银杏酸在制备和治疗血管再狭窄疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物药物领域，具体涉及银杏酸在制备和治疗血管再狭窄疾病药物中的应用。
背景技术
血管重构被认为是心血管疾病(如高血压、动脉粥样硬化和再狭窄)的病理生理基础。血管平滑肌细胞(VSMC)是动脉的主要细胞成分，也是血管疾病的关键决定因素。VSMC可以响应各种刺激从而保留从分化表型(可收缩表型)到去分化表型(合成表型)的表型改变。在众多血管病变中，VSMC经历从静止收缩表型到增生和分泌表型的快速可逆变化，其特征是增殖、迁移和细胞外基质(ECM)产生增加。这种合成的VSMC表型与心血管疾病息息相关，包括动脉粥样硬化和高血压。因此，VSMC的过度增殖、迁移在心血管疾病(如高血压)的发展中起着至关重要的作用。虽然临床上抗高血压或心衰药物ACEI(血管紧张素转化酶抑制剂)可逆转血管或心肌肥厚，但是目前没有专门针对血管重构的药物，因此开发或丰富血管重构的药物可有效保护靶器官。
Rho相关的卷曲螺旋型蛋白激酶(Rho-associated,coiled-coil containingprotein kinase,ROCK)是小GTP结合蛋白Rho的效应器。ROCK对各种细胞功能起着重要作用，包括平滑肌收缩﹑肌动蛋白细胞骨架组织﹑细胞粘附和迁移﹑细胞分裂和基因表达。ROCK的激活参与了很多心血管疾病，如高血压和动脉粥样硬化。临床上使用ROCK抑制剂法舒地尔对控制血压，调节动脉硬化性冠状动脉病变以及治疗心衰等方面表现出了令人满意的效果，但是临床可用 ROCK抑制剂种类较少，尤其是选择性ROCK抑制剂。
银杏是营养价值非常丰富的一种植物果实，含有银杏酸、白果酚、还原糖、核黄素等成分，能够滋补人体，具有非常高的食用价值、药用价值和保健价值。银杏外种皮中所含的银杏酸、银杏内酯等物质含量是银杏果或银杏叶所含有的2-3倍。对高血脂、心脑血管疾病的防治非常有效，可用于预防心脑血管疾病。目前对于其有效成份及治疗功效的研究鲜有报道。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题如目前没有专门针对血管重构的药物，临床可用 ROCK抑制剂种类较少，本发明目的为提供银杏酸在制备和治疗血管再狭窄疾病药物中的应用。提供银杏外种皮中银杏酸新的药用用途，具体涉及银杏酸(C17:1)在制备治疗血管再狭窄疾病药物中的应用。所述银杏酸(C17:1)通过抑制ROCK活化，抑制VSMC增殖迁移能力，用于制备治疗高血压行玄关狭窄、动脉粥样硬化斑块和手术或外伤引起血管再狭窄等疾病的药物。
技术方案：
银杏酸在制备和治疗血管再狭窄疾病药物中的应用，所述银杏酸结构式为
进一步的，所述银杏酸制备方法为：银杏外种皮剥离，第一次烘干温度为50℃，烘干时间为50min，水分从降到20％，第二次烘干温度为65℃，烘干时间45min，烘干后的含水率 6-10％，粉碎至颗粒直径在0.1-0.5毫米的细颗粒，80％的EtOH在70℃下回流提取3次，得粗提物，再以96％的EtOH溶解成为饱和溶液，以大孔树脂过滤，依次用20％、40％、80％、95％EtOH洗脱；洗脱液蒸发干燥至含水率为1-2％即得银杏酸C17:1终产品。
进一步的，所述银杏酸体外抑制VSMC增殖和迁移实验步骤为:
第一步：主动脉VSMC增殖迁移模型构建；
第二步：分别用0、20、40、60、100μM银杏酸预处理主动脉VSMC 6h，再用PDGF-BB 刺激细胞增殖迁移，使用EdU检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移。
进一步的，主动脉VSMC保存于实验室，用10ng/ml PDGF-BB，处理24h，构建增殖迁移模型。
进一步的，银杏酸抑制ROCK活性：分别用0、20、40、60、100μM银杏酸处理过表达ROCK的主动脉VSMC，用Westernblot法检测ROCK的活化；ROCK活性通过检测磷酸化的肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1(myosinphosphatase target subunit 1，MYPT1)体现。
进一步的，银杏酸抑制大鼠血管再狭窄：构建大鼠血管再狭窄模型，药物处理组每天给予大鼠10，30，60，100mg/kg灌胃，14天后分离左颈总动脉，用4％多聚甲醛固定，OCT包埋，用冷冻切片机按5μm的厚度进行冷冻切片，然后HE染色观察血管形态。
进一步的，所述EdU检测细胞增殖步骤为：
第一步，EdU标记：用细胞完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液，制备50μM EdU培养基；
第二步：每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；
第三步：PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟；
第四步，细胞固定化：每孔加入200μL细胞固定液室温孵育30分钟，细胞固定液即含4％多聚甲醛的PBS，弃固定液；
第五步：每孔加入200μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；第六步：每孔加入200μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；
第七步：每孔加入200μL渗透剂脱色摇床孵育10分钟，PBS清洗1次，清洗5分钟，渗透剂为0.5％TritonX-100的PBS；
第八步，Apollo染红色：每孔加入200μL的
第九步：加入200μL渗透剂脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂，渗透剂为0.5％TritonX-100的PBS；
第十步：每孔每次加入200μL甲醇清洗1～2次，每次5分钟，然后PBS清洗1次，清洗5分钟；
第十一步，DNA染蓝色：用去离子水按100：1的比例稀释Hoechst33342，制备适量 1×Hoechst33342反应液，避光保存；
第十二步：每孔加入200μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；
第十三步：每孔每次加入200μL PBS清洗1～3次；
第十四步：每孔加入100μL PBS保存待用；
第十五步：图片获取及分析。
进一步的，所述Transwell检测细胞迁移步骤为：
第一步：在超净台上向transwell上室加入200μL预温的基培，室温静置20min后弃去；
第二步：用0.5％BSA的培养液重悬细胞，加入到transwell上室，下层加入10％FBS的培养液，放置到37℃、5％CO2、95％空气细胞培养箱中贴壁生长；
第三步：滴加10μg/mL MMC作用1h；
第四步：按照未加药组；10ng/ml PDGF-BB处理组；20μM GA+10ng/ml PDGF-BB 处理组；40μM GA+10ng/ml PDGF-BB处理组；20μM GA+60ng/ml PDGF-BB处理组；100μM GA+10ng/ml PDGF-BB处理组加入相应药物继续培养；
第五步：取出transwell小室，弃培养基，PBS清洗一遍并弃去，用棉签擦拭上层未迁
移的细胞；
第六步：4％多聚甲醛固定30min后，PBS洗涤三遍；
第七步：结晶紫染液染色15min后，PBS洗涤三遍；
第八步：倒置显微镜下每孔随机选5个视野观察拍照。
进一步的，所述ROCK活性检测具体步骤为：
第一步：制胶用模具洗净放入烘箱烘干备用；
第二步：用移液器从玻璃板的一端灌分离胶，再用双蒸水液封；
第三步：室温下放置40min后，分离胶和水之间形成一条线，即凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干；
第四步：玻璃板间灌入浓缩胶，插入Telfon梳子，室温静置≥30min；
第五步：组装玻璃板，固定电泳槽，内槽倒满电泳液赶槽中气泡，拔出Telfon梳子，按所需蛋白量上样，外槽电泳液加至一半处；
第六步，跑电泳：先以恒压80V，当跑至分离胶处以恒压100V直至分离胶底部，关闭电源；
第七步：提前准备好海绵、滤纸、NC膜浸泡在缓冲液中，4℃冰箱预冷；
第八步，转膜：切取分离胶，以白板-海绵-滤纸-NC膜-胶-滤纸-海绵-黑板的顺序组装好，装入槽中，260mA，转膜90min，全程冰浴，转膜结束切取相应膜条带；
第九步，封闭：提前准备好5％脱脂牛奶，将膜置于其中，室温封闭2h。封闭结束用1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十步，一抗孵育：将蛋白条带放入对应稀释的MYPT-1和phosphor-MYPT-1一抗液中，4℃摇床上孵育过夜，结束后，1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十一步，二抗孵育：1％脱脂牛奶稀释二抗，将膜置于其中，室温摇床孵育2h，结束后，1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十二步，显影：显影液浸润膜，BIO-RAD扫描仪中显影。
进一步的，所述银杏酸抑制大鼠血管再狭窄实验具体步骤为：
第一步，血管再狭窄模型构建，手术器材：2F Forgaty球囊导管，弯盘，2mL无菌注射器，剃毛器，手术刀，组织镊，眼科镊，止血钳，微型拉钩，动脉夹，三角缝针，持针器，7号缝合丝线，生理盐水，无菌棉球，无菌纱布；
第二步，手术方法：使用4％戊巴比妥钠溶液以1mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剃毛器于手术部位剃毛，颈部皮肤使用2％碘酊消毒，75％酒精脱碘，颈部正中做约1-1.5cm 切口，分离左侧颈总动脉约1cm，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端血管，靠近远心端结扎处剪一小口，逆行导入2F球囊导管至主动脉弓，冲盈球囊，回拉至接近切口处，抽空球囊内气体，重复进行3次，达到损伤目的，撤出球囊导管，结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤；
第三步，标本获取：造模14天后，麻醉实验动物，分离左侧颈总动脉，每只截取0.9-1.1cm颈动脉损伤段，使用预冷的生理盐水清洗血管，保存在-80℃冰箱中；
第四步，HE染色：冰冻切片用苏木素染5min，双蒸水清洗1min，盐酸分化30s，伊红染色液染色2min，切片用乙醇脱水，再用二甲苯透明切片，显微镜观察拍照。
有益效果：
1、提供银杏外种皮中银杏酸新的药用用途，具体涉及银杏酸(C17:1)在制备治疗血管再狭窄疾病药物中的应用。所述银杏酸(C17:1)通过抑制ROCK活化，抑制VSMC增殖迁移能力，用于制备治疗高血压行玄关狭窄、动脉粥样硬化斑块和手术或外伤引起血管再狭窄等疾病的药物。
2、60、100μM银杏酸(GA)显著抑制VSMC增殖。
3、60、100μM银杏酸(GA)显著抑制VSMC迁移。
4、40、60、100μM银杏酸(GA)能够显著抑制MYPT1磷酸化即ROCK活化。
附图说明
图1为银杏酸体外抑制VSMC增殖和迁移实验抑制VSMC增殖图；
图2为银杏酸体外抑制VSMC增殖和迁移实验抑制VSMC迁移图；
图3为银杏酸抑制ROCK活性图；
图4为银杏酸抑制大鼠血管再狭窄图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1
银杏酸在制备和治疗血管再狭窄疾病药物中的应用，所述银杏酸结构式为
述银杏酸制备方法为：银杏外种皮剥离，第一次烘干温度为50℃，烘干时间为50min，水分从降到20％，第二次烘干温度为65℃，烘干时间45min，烘干后的含水率6-10％，粉碎至颗粒直径在0.1-0.5毫米的细颗粒，80％的EtOH在70℃下回流提取3次，得粗提物，再以96％的EtOH溶解成为饱和溶液，以大孔树脂过滤，依次用20％、40％、80％、95％EtOH 洗脱；洗脱液蒸发干燥至含水率为1-2％即得银杏酸C17:1终产品。
所述银杏酸体外抑制VSMC增殖和迁移实验步骤为:
第一步：主动脉VSMC增殖迁移模型构建，主动脉VSMC保存于本实验室，用10ng/mlPDGF-BB，处理24h，构建增殖迁移模型；
第二步：分别用0、20、40、60、100μM银杏酸预处理主动脉VSMC 6h，再用PDGF-BB 刺激细胞增殖迁移，使用EdU检测细胞增殖，Transwell检测细胞迁移。
所述EdU检测细胞增殖步骤为：
第一步，EdU标记：用细胞完全培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备50μM EdU培养基(现配现用)；
第二步：每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；
第三步：PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。清洗目的是将未掺入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度；
第四步，细胞固定化：每孔加入200μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；
第五步：每孔加入200μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
第六步：每孔加入200μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；
第七步：每孔加入200μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟；
第八步，Apollo染色(红色)：每孔加入200μL的
第九步：加入200μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，弃渗透剂；
第十步：每孔每次加入200μL甲醇清洗1～2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟；
第十一步，DNA染色(蓝色)：用去离子水按100：1的比例稀释Hoechst33342，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；
第十二步：每孔加入200μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；
第十三步：每孔每次加入200μL PBS清洗1～3次；
第十四步：每孔加入100μL PBS保存待用；
第十五步：图片获取及分析。
如图1所示，60、100μM银杏酸(GA)显著抑制VSMC增殖。
所述
所述Transwell检测细胞迁移步骤为：
第一步：提前在超净台上向transwell上室加入200μL预温的基培，室温静置20min后弃去；
第二步：用0.5％BSA的培养液重悬细胞，加入到transwell上室，下层加入10％FBS的培养液(注意下层培养液和小室间不能存在气泡)，放置到37℃、5％CO2、95％空气细胞培养箱中贴壁生长；
第三步：滴加10μg/mL MMC作用1h去除细胞增殖对本实验的影响；
第四步：按照未加药组；10ng/ml PDGF-BB处理组；20μM GA+10ng/ml PDGF-BB 处理组；40μM GA+10ng/ml PDGF-BB处理组；20μM GA+60ng/ml PDGF-BB处理组； 100μM GA+10ng/ml PDGF-BB处理组加入相应药物继续培养；
第五步：取出transwell小室，弃培养基，PBS清洗一遍并弃去，用棉签轻轻擦拭上层未迁移的细胞；
第六步：4％多聚甲醛固定30min后，PBS洗涤三遍；
第七步：结晶紫染液染色15min后，PBS洗涤三遍；
第八步：倒置显微镜下每孔随机选5个视野观察拍照。
如图2所示，60、100μM银杏酸(GA)显著抑制VSMC迁移。
银杏酸抑制ROCK活性：分别用0、20、40、60、100μM银杏酸处理过表达ROCK的主动脉VSMC，用Westernblot法检测ROCK的活化；ROCK活性通过检测磷酸化的肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位1(myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1)体现，ROCK活性检测具体步骤为：
第一步：制胶用模具洗净放入烘箱烘干备用；
第二步：按说明书配置好分离胶，灌胶(用移液器从玻璃板的一端加入)，再用双蒸水缓慢液封，防止气泡进入；
第三步：室温下放置40min后，分离胶和水之间形成一条线，即凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干；
第四步：配置好浓缩胶，灌入玻璃板间，迅速插入Telfon梳子，注意不能产生气泡，室温静置至少30min；
第五步：组装玻璃板，固定电泳槽，内槽倒满电泳液赶槽中气泡，拔出Telfon梳子，按所需蛋白量缓慢上样，外槽电泳液加至一半处；
第六步，跑电泳：先以恒压80V，当跑至分离胶处以恒压100V直至分离胶底部，关闭电源；
第七步：提前准备好海绵、滤纸、NC膜浸泡在缓冲液中，4℃冰箱预冷；
第八步，转膜：按照要求切取相应分子量的分离胶，以白板-海绵-滤纸-NC膜-胶-滤纸-海绵-黑板的顺序组装好，装入槽中，260mA，转膜90min，全程冰浴，转膜结束切取相应膜条带；
第九步，封闭：提前准备好5％脱脂牛奶，将膜置于其中，室温封闭2h。封闭结束用1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十步，一抗孵育：将蛋白条带放入对应稀释的MYPT-1和phosphor-MYPT-1一抗液中，4℃摇床上孵育过夜，结束后，1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十一步，二抗孵育：1％脱脂牛奶稀释二抗，将膜置于其中，室温摇床孵育2h，结束后，1×TBST洗膜三遍，每遍5min；
第十二步，显影：显影液浸润膜，BIO-RAD扫描仪中显影。
如图3所示，40、60、100μM银杏酸(GA)能够显著抑制MYPT1磷酸化即ROCK 活化。
银杏酸抑制大鼠血管再狭窄：构建大鼠血管再狭窄模型，药物处理组每天给予大鼠10， 30，60，100mg/kg灌胃，14天后分离左颈总动脉，用4％多聚甲醛固定。OCT包埋，用冷冻切片机按5μm的厚度进行冷冻切片，然后HE染色观察血管形态。具体步骤为：
第一步，血管再狭窄模型构建，手术器材：2F Forgaty球囊导管，弯盘，2mL无菌注射器，剃毛器，手术刀，组织镊，眼科镊，止血钳，微型拉钩，动脉夹，三角缝针，持针器，7号缝合丝线，生理盐水，无菌棉球，无菌纱布；
第二步，手术方法：使用4％戊巴比妥钠溶液以1mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剃毛器于手术部位剃毛，颈部皮肤使用2％碘酊消毒，75％酒精脱碘，颈部正中做约1-1.5cm 切口，分离左侧颈总动脉约1cm，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端血管，靠近远心端结扎处剪一小口，逆行导入2F球囊导管至主动脉弓，冲盈球囊，缓慢回拉至接近切口处，抽空球囊内气体，重复进行3次，达到损伤目的。慢慢撤出球囊导管，结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤；
第三步，标本获取：造模14天后，麻醉实验动物，迅速分离左侧颈总动脉，每只截取1cm左右颈动脉损伤段，使用预冷的生理盐水清洗血管，保存在-80℃冰箱中；
第四步，HE染色：冰冻切片用苏木素染5min，双蒸水清洗1min，盐酸分化30s，伊红染色液染色2min。切片用乙醇脱水，再用二甲苯透明切片，显微镜观察拍照。
如图4所示，60，100mg/kg银杏酸(GA)灌胃处理可显著抑制血管内膜增厚及狭窄。
