一种微生物多糖作为添加剂在制备日用化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及微生物多糖创新应用领域，具体涉及一种微生物多糖在日用化妆品中的应用。
背景技术
多糖是重要的生物活性大分子，与蛋白质、基因并称为生命科学的三大领域,当今受到越来越广泛的关注，早在上个世纪，透明质酸就以其优良的保湿功能成为了国际化妆品界的新宠儿，国内外科学家预言：“今后数十年将是多糖的时代”。多糖按来源分类，可分为真菌多糖、细菌多糖、藻类地衣多糖、高等植物多糖、动物多糖五大类。
随着现代科技的发展与科研的深入，日用化妆品已从洁肤、润肤为目的的基础护肤品向延缓衰老、美化肤色为目的的功效型日用化妆品方向发展。近年来研究发现，多糖具有多方面的药理作用，如抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗缺氧、抗损伤、抗氧化活性、抗炎、增强免疫等作用，使用安全、作用温和、效果显著、无副作用。另外，多糖所链接的大量亲水性羟基使其具有强吸水性、乳化性、高黏度性和成膜性，排他性较低，添加到日化用中可以保证与人体肌肤具有高度亲和性，相比市场上化学合成类化妆品，微生物多糖类日用化妆品具备更为广阔的开发与利用空间。多糖的药理活性和理化性质为其在化妆品中的应用提供了依据，应用于化妆品可以产生保湿、修复受损皮肤、抗炎、延缓衰老、抗氧化等功效。
因此，生物活性微生物多糖作为功效性日用化妆品添加剂在日用化妆品中的应用，是未来的一个研究热点与方向。
发明内容
发明目的：本发明首次发现泛菌多糖在日用化妆品中的添加具有各种良好的功效，提供了一种新型微生物多糖作为添加剂在日用化妆品中的应用。本发明的目的是提供一种可用于日用化妆品原料的功能性微生物多糖，不仅拓宽了微生物多糖的应用领域，同时也补充了日用化妆品原料来源的限制。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种微生物多糖在制备日用化妆品中的应用，其中，所述微生物多糖由骆驼刺泛菌发酵制备得到。所述骆驼刺泛菌其分类学命名为Pantoea alhagi，其是一类植物内生菌，且无致病性。
优选地，所述微生物多糖的分子量为1000Da-2000kDa。
进一步地，申请人发现，微生物多糖分子量的差异对其性能有影响。
具体地，申请人发现，当微生物多糖分子量区间为1000kDa-2000kDa时，表现出比较优异的保湿性能，因此本发明进一步提出了上述微生物多糖作为保湿剂用于制备日用化妆品的应用，当侧重于保湿性能时，所述微生物多糖的分子量区间为1000kDa-2000kDa。
进一步地，申请人发现，当微生物多糖的分子量区间为100kDa-1000kDa时，美白性能突出，因此进一步提出了上述微生物多糖作为美白剂用于制备日用化妆品上的应用，且当侧重于美白性能时，微生物多糖的分子量区间为100kDa-1000kDa。
另外，申请人发现，当微生物多糖的分子量区间为1000Da-100kDa时，抗氧化性能突出，因此提出了上述微生物多糖作为抗氧化剂在制备日用化妆品中的应用，且当侧重于美白性能时，微生物多糖的分子量区间为1000Da-100kDa时。
优选地，所述微生物多糖在日用化妆品中的添加量为0.1％-0.5％(g/g)，即每g日用化妆品中添加0.001-0.005g微生物多糖。
具体地，上述微生物多糖的制备方法如下：
a)发酵制备：其所述发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，其中，碳源浓度为30～50g/L，优选地为35-45g/L；氮源浓度为2～8g/L,优选方案为3～5g/L；无机盐总浓度为0.5～2.5g/L，优选地为1.5～2g/L；氧载体总浓度为0.5～10g/L；发酵过程中，温度为25～32℃，通气强度为0.1～0.8vvm，发酵周期为16～48h，pH为6.5～7.5；
b)提取纯化：将步骤a)收集的发酵液首先进行高温灭菌，优选地，高温灭菌条件为121℃、20min，再用2-3倍体积的乙醇进行沉淀后收集絮状物并进行干燥，干物质经复溶后通过板框过滤机进行过滤除杂，再次用2-3倍体积的乙醇二次沉淀，收集絮状沉淀并干燥获得纯化胞外多糖。
优选地，步骤a)中，发酵结束后发酵液中多糖含量不低于20g/L。
具体地，所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或组合；所述氮源为硫酸铵、玉米浆、豆粕粉，蛋白胨中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2中的任意一种或几种的组合，优选地为1.5～2g/L；所述氧载体为正己烷、正庚烷、正十六烷中的任意一种或几种的组合，优选方案为2.33g/L正己烷，5.36g/L正庚烷，9.06g/L正十六烷。
有益效果：与现有技术相比，本申请具有如下优点：
(1)本发明发现对人体无致病性的植物内生菌骆驼刺泛菌(Pantoea alhagi)可以作为添加剂用于日用化妆品的制备，通过发酵分离提纯其胞外产物，发现其各种优异的生物活性，拓宽了其应用领域；
(2)本发明首次发现泛菌多糖具有很好的保湿、美白、抗氧化的效果，提供了该多糖类在制备化妆品中的应用，不仅拓宽了骆驼刺泛菌胞外产物的应用领域，补充了化妆品保湿、美白、抗氧化的原料，也拓宽了现有微生物多糖的种类。
附图说明
图1为泛菌多糖保湿性能对比图；
图2为泛菌多糖的美白功效对比；
图3为泛菌多糖DPPH清除自由基能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明名做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1微生物多糖的制备。
申请人在先前的研究中成功挖掘到一株对人体无致病性的植物内生菌骆驼刺泛菌，其分类学命名为Pantoea alhagi XK-11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年3月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，藏编号为CGMCC 15526，其是一类植物内生菌，且无致病性。
通过进一步对该骆驼刺泛菌高密度发酵制备胞外多糖，发酵培养基成分包含了碳源、氮源、无机盐和氧载体，其中所述的碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油、淀粉、糖蜜中的一种或组合，碳源浓度为40g/L；所述氮源为硫酸铵、玉米浆、豆粕粉，蛋白胨中的一种或组合，氮源浓度为6g/L；所述无机盐为K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2中的一种或组合，无机盐总浓度为1.3g/L；所述氧载体为正己烷、正庚烷、正十六烷中的一种或组合，氧载体总浓度为2.6g/L；发酵过程中，温度为30℃，通气强度为0.6vvm，发酵周期为36h，pH为6.8。
发酵结束后将收集的发酵液经提取纯化后获得纯化胞外多糖。所述步骤包含高温灭菌、酒精沉淀、复溶板框除杂、二次沉淀并干燥这一系列步骤。首先将收集的发酵液首先进行高温灭菌(121℃、20min)，再用2-3倍体积的乙醇进行沉淀后收集絮状物并进行干燥，干物质经复溶后通过板框过滤机进行过滤除杂，再次用2-3倍体积的乙醇二次沉淀，收集絮状沉淀并干燥获得纯化胞外多糖。
其中所述多糖的测定方法为HPLC法，色谱柱采用GPC凝胶色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为纯水，分离温度为60℃，流速为1mL/min。
通过上述制备得到的纯化胞外多糖一种中性多糖，其单糖组分包括葡萄糖，半乳糖和甘露糖，单糖组分的比例约为0.48～0.59：0.24～0.33:0.087～0.18，单糖比例并非恒定不变，而是受发酵培养基成分和浓度不同出现轻微波动。
所述单糖组分，通过糖腈乙酸酯法衍生后经GC-MS进行测定。
实施例2不同分子量区间多糖的制备。
不同分子量区间多糖是由酸解法制备得到，具体实施步骤如下：
将上述获得的纯化胞外多糖称重并配制成2％的多糖溶液，加入硫酸溶液调节其pH至3.0后，80℃恒温加热水解，在不同的时间点取样检测确定其分子量区间。
上述检测方法为高效液相色谱检测，色谱柱采用GPC凝胶色谱柱，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为纯水，分离温度为60℃，流速为1mL/min。
水解实验结果见表1。
表1不同水解时间对多糖分子量的影响
实施例3微生物多糖的保湿性能考察。
所述保湿性由以下实验进行考究：
在室温下，分别称取实施例2中所制备的纯化后不同分子量区间的泛菌多糖及干燥至恒重的海藻酸钠、壳聚糖、丙三醇各0.5g分别放入培养皿中,加入0.2g的去离子水,缓慢晃动使样品充分吸收水分,置于装有变色硅胶的干燥器内,放置1、2、3、4、5、6h后称重，按公式(1)保湿率(％)＝(Hn/H0)×100，求出保湿率，式中Hn和H0分别为放置前、后水分质量，结果如图1所示。
由图1可知，在干硅胶环境中，1～6h的保湿顺序为：丙三醇>1000kDa-2000kDa泛菌多糖>壳聚糖>100kDa-1000kDa泛菌多糖>海藻酸钠>1kDa-100kDa泛菌多糖；虽然1000kDa-2000kDa泛菌多糖的保湿率略低于甘油，但是相比较于壳聚糖与海藻酸钠，有明显的保湿优势。
实施例4微生物多糖的美白效果考察。
为考察本发明一种微生物多糖及其在日用化妆品中的应用中多糖的美白功效，我们了解到，在黑色素形成过程中酪氨酸酶是一主要限速酶，该酶活性决定着黑色素的数量。它是一种含铜的金属酶，是由黑素细胞合成的，在黑素产生的过程中饰演了举足轻重的角色。酪氨酸酶活性增加，黑素细胞产生黑素的能力就相应增强；反之相应降低。
酪氨酸酶抑制实验中试剂的配制及样品预处理如下：
PBS磷酸缓冲液:准确称取17.71g十二水磷酸氢二钠至500mL容量瓶中，蒸馏水定容得a溶液；准确称取7.8g二水磷酸二氢钠至500mL容量瓶中，蒸馏水定容得b溶液；分别取a和b溶液92.6和107.4mL配成200mL pH＝6.8的PBS磷酸缓冲液。
L-酪氨酸溶液：准确称取0.05g酪氨酸，先溶于35mL 0.1mol·L-1的盐酸，再加入65mL PBS磷酸缓冲液(pH＝6.8)。
样品液：准确称取实施例2中所制备纯化后的不同分子量区间多糖，将其配置成20、60、100、140、180mg/L的多糖溶液备用。
将上述各溶液进行配比，结果如表2中所示。
表2各溶液配比情况
将A、B、C、D各管按表1各配比加入相应的试剂，A和C在加酶前先放入37℃水浴10min然后加入酶，再将A、B、C、D同时放入37℃水浴。10min后，取各管在475nm处测量吸光度值，分别记为A1、B1、C1和D1(B1和D1调零)，计算酪氨酸酶抑制率(I)。计算公式如下：
I＝(A1-C1)/A1×100％
以酪氨酸酶抑制率为纵坐标，待测样品浓度为横坐标绘制抑制率曲线，结果如图2所示。由图2可知，泛菌多糖(polysaccharide)与维生素C都具有抑制酪氨酸酶功效，其抑制功效随着质量浓度的升高而升高。从图中可以看出，分子量区间为100kDa-1000kDa的泛菌多糖的上升趋势较维生素C更大，具有潜在的酪氨酸酶抑制作用，且在质量浓度大于100mg·L-1时高于维生素C。
同时以抑制率对抑制剂浓度作图，根据抑制曲线求得泛菌多糖和Vc的IC50值。结果显示Vc的IC50值为(152±2.8)mg/L；实施例2制备的分子量区间为100kDa-1000kDa的泛菌多糖的IC50值为(126±3.5)mg/L，对酪氨酸酶的抑制作用与Vc有着近似强度级别。
实施例5微生物多糖的体外抗氧化活性考察。
DPPH法是一种评价天然抗氧化剂抗氧化活性的快速、简便、灵敏、可行的方法，在国内外应用广泛。DPPH清除自由基的机理是在加氢抗氧剂存在下，DPPH还原为DPPH-H，导致紫色褪色，从而抑制氧化反应的传播。
所述实验方法如下所示：
准确称取实施例2中所制备纯化后的不同分子量区间多糖，将其配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的多糖溶液备用，以相同浓度的Vc溶液为对照，取1mL上述溶液，分别加入2mL 0.2mmol/mL DPPH乙醇溶液，混合均匀，在室温避光静置30min，在波长517nm处测定吸光度，以Vc为阳性对照，按公式(2)进行计算。
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100 (2)
式中所述A1：待测样+DPPH乙醇溶液；A2：待测样+无水乙醇；A0：无水乙醇+DPPH乙醇溶液。
实验结果如图3所示，泛菌多糖对DPPH自由基的清除能力随浓度增加而逐渐升高，尤其当泛菌多糖分子量范围为1kDa-100kDa的情况下，当浓度达到1mg/mL时，泛菌多糖的清除率达到79.63％左右，由图上结果可知，泛菌多糖的对DPPH自由基的清除能力随浓度变化较大，相较于维生素C而言，其清除自由基的能力在浓度大于1mg/mL的情况下，其差异逐步缩小。
本发明提供了微生物多糖在日用化妆品中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
