淫羊藿药材提取物及其在预防或治疗冠状病毒中的应用
技术领域
本发明涉及中药材的应用领域，尤其涉及一种淫羊藿药材提取物及其在预防或治疗冠状病毒中的应用。
背景技术
病毒是多种流行性疾病的主要发病因素，在人类历史上已经引发了多次大流行性的疾病，例如西班牙大流感、疯牛病、非典型性肺炎、主要在家禽之间传播的禽流感、中东呼吸综合征以及在全球爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。其中，COVID-19目前尚无特效药，西医抗新冠病毒药物的安全性和有效性均在考察和试验中。
中医药具有五千多年的历史，通过几千年与疫病的斗争，已经积累了丰富的经验。新型冠状病毒肺炎爆发当前，实施临床救治和基础研究同步，药物和疫苗并重，中医西医协作，优势互补；全疗程、全方位发挥中医药作用是极佳的医疗方案。目前中国多地用中医药治疗新型冠状病毒感染获得了较高的临床治愈率，治疗经济性较好。“上工治未病，中工治欲病，下工治已病”，用中医药进行疾病的预防更是应高度重视的研究领域。
冠状病毒呈球形，表面有突起，基因组为单链RNA，其基因组编码棘突蛋白(Spikeprotein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)、膜蛋白(Membrane protein，M)和核蛋白(Nuceloprotein，N)。其中，S蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白，与病毒的传染能力密切相关，包含两个亚基，S1和S2。S1包含受体结合域(RBD)，负责细胞识别受体，S2包含膜融合过程中的必需元件。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节，常被作为冠状病毒诊断的检测工具。ACE2全称为血管紧张素转化酶2，是人体内一种参与血压调节的蛋白，同时与冠状病毒侵染人体细胞有关，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在。NL63-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2等病毒通过S蛋白中的RBD区域与细胞表面受体ACE2结合附着于宿主细胞，然后被酸依赖的蛋白酶进行两次切割，随后融合肽插入宿主细胞膜并与之融合，将核酸分子释放进入胞内，完成侵染过程。因此，S蛋白与受体蛋白相互作用的强弱是决定冠状病毒感染宿主能力强弱的主要因素。
本发明将中医药技术与现代精准医学技术相结合，针对新冠病毒特点，研发出新的用于防治冠状病毒、特别是新型冠状病毒的中药产品，加快对中药方剂对新冠病毒及其它病毒的疗效评价，对疾病的早期预防、减少病毒感染危害、保障人民身体健康具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种淫羊藿药材提取物，用于结合冠状病毒的S蛋白受体结合区域或人受体蛋白ACE2，有效抑制病毒进入细胞内导致的感染，抑制病毒核酸的复制，阻止已感染病毒的扩增；对人体无毒副作用，可用于日常或医用提高身体免疫力、防治冠状病毒。
本发明的目的之二在于提供一种淫羊藿药材提取物在制备预防或治疗冠状病毒产品中的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种淫羊藿药材提取物，包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素中的任意一种或多种；
所述淫羊藿药材提取物用于结合冠状病毒的S蛋白受体结合区域或人受体蛋白ACE2。
优选地，所述淫羊藿药材提取物，包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素的组合。
进一步地，所述的淫羊藿药材提取物，包括按重量比计的如下组分：朝藿定A 0.3-0.8份、朝藿定B 0.3-0.8份、朝藿定C 0.3-0.8份、淫羊藿苷2.3-2.8份、淫羊藿次苷-Ⅱ1.5-2.5份、淫羊藿次苷-Ⅰ1.5-2.5份、淫羊藿素1.5-2.5份。
优选地，所述淫羊藿药材提取物，包括按重量比计的如下组分：朝藿定A 0.5份、朝藿定B 0.5份、朝藿定C 0.5份、淫羊藿苷2.5份、淫羊藿次苷-Ⅱ2份、淫羊藿次苷-Ⅰ2份、淫羊藿素2份。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种淫羊藿药材提取物在制备预防或治疗冠状病毒产品中的应用。
进一步地，所述产品包括保健食品、消杀产品、中药复方制剂。
所述产品的剂型为口服剂型或非肠道给药剂型。
所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、袋泡剂中的任一种。
进一步地，所述冠状病毒包括NL63-CoV、MERS、SARS-CoV、SARS-CoV-2。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明淫羊藿药材的提取物具有与冠状病毒S蛋白或人受体蛋白ACE2结合的性能，可以抑制冠状病毒S蛋白受体结合区域(RBD)(以下检测S-RBD蛋白)与人受体蛋白ACE2结合，有效抑制病毒进入细胞内导致的感染，达到预防冠状病毒感染的目的。同时，淫羊藿药材提取物也能抑制病毒核酸的复制，阻止已感染病毒的扩增，对已感染病毒的细胞也起到较好的抗病毒作用。本发明研究了淫羊藿药材的主要药效物质与冠状病毒的作用机理，为中药材在抗病毒领域中的应用提供了理论基础，为目前流行的COVID-19优化临床方案和选择用药提供科学依据，并为开展中药方剂高效活性物质研究，以及药物筛选、临床用药乃至新药研发提供技术理论支撑。
2、本申请的淫羊藿药材提取物中的每一种成分提纯后单独作用即具有较好的防治冠状病毒感染的功效，将各成分进行组合后还具有协同增效的作用，防治效果更明显，疗效确切、机理明确。因此，可将本发明淫羊藿药材提取物的各组分提纯后单独使用，或按照本发明配方组合后使用，也可将含有本发明组分的中药材淫羊藿药材经炮制等处理后直接使用，用于日常或医用提高身体免疫力，预防或治疗冠状病毒感染及感染带来的其他症状，实现冠状病毒的早期预防，减少病毒感染带来的危害，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为朝藿定A与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图2为朝藿定B与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图3为朝藿定C与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图4为淫羊藿苷与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图5为淫羊藿次苷-Ⅱ与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图6为淫羊藿次苷-Ⅰ与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图7为淫羊藿素与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图；
图8为朝藿定A与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图9为朝藿定B与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图10为朝藿定C与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图11为淫羊藿苷与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图12为淫羊藿次苷-Ⅱ与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图13为淫羊藿次苷-Ⅰ与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图14为淫羊藿素与人受体蛋白ACE2结合的传感图；
图15为实施例3淫羊藿药材提取物和人受体蛋白ACE2竞争性结合SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白的传感图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种淫羊藿药材提取物，包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素中的任意一种或多种；
淫羊藿药材提取物的上述成分均可用于结合冠状病毒的S蛋白受体结合区域或人受体蛋白ACE2。
作为进一步地优选方案，淫羊藿药材提取物包括朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素的组合。进一步地，包括按重量比计的如下组分：朝藿定A 0.3-0.8份、朝藿定B 0.3-0.8份、朝藿定C 0.3-0.8份、淫羊藿苷2.3-2.8份、淫羊藿次苷-Ⅱ1.5-2.5份、淫羊藿次苷-Ⅰ1.5-2.5份、淫羊藿素1.5-2.5份。
一种淫羊藿药材提取物在制备预防或治疗冠状病毒产品中的应用。产品对人体无毒副作用，可以达到冠状病毒感染的日常或医用防治目的，在医药和食品领域均具有良好的应用前景。这里的冠状病毒包括NL63-CoV、MERS、SARS-CoV、SARS-CoV-2。
产品包括保健食品、消杀产品、中药复方制剂，按药剂学方法，可以将本发明的产品中加入常规辅料按照常规方法制备成多种临床剂型，包括口服剂型或非肠道给药的剂型，其中口服剂型可以为胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液或袋泡剂中的任意一种。
也可向本发明的药食两用中药制剂中加入常规的保健食品赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫昧剂、防腐剂、着色剂等。
本发明淫羊藿药材提取物成分是通过表面等离子共振技术(SPR)筛选出来的。通过快速制备病毒S-RBD蛋白和ACE2两种蛋白，模拟冠状病毒入侵人体呼吸道细胞的分子机理过程，实现高效筛选具有冠状病毒防治功效的中药方剂和中药中的稀有活性成分。然后通过运用可靠的评价方式，以SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞株作为实验模型，证实淫羊藿药材提取物的成分在体外细胞模型中存在一定的抑制病毒进入细胞内部及病毒的核酸复制的能力，进而为得到疗效确切、机理明确的防治SARS-CoV-2病毒感染导致的疾病的中药方剂或药物提供基础。
以下描述的各实施例所用的淫羊藿药材提取物、朝藿定A溶液、朝藿定B溶液、朝藿定C溶液、淫羊藿苷溶液、淫羊藿次苷-Ⅱ溶液、淫羊藿次苷-Ⅰ溶液、淫羊藿素溶液，可以通过经本领域常规方法从淫羊藿药材中提取、纯化得到的成分配制而成，也可以通过市售的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素的标准品配制而成。
实施例1
淫羊藿药材提取物的组分与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白的作用分析
(1)SPR芯片表面预处理
利用共价结合将SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白偶联在酯化的芯片表面。选择氨基共价偶联，具体包括以下步骤：
第一步，芯片活化：pH 4.5-5条件下使用交联剂EDC/NHS使芯片表面酯化；
第二步，配体偶联：将蛋白纯度在90％以上的SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白偶联到芯片表面；
第三步，封闭：用1M pH 8.5乙醇胺盐酸盐封闭芯片上多余的有活性的羧基。
对照表面的设计：SPR芯片分1、2、3、4四个Flow Cell通道，一般1、2通道配对使用(1通道作为参比)，3、4通道配对使用(3通道作为参比)，参比通道对照表面可设计成空白表面、活化-封闭无配体固定的表面或偶联了伪装配体的表面。本实施例的参比通道对照表面选择活化-封闭无配体固定的方式来做削减对照，当对进样过程进行分析时，对照表面的削减可用来消除因样品溶解缓冲液与仪器运行缓冲液成分不同所造成的容积差及一些非特异性结合信号。
(2)进样
用运行缓冲液(50mM磷酸盐，100mM氯化钠，0.01％Tween-20，pH 7.4)分别稀释朝藿定A溶液、朝藿定B溶液、朝藿定C溶液、淫羊藿苷溶液、淫羊藿次苷-Ⅱ溶液、淫羊藿次苷-Ⅰ溶液、淫羊藿素溶液，至浓度分别为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM，然后进行进样。进样时间为1.5min，进样流速30μl/min，蛋白解离时间为1min。
(3)芯片再生
将芯片上的残留蛋白用再生缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.01％Tween 20，pH 7.4))洗脱下来，时间为60s，流速设为30μl/min。
(4)数据分析
采用Biacore T200评价软件(Version 3.1)分析生成传感图，如图1-7所示。
图1-7依次为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的传感图，图1-7中，曲线对应的样本浓度自上至下依次为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM。
通过全局拟合，即采用相同的动力学参数对不同分析物浓度产生的SPR响应曲线进行同步拟合，可以获得更加准确的拟合结果。将数据用分析软件进行拟合处理，计算出淫羊藿药材提取物中的上述七种成分与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白相互作用的亲和力常数KD。其中，朝藿定A与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为2.69×10-6mol/L；朝藿定B与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为2.036×10-6mol/L；朝藿定C与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为2.874×10-6mol/L；淫羊藿苷与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为1.157×10-6mol/L；淫羊藿次苷-Ⅱ与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为2.553×10-6mol/L；淫羊藿次苷-Ⅰ与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的KD值为2.31×10-5mol/L；淫羊藿素与SARS-CoV-2病毒S蛋白作用的KD值为1.055×10-6mol/L。上述七种成分与SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白作用的亲和力自大至小依次是淫羊藿素、淫羊藿苷、朝藿定B、淫羊藿次苷-Ⅱ、朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿次苷-Ⅰ。
根据SPR技术得到的传感图和KD值，本发明中药材淫羊藿药材提取物中的七种成分单独作用时，具有和SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的能力，因而具有防治冠状病毒感染的作用，能用来制备抗病毒产品、消杀产品或者保健食品，在医药和食品领域均具有良好的应用前景。
实施例2
淫羊藿药材提取物的组分与人受体蛋白ACE2的作用分析
除SPR芯片表面预处理步骤外，其余步骤与实施例1相同，此处不再赘述。
本实施例的SPR芯片表面预处理包括：
利用共价结合将人受体蛋白ACE2偶联在酯化的芯片表面。选择氨基共价偶联，具体包括以下步骤：
第一步，芯片活化：pH 4.5-5条件下使用交联剂EDC/NHS使芯片表面酯化；
第二步，配体偶联：将蛋白纯度在90％以上的人受体蛋白ACE2偶联到芯片表面；
第三步，封闭：用1M pH 8.5乙醇胺盐酸盐封闭芯片上多余的有活性的羧基。
对照表面的设计方法与实施例1相同，此处不再赘述。
本实施例经Biacore T200评价软件(Version 3.1)分析生成的传感图如图8-14所示。图8-14依次为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅱ、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿素与人受体蛋白ACE2结合的传感图，其中，图中曲线对应的样本浓度自上至下依次为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM。
通过全局拟合，即采用相同的动力学参数对不同分析物浓度产生的SPR响应曲线进行同步拟合，可以获得更加准确的拟合结果。将数据用分析软件进行拟合处理，计算出六种中药材成分与人受体蛋白ACE2相互作用的亲和力常数KD：朝藿定A与人受体蛋白ACE2作用的KD值为1.17×10-6mol/L；朝藿定B与人受体蛋白ACE2作用的KD值为4.783×10-6mol/L；朝藿定C与人受体蛋白ACE2作用的KD值为2.484×10-6mol/L；淫羊藿苷与人受体蛋白ACE2作用的KD值为1.08×10-5mol/L；淫羊藿次苷-Ⅱ与人受体蛋白ACE2作用的KD值为1.563×10-4mol/L；淫羊藿次苷-Ⅰ与人受体蛋白ACE2作用的KD值为8.27×10-5mol/L；淫羊藿素与人受体蛋白ACE2作用的KD值为3.746×10-6mol/L。即：上述七种成分与人受体蛋白ACE2作用的亲和力自大至小依次是朝藿定A、朝藿定C、淫羊藿素、朝藿定B、淫羊藿苷、淫羊藿次苷-Ⅰ、淫羊藿次苷-Ⅱ。
根据SPR技术得到的传感图和KD值，本发明中药材淫羊藿药材提取物中的七种成分单独作用时，具有和人受体蛋白ACE2结合的能力，因而具有防治冠状病毒感染的作用，能用来制备抗病毒产品、消杀产品或者保健食品。
实施例3
淫羊藿药材提取物、人受体ACE2蛋白竞争性结合SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白的作用分析
(1)SPR芯片表面预处理，与实施例1相同，此处不再赘述。
(2)进样
一种淫羊藿药材提取物，包括按重量比计的如下组分：朝藿定A0.5份、朝藿定B0.5份、朝藿定C 0.5份、淫羊藿苷2.5份、淫羊藿次苷-Ⅱ2份、淫羊藿次苷-Ⅰ2份、淫羊藿素2份。并用本领域常规方法检测提取物中上述组分的总浓度。
用运行缓冲液(50mM磷酸盐，100mM氯化钠，0.01％Tween-20，pH 7.4)稀释本实施例的淫羊藿药材提取物至上述组分的总浓度分别为50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.78125μM，将稀释后的淫羊藿药材提取物与终浓度为4.75μg/ml的ACE2蛋白混合，得到进样样本；同时，设置仅含有终浓度4.75μg/ml的ACE2蛋白溶液作为对照样本。然后进行进样，设置进样时间为200s，进样流速30μl/min，蛋白解离时间为3min。
(3)芯片再生
将芯片上的残留蛋白用再生缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.01％Tween 20，pH 7.4))洗脱下来，时间为100s，流速设为30μl/min。
(4)数据分析
采用Biacore T200评价软件(Version 3.1)分析生成传感图，如图15所示，图中，曲线自上至下依次对应的为对照样本、25μM进样样本、50μM进样样本。
通过全局拟合，即采用相同的动力学参数对不同分析物浓度产生的SPR响应曲线进行同步拟合，可以获得更加准确的拟合结果。本实施例的中药材淫羊藿药材提取物具有抑制人受体ACE2蛋白和SARS-CoV-2病毒S-RBD蛋白结合的作用，经计算淫羊藿药材提取物中上述组分的总浓度为50μM时，对上述S-RBD蛋白与ACE2结合的抑制率达66.01％。
实施例4
淫羊藿药材提取物对SARS-CoV-2病毒的抑制作用分析
(1)淫羊藿药材提取物，分为A-H共8组，分别为：
A组：朝藿定A溶液；
B组：朝藿定B溶液；
C组：朝藿定C溶液；
D组：淫羊藿苷溶液；
E组：淫羊藿次苷-Ⅱ溶液；
F组：淫羊藿次苷-Ⅰ溶液；
G组：淫羊藿素溶液；
H组：组合物溶液，包括按重量比计的朝藿定A0.5份、朝藿定B 0.5份、朝藿定C 0.5份、淫羊藿苷2.5份、淫羊藿次苷-Ⅱ2份、淫羊藿次苷-Ⅰ2份、淫羊藿素2份。
将A-H共8组的提取液中药效成分的浓度稀释至50ppm-500ppm。
(2)将Vero E6细胞按每孔2×105种植于96孔细胞培养板，待细胞贴壁生长均匀后，换成2％FBS细胞培养基。
(3)向步骤(1)配制的不同浓度的A-H组溶液中分别加入SARS-CoV-2病毒孵育2h，然后加入到步骤(2)得到的Vero E6细胞中进行感染、培养；
对照组为：向Vero E6细胞液中加入SARS-CoV-2病毒进行感染、培养。
(4)48h后，收集细胞培养上清液，检测上清液的抗原量，以对照组的抗原量为100％，计算各组清除病毒量50％(EC50)所需的提取物浓度，结果如表1所示。
实施例5
淫羊藿药材提取物提升细胞免疫SARS-CoV-2病毒能力的作用分析
(1)淫羊藿药材提取物，分为A-H共8组，与实施例4相同。
(2)将Vero E6细胞按每孔2×105种植于96孔细胞培养板，待细胞贴壁生长均匀后，换成2％FBS细胞培养基。
(3)分别向细胞培养液中加入400ppm的A-H组溶液，预处理细胞2h后，再加入SARS-CoV-2病毒进行感染、培养；
对照组为：向细胞培养液中直接加入SARS-CoV-2病毒进行感染、培养，不进行预处理。
(4)48h后，收集细胞培养上清，检测上清液抗原量，以对照组的抗原量为100％，计算经不同组溶液处理后的细胞上清液中的抗原量，得到抑制率。如表1所示。
实施例6
淫羊藿药材提取物对已感染SARS-CoV-2病毒的细胞的作用
(1)淫羊藿药材提取物，分为A-H共8组，与实施例4相同。
(2)将Vero E6细胞按每孔2×105种植于96孔细胞培养板，待细胞贴壁生长均匀后，换成2％FBS细胞培养基。
(3)向细胞培养液中加入SARS-CoV-2病毒，孵育1h后，移除培养基上清，得到感染SARS-CoV-2病毒的细胞；向感染SARS-CoV-2病毒的细胞中分别加入400ppm的A-J组提取液，进行孵育；
对照组为：感染SARS-CoV-2病毒的细胞培养液，不加入任何提取液，孵育。
(4)48h后，收集细胞培养上清，检测上清液抗原量，以对照组的抗原量为100％，计算经不同组溶液处理后的细胞上清液中的抗原量，得到抑制率。如表1所示。
表1淫羊藿药材提取物抗SARS-CoV-2病毒的实验结果
由表1可以看出，本发明淫羊藿药材提取物的组分单独作用时均具有较好的抗SARS-CoV-2的效果，各组分单独作用时之间的抑制效果差异不大，但将各组分按照特定比例进行组合后，各组分协同增效，抑制率明显提高，所需浓度也对应下降。因此，本发明的淫羊藿药材提取物能在一定程度上保护细胞免受新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的感染，并对已感染新型冠状病毒的细胞具有一定的抗病毒作用，起到辅助抗病毒及缓解症状的协同作用，是一种理想的新型冠状病毒抑制剂。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。
