流行在西北五省及内蒙、西藏和四川等地区，新疆为高发区。包虫病严重危害人类健康，阻碍畜牧业的发展，因此，如何抑制包虫病保障人民身体健康、促进畜牧业经济发展已成为当今社会的一个重要关注点。
囊型包虫病和泡型包虫病的首选治疗方法是外科手术治疗。但对于不能耐受手术或已经失去手术时机的患者来说，药物治疗则是最佳的手段。治疗包虫病的临床一线用药为苯并咪唑类药物。其中主要包括阿苯达唑和甲苯咪唑。阿苯达唑被世界上公认为是治疗棘球蚴病疗效最好的药物，其使用剂型为口服片剂。但由于该类苯并咪唑药物存在制剂单一，生物利用度差，肝脏分布低且需频繁给药等问题，使得包虫病的临床治疗效果差强人意。由于包虫通常寄生于肝脏，使得肝脏负担增重，解毒作用下降，高剂量多频次的给药大大增加药物的毒副作用。所以提高苯并咪唑类药物生物利用度，加强药物透过包虫囊壁的能力，增加囊内有效浓度是包虫病治疗首要解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种光动力联合药物的组合物及其制备方法和应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决治疗包虫病药物现有存在临床用药效果差、药物的毒副作用大的问题。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种光动力联合药物的组合物，包括光敏剂或/和化学药物，光敏剂为二氢卟吩e6、维替泊芬、吲哚菁绿、卟吩姆钠、5-氨基酮戊酸、替莫泊芬和他拉泊芬中的一种或一种以上，化学药物为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、甲苯咪唑、氟苯达唑、奥芬达唑、青蒿琥脂、骆驼蓬子、汉防己甲素、砂生槐中的一种或一种以上。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
上述光敏剂为二氢卟吩e6、维替泊芬中的一种或一种以上。
上述化学药物为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜中的一种或一种以上。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种光动力联合药物的组合物的制备方法，按照下述方法制备得到：将光敏剂或/和化学药物分别进行环糊精包合、增溶，通过包裹、吸附、配位形成纳米粒后，再使用凝胶进行装载，得到光动力联合药物的组合物。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述光敏剂或/和化学药物通过使用聚山梨酯、吐温、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或一种以上进行增溶。
上述光敏剂或/和化学药物通过使用PLGA-PEG、PLA-PLGA、PEG-PCL、PLGA-PEG-PLGA、F127中的一种或一种以上高分子材料进行包裹。
上述光敏剂或/和化学药物通过使用PLGA-PEG-PLGA、泊洛沙姆、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、明胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维蛋白凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的一种或一种以上进行装载，得到光动力联合药物的组合物。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种光动力联合药物的组合物在制备治疗包虫病药品中的应用。
下面是对上述发明技术方案之三的进一步优化或/和改进：
上述光动力治疗所用光照为具有组织穿透性的600nm至850nm的可见光。
本发明通过光动力增加包虫和包虫囊壁的通透性和化疗药物在包虫和囊壁内的靶标蓄积，达到协同治疗的效果，降低包虫和囊泡对外界药物的抵抗作用，提高抗包虫药物的疗效，且可以大大降低给药剂量和药物毒副作用，在制备治疗包虫病药品的应用中具有极好的前景。
附图说明
附图1为本发明实施例11原头蚴随时间增加摄取光敏剂Ce6的荧光强度图。
附图2为本发明实施例12单独使用不同浓度光敏剂进行光动力治疗处理后原头蚴的生存情况图。
附图3为本发明实施例13单独使用阿苯达唑纳米粒处理原头蚴，以及使用10 μg/mL Ce6进行光动力治疗处理原头蚴后再给予阿苯达唑纳米粒，原头蚴的生存情况图。
附图4为本发明实施例14光动力治疗后原头蚴的光学成像图。
附图5为本发明实施例15原头蚴在不同浓度光动力治疗后虫体内部产生活性氧的情况图。
附图6为本发明实施例16包虫囊泡在接收不同处理后的光学成像图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：该光动力联合药物的组合物，包括光敏剂或/和化学药物，光敏剂为二氢卟吩e6、维替泊芬、吲哚菁绿、卟吩姆钠、5-氨基酮戊酸、替莫泊芬和他拉泊芬中的一种或一种以上，化学药物为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜、甲苯咪唑、氟苯达唑、奥芬达唑、青蒿琥脂、骆驼蓬子、汉防己甲素、砂生槐中的一种或一种以上。
本发明中，光动力联合药物的组合物使用时，可采用联合光动力治疗和抗包虫病化学药物，达到高效杀伤包虫虫体的效果。
光动力疗法（Photodynamic therapy，PDT）是用光敏剂和激光治疗疾病的一种新方法。通过用特定波长照射靶标，使聚集在靶组织的光敏药物活化，引发光化学反应破坏靶标。光动力治疗中的光敏剂将能量传递给周围的氧，生成具有杀伤性的活性氧，与附近的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性进而杀伤靶组织。与传统疗法相比，光动力治疗的优势在于能够精确进行有效的治疗，这种疗法的副作用也很小。
针对包虫病治疗中药物难以进入包虫囊壁使得疗效降低的问题，本发明可实现通过光动力联合化学药物，提供一种包虫病治疗的光动力联合药物的组合物，可加强抗包虫病药物透过包虫囊壁的能力，增加囊内有效药物浓度，使用光动力治疗损坏包虫囊壁，增加其内部化学药物的蓄积，从而提高包虫病治疗效果。
本发明中，二氢卟吩e6即为Chlorin e6，简称Ce6，维替泊芬即为Verteporfin，吲哚菁绿即为ICG，卟吩姆钠即为Porfimer sodium，替莫泊芬即为Temoporfin，他拉泊芬即为Talaporfin。
实施例2：作为上述实施例的优化，光敏剂为二氢卟吩e6、维替泊芬中的一种或一种以上。
实施例3：作为上述实施例的优化，化学药物为阿苯达唑、阿苯达唑亚砜中的一种或一种以上。
实施例4：该光动力联合药物的组合物的其制备方法，按照下述方法制备得到：将光敏剂或/和化学药物分别进行环糊精包合、增溶，通过包裹、吸附、配位形成纳米粒后，再使用凝胶进行装载，得到光动力联合药物的组合物，得到光动力联合药物的组合物。
实施例5：作为上述实施例的优化，光敏剂或/和化学药物通过使用聚山梨酯、吐温、聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或一种以上进行增溶。
实施例6：作为上述实施例的优化，光敏剂或/和化学药物通过使用PLGA-PEG、PLA-PLGA、PEG-PCL、PLGA-PEG-PLGA、F127中的一种或一种以上高分子材料进行包裹。
实施例7：作为上述实施例的优化，光敏剂或/和化学药物通过使用DMPC、DOPC、DSPC和DPPC中的一种或一种以上磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000进行包裹。
实施例8：作为上述实施例的优化，光敏剂或/和化学药物通过使用PLGA-PEG-PLGA、泊洛沙姆、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、明胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、纤维蛋白凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的一种或一种以上进行装载。
实施例9：该光动力联合药物的组合物在制备治疗包虫病药品中的应用。
实施例10：作为上述实施例的优化，光动力治疗所用光照为具有组织穿透性的600nm至850nm的可见光。
实施例11：制备1 mg/mL 二氢卟吩e6（Ce6）的PBS溶液。称取10 mg Ce6固体粉末至西林瓶中，加入5 mL PBS溶液，在磁力搅拌下，滴加NaOH溶液（1 M）直至Ce6固体完全溶解，随后用HCl溶液（1 M）调节溶液pH至7.4，将溶液转移至10 mL容量瓶中，使用PBS清洗西林瓶壁的药物，并将清洗液转移至容量瓶中，补充PBS溶液至容量瓶刻度线。
以2000头每孔的浓度将原头蚴培养于24孔板中，每孔加入20 μg/mL Ce6培养液。待原头蚴与Ce6培养液共处理2、4、8和24 h后，除去培养液，用PBS清洗原头蚴3次，每孔加入600 μL 0.1M NaOH溶液，并转移至2 mL离心管中，使用研磨仪将原头蚴研磨45 s。用10000r/min将研磨液离心5 min，取200 μL上清加入96孔板中，使用多功能酶标仪测量其在405nm激发光下660 nm的荧光强度，该荧光强度即为原头蚴摄取Ce6的荧光强度。每个组别设置有3个平行孔。结果如图1所示，由图1可知，原头蚴可以对光敏剂进行大量摄取，且具有时间依赖性。
实施例12：以2000头每孔的浓度将原头蚴培养于24孔板中，分别与5、10、15、20 μg/mL Ce6培养液共培养2 h后，用PBS清洗三次，换用正常培养液，用5 mW/cm2光剂量的635nm可见光对培养板光照30 min，然后培养24 h。每孔各取3次10 μL原头蚴用H&E进行染色，对孔板内原头蚴的存活情况进行统计。每个浓度设置三个平行孔。结果如图2所示，由图2可知，光动力治疗对原头蚴具有一定的杀伤作用，但是效果并不显著。
实施例13：使用薄膜分散法制备阿苯达唑纳米粒。首先将90 mg PLGA-PEG，10 mg阿苯达唑加入到50 mL圆底烧瓶中并溶解在10 mL乙腈中。然后，用旋转蒸发仪在40 ℃除去有机溶剂，形成透明薄膜。将2 mL预热至40 ℃的PBS溶液加入烧瓶中，并在40 ℃下超声处理20 min来分散薄膜形成纳米颗粒。将所得溶液以3500 r/min离心5 min以除去未包封的药物。使用乙腈将纳米粒破乳计算阿苯达唑药物浓度。
以2000头每孔的浓度将原头蚴培养于24孔板中，使用10 μg/mL Ce6培养液对原头蚴进行2 h的共培养，除去培养液，用PBS清洗原头蚴三次，再换用新的培养液，用5 mW/cm2光剂量的635 nm可见光进行30 min光照。然后用0、20、40、60、80、100 μg/mL的阿苯达唑纳米粒对光动力治疗处理后的原头蚴进行24 h的共培养。每孔各取3次10 μL原头蚴用H&E进行染色统计其生存率。为了证明光动力治疗提高阿苯达唑纳米粒杀虫作用，以没有进行光动力治疗的不同浓度阿苯达唑纳米粒处理组作为对照组。每个组别设置三个平行孔。结果如图3所示，由图3可知，光动力治疗联合阿苯达唑可以显著提高阿苯达唑杀伤原头蚴的能力。
实施例14：将10 μg/mL Ce6处理2 h后再进行光照的原头蚴培养24 h，接着将孔板内的原头蚴进行H&E染色，并使用光学显微镜对其进行观察和拍照，与未处理组H&E染色的原头蚴进行对比。结果如图4所示，由图4可知，光动力治疗可以破环原头蚴的囊壁完整性，从而提高阿苯达唑在原头蚴内部的药物浓度。
实施例15：以2000头每孔的浓度将原头蚴培养于24孔板中，使用0、5、10、15、20 μg/mL Ce6培养液与原头蚴共培养1.5 h，然后加入活性氧检测试剂DCFH-DA使每孔浓度为10μM。再培养30 min后将含有Ce6和DCFH-DA的培养液除去，用PBS清洗原头蚴三次，使用5 mW/cm2光剂量的635 nm可见光进行30 min光照。最后用倒置荧光显微镜对孔板内的原头蚴进行蓝光激发，观察其内部活性氧的产生情况。荧光越亮说明产生活性氧越多。结果如图5所示，由图5可知，光动力治疗通过产生活性氧达到破环原头蚴囊壁效果。
实施例16：以200个每孔的浓度将原头蚴囊泡培养于24孔板中，使用不同方法处理囊泡：1. 不做任何处理；2. 100 μg/mL游离阿苯达唑处理；3. 100 μg/mL阿苯达唑纳米粒处理；4. 15 μg/mL Ce6处理2 h后用5 mW/cm2光剂量的635 nm可见光光照30 min（以下简称光动力治疗）；5. 光动力治疗后用100 μg/mL游离阿苯达唑处理；6. 光动力治疗后用100μg/mL阿苯达唑纳米粒处理。在药物处理24 h后使用光学显微镜对囊泡进行拍摄和对比。结果如图6所示，由图6可知，光动力治疗联合抗包虫药物能够引起囊泡的皱缩，具有理想的杀伤包虫的效果。
本发明在制备治疗包虫病药品中的应用中，可实现光动力治疗联合抗包虫病药物治疗，且疗效显著、易控制、副作用小，能够增加药物在靶标的蓄积，使得少量化疗药物即可完全起效。同时通过增加药物生物利用率，可以降低给药剂量和药物毒副作用，提高患者的顺应性。
综上所述，本发明通过光动力治疗增加包虫和包虫囊壁的通透性使化疗药物在包虫和囊壁内的高效蓄积，达到协同治疗的效果，降低包虫和囊泡对外界药物的抵抗作用，提高抗包虫药物的疗效，且可以大大降低给药剂量和药物毒副作用，在制备治疗包虫病药品的应用中具有极好的前景。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
