贝特类药物的用途、药物组合物及组合物的用途
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种贝特类药物的用途、药物组合物及组合物的用途。
背景技术
肺癌是原发性支气管肺癌的简称，全球癌症现状报告显示，在男女两性中肺癌是发病率(11.6％)及死亡率(18.4％)占比最高的癌症。肺癌根据病理组织学特征分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lungcarcinoma，SCLC)。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85％，包括腺癌、鳞癌和大细胞癌，其中以腺癌及鳞癌两大亚型最为常见。
目前，肺癌的诊疗模式已经由细胞水平转向以分子水平为主的精准医疗，分子靶向治疗药物已经成为临床晚期非小细胞肺癌治疗的新选择。以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶点的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是治疗非小细胞肺癌的一线药物，如FDA批准的吉非替尼，用于治疗EGFR基因第19外显子缺失或第21外显子突变的转移性非小细胞肺癌。虽然吉非替尼治疗非小细胞肺癌具有较大的优点，但耐药问题仍不可避免。相关研究数据表明，已接受一代EGFR-TKI治疗的初治EGFR基因突变阳性NSCLC患者，平均10个月左右会出现耐药。临床上检测到的吉非替尼耐药的机制有多种，最常见的耐药机制是EGFR T790M二次突变。针对EGFR T790M二次突变开发了三代EGFR-TKIs奥西替尼等，治疗效果显著，安全性较高，但在使用过程中依然会产生EGFR C797S三次突变导致耐药。为了解决耐药问题，临床上采用了EGFR-TKIs联合其他治疗措施，但是联合放化疗及其他抑制剂不良反应较多，如何找到更好的联合用药方式是以后发展的重要方向。
异常的脂质代谢是目前公认的癌细胞的主要特征之一，越来越多的研究表明，胆固醇在癌症的发生发展中起着至关重要的作用，在正常细胞中脂质合成过程处于较低水平，相反在肿瘤细胞中，PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2、HIF-1α、p53和SHH等信号通路被激活，这些通路可以激活胆固醇合成代谢过程中最关键的转录因子SREBP-1，且在一些癌变组织中观察到一些与胆固醇合成代谢相关的基因处于过表达状态，并且与癌症的复发风险和生存率低相关，癌细胞除增加胆固醇合成外，细胞内胆固醇水平还可以被胆固醇摄取和外排调控，在临床试验和体外细胞模型中可以观察到抑制胆固醇代谢的主要途径可以影响胶质母细胞瘤的增殖，因此调控胆固醇代谢途径是有效治疗肿瘤的潜在途径，近些年来研究表明脂质代谢在肿瘤耐药产生过程中起到了相对重要的调控作用，靶向脂质代谢途径可以增加肿瘤对化学药物以及靶向药物的敏感性，如Saber B等研究表明吉西他滨耐药的胰腺癌患者通过数据分析显示其耐药性与脂肪酸从头合成基因FASN密切相关，靶向FASN药物与吉西他滨联用可以增加耐药的胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。有临床回顾性研究结果显示高密度脂蛋白胆固醇与肺腺癌患者EGFR-TKIs的疗效密切相关，高胆固醇水平会影响患者对EGFR-TKIs的敏感性。因此，调节细胞内胆固醇稳态可能成为解决EGFR-TKIs耐药的新的治疗策略。
贝特类药物是PPARα激动剂的代表性药物，目前临床上尚在应用的药物包括非诺贝特、苯扎贝特、氯贝特及吉非罗齐，有研究表明PPARα受体通路与肿瘤发生发展密切相关，PPARα受体激动剂被发现可抑制肺癌、结肠癌、白血病、黑色素瘤及乳腺癌等肿瘤细胞的生长，可能与其抑制炎性反应及干扰癌细胞能量及脂质代谢平衡有关。
发明内容
发明目的：本发明为了解决现有问题，本发明的一个目的在于提出贝特类药物的新用途，以及提出了药物组合物，能够有效治疗肿瘤。本发明的另一目的是提供了该药物组合物的应用。
技术方案：本发明第一方面提供了贝特类药物在增强肿瘤细胞或肿瘤对EGFR-TKIs敏感性或在降低肿瘤细胞或肿瘤对EGFR-TKIs耐药中的用途。
本发明的贝特类药物为过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)激动剂。它通过激活PPARα，在转录水平诱导脂蛋白酯酶表达，促进VLDL/CM/IDL等富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中甘油三酯成分的水解，并减少肝脏中VLDL的合成和分泌，由于VLDL生成减少，且富含甘油三酯的脂蛋白分解代谢加速，能有效降低血浆甘油三酯水平，对肿瘤细胞有抑制作用。
所述贝特类药物为非诺贝特、苯扎贝特、氯贝特、吉非罗齐、环丙贝特以及氯贝丁酯中的一种或多种。
所述EGFR-TKIs为一代EGFR-TKIs，为吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼中的一种或多种。
所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
本发明第二方面提供了贝特类药物在制备降低、延缓或逆转肿瘤对EGFR-TKIs耐药中的用途。
进一步地，所述肿瘤为非小细胞肺癌，所述的EGFR-TKIs为一代EGFR-TKIs，包括吉非替尼。
本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括贝特类药物以及EGFR-TKIs；所述贝特类药物为非诺贝特、苯扎贝特、氯贝特、吉非罗奇、环丙贝特、氯贝丁酯中的一种或多种；所述EGFR-TKIs为吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼中的一种或多种。
所述贝特类药物选自非诺贝特、苯扎贝特、氯贝特、吉非罗齐中的一种或多种；所述EGFR-TKIs为吉非替尼。
本发明第四方面提供了一种上述的药物组合物在治疗肿瘤中的用途。
进一步地，所述药物组合物用于治疗非小细胞肺癌和/或降低肿瘤细胞内胆固醇。
进一步地，所述药物组合物用于治疗逆转或延缓NSCLC一代EGFR-TKIs耐药。
有益效果：(1)本发明利用贝特类药物改善非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药；(2)本发明利用贝特类药物与一代EGFR-TKIs联合用药，逆转或缓解NSCLC一代EGFR-TKIs耐药。
附图说明
图1是NSCLC细胞株对吉非替尼的药物敏感性检测结果；
图2是NSCLC细胞株胞内胆固醇水平检测结果，所有实验独立重复三次，数据采用mean±SD表示，组间采用两两对比t-test检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；
图3是NSCLC细胞株胆固醇外排途径调控因子PPARα、PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达水平检测结果，以GAPDH作为内参；
图4是非诺贝特对PPARα/LXRα/ABCA1信号轴的激动作用，以GAPDH作为内参；
图5为非诺贝特呈剂量依赖性增强吉非替尼药效，数据采用mean±SD表示；
图6是非诺贝特与吉非替尼的协同作用，结果与单独吉非替尼作用相比较采用t-test检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；
图7为苯扎贝特增加NSCLC耐药株对吉非替尼敏感性，数据采用mean±SD表示；
图8是苯扎贝特与吉非替尼的协同作用，结果与单独吉非替尼作用相比较采用t-test检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；
图9为氯贝特增加NSCLC耐药株对吉非替尼敏感性，数据采用mean±SD表示；
图10是氯贝特与吉非替尼的协同作用，结果与单独吉非替尼作用相比较采用t-test检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；
图11为吉非罗齐增加NSCLC耐药株对吉非替尼敏感性，数据采用mean±SD表示；
图12是吉非罗齐与吉非替尼的协同作用，结果与单独吉非替尼作用相比较采用t-test检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。
具体实施方式
一、胆固醇外排途径与NSCLC吉非替尼耐药之间的关系
1.1实验材料
1.1.1实验细胞株
非小细胞肺癌吉非替尼敏感PC-9细胞株；吉非替尼耐药PC-9/GR、H1650、H1975、A549细胞株。
1.2实验试剂
吉非替尼，CCK-8试剂盒，DMEM高糖培养基，胎牛血清，青链霉素混合液，胰蛋白酶，胆固醇测定试剂盒，PPARα抗体，LXRα抗体，ABCA1抗体，GAPDH抗体。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养
PC-9、PC-9/GR、H1650、H1975和A549细胞株培养在含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。
1.3.2CCK-8法检测细胞增殖
待PC-9、PC-9/GR、H1650、H1975和A549细胞密度长到90％时，消化离心收集后，将上清弃掉，加适量培养基使其混匀，进行细胞计数。将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入150μL，细胞的密度为5000-8000个细胞/孔，边缘孔用无菌PBS填充。将接种好的96孔板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满96孔平底板，给以不同的药物处理一定时间。吸弃含药培养基，每孔加入CCK-8溶液，继续孵育4h后，终止培养，在酶标仪450nm处测量各孔的吸光度值。数据统计采用抑制率(％)＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100，其中As＝实验孔吸光度(含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物孔的吸光度)；Ab＝空白孔吸光度(含有培养基和CCK-8孔的吸光度)；Ac＝对照孔吸光度(含有细胞，培养基和CCK-8孔的吸光度)。实验独立重复三次，数据用GraphPad Prism7.0软件作图并进行统计学分析，两两组间比较采用两两对比t-test检验，*P≤0.05具有统计学意义。
1.3.3
1.3.3.1细胞样本收集
将处于对数生长期且生长状态良好的细胞取出，弃去培养基并用PBS冲洗干净，加入200μL含有2μLPMSF和2μLCocktail的RIPA裂解液，将细胞充分刮下后转移进入EP管内冰上裂解10min，后在4℃、12000g的离心机中离心10min，弃沉淀并保存于-80℃超低温冰箱中。待测样品取出80μL加入1×Reaction Bμffer 80μL稀释一倍用于测定胞内胆固醇以及蛋白含量。
1.3.3.2细胞内胆固醇水平测定
(1)将试剂盒中配置好的储备液置于室温平衡0.5h。
(2)300μL Amplex Red试剂工作液包括2μ/mL HRP，2μ/mL胆固醇氧化酶和0.2μ/mL胆固醇酯酶。分别加入75μL Amplex Red储备液，50μL HRP储备液，50μL胆固醇氧化酶储备液和5μL胆固醇酯酶储备液到4.82mL的1×Reaction Buffer中。
(3)用1×Reaction Buffer稀释2mg/mL胆固醇标准品，使其终浓度分别为0、0.4、0.8、2、4、6、8μg/mL，1×Reaction Buffer作为阴性对照。
(4)取96孔荧光酶标板，每孔加入不同浓度胆固醇标准品50μL，1×ReactionBuffer作为阴性对照。加入待测样品稀释液50μL。各孔中加入50μL浓度为300μM AmplexRed试剂工作液，使其成为100μL的反应体系。
(5)在37℃恒温箱内条件下，避光孵育0.5h或者更长时间，使其充分反应，每次孵育时间一致。
(6)荧光酶标仪设置激发波长为550nm及发射波长为590nm，在此条件下，测定每孔的荧光强度。
(7)以胆固醇标准品浓度为横坐标，对应的荧光强度平均值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性方程。
(8)根据待测样本稀释液荧光强度值得平均值，在线性方程中计算出待测样本稀释液胆固醇浓度，从而计算出样品胆固醇浓度。
1.3.3.3 BCA法测定蛋白浓度
(1)蛋白标准品(BSA)配制：将1.2mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品管中(内含30mg BSA)，充分溶解后配成25mg/mL的蛋白标准溶液。取80μL 25mg/mL蛋白标准品，加入920μL蛋白标准配制液配制成2mg/mL蛋白标准品，分装为每管20μL放置于-20℃冰箱保存。
(2)BCA工作液配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制BCA工作液。
(3)将标准品按照0、2.5、5、7.5、10μL加入96孔板中并同时加入PBS 10、7.5、5、2.5、0μL配制成浓度为0、0.5、1、1.5、2mg/mL的标准曲线，加入待测样本5μL和PBS 5μL，并加入200μL的BCA工作液，37℃孵育30min后在A570波长下测定吸光度值。根据标准曲线的线性公式计算待测样本蛋白浓度。
1.3.3.4数据分析
胆固醇含量为胆固醇吸光度值/待测样本总蛋白浓度，实验独立重复三次，数据用GraphPad Prism7.0软件作图并进行统计学分析，两两组间比较采用两两对比t-test检验，*P≤0.05具有统计学意义。
1.3.4 Western Blot分析细胞株中蛋白的表达
(1)按照配比制胶，配制1×电泳缓冲液，1×转膜缓冲液，1×TBS-T，蛋白样本变性后上样10μg，并保证上样体积相同。上样后将仪器调成定压电泳浓缩胶：55v，25min，分离胶：110v，90min，直至溴酚蓝条带达到分离胶底部，结束电泳。
(2)裁剪PVDF膜，放入甲醛中活化1-2min后进行转膜，转膜液需要提前预冷，制作转膜三明治从上到下依次为黑板-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板，排尽气泡，放入转膜槽中，恒压110v转膜105min。
(3)转膜结束后标记膜左上角，放入10％牛奶中封闭2h。
(4)封闭结束后清洗PVDF膜，每次10min共清洗三次，按照marker裁剪不同分子量的条带孵育一抗，4℃冰箱过夜。
(5)次日取出条带清洗，每次10min共清洗三次，孵育二抗，室温1h。
(6)二抗孵育结束后清洗条带，每次10min共清洗三次。
(7)化学发光检测，按TanonTM High sig ECL Western Blotting Substrate曝光液试剂盒说明书操作，用ImageJ软件进行分子量和光密度值分析。
1.4实验结果
1.4.1 NSCLC细胞株对吉非替尼的药物敏感性检测
首先选取了非小细胞肺癌细胞株：PC-9/GR、H1975、H1650、A549、PC-9，CCK-8法检测吉非替尼处理48h的IC50值，分别为27.65±2.02μM、36.61±3.26μM、18.41±3.33μM、13.61±1.55μM和22.79±2.94nM，结果表明PC-9/GR、A549、H1650和H1975对吉非替尼耐药，而PC-9细胞对吉非替尼敏感，结果见图1。
1.4.2 NSCLC细胞株胞内胆固醇水平检测
选择吉非替尼敏感细胞株PC-9和吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、A549、H1650、H1975进行胞内胆固醇水平检测，结果显示，与PC-9对比，吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、A549、H1650、H1975胞内胆固醇水平显著升高(p＜0.01)，结果见图2。将吉非替尼耐药细胞株持续暴露于吉非替尼24h、48h、72h后，在给予吉非替尼干预后三种诱导耐药机制的细胞株在72h时胞内胆固醇水平呈现上升趋势(p＜0.05)，PC-9/GR、H1650细胞系随着吉非替尼加入的时间增多，胞内胆固醇水平呈现上升趋势，而H1975细胞则是随吉非替尼加入时间增多，胞内胆固醇水平先下降后升高，其原因是由于H1975细胞系虽然具有EGFR耐药突变T790M突变，但也含有EGFR敏感突变L858R突变，因此H1975在短期加药时可能会对吉非替尼呈现敏感状态，导致胞内胆固醇先降低。吉非替尼原发耐药细胞A549在使用吉非替尼干预时未出现胞内胆固醇水平增高的趋势。结果见图2。
1.4.3 NSCLC细胞株胆固醇外排途径调控因子蛋白表达水平检测
选择吉非替尼敏感细胞株PC-9和吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975检测胆固醇外排途径调控因子PPARα、LXRα、ABCA1蛋白表达水平。结果显示，与PC-9对比，吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975胆固醇外排途径调控因子PPARα、LXRα、ABCA1蛋白表达量显著降低，这说明在耐药株中胆固醇外排出现了异常，因此导致了胞内胆固醇的累积。将吉非替尼耐药细胞株持续暴露于吉非替尼24h、48h、72h后，胆固醇外排途径调控因子PPARα、LXRα、ABCA1蛋白表达持续降低，说明吉非替尼引起细胞内胆固醇水平升高可能由于外排途径持续失活导致，结果见图3。
二、非诺贝特与吉非替尼的复方制剂缓解NSCLC吉非替尼耐药作用
2.1实验材料
2.1.1实验细胞
吉非替尼耐药PC-9/GR、H1650、H1975细胞株。
2.2实验试剂
吉非替尼，非诺贝特，CCK-8试剂盒，DMEM高糖培养基，胎牛血清，青链霉素混合液，胰蛋白酶。
2.3实验方法
2.3.1细胞培养
PC-9/GR、H1650、H1975细胞株培养在含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。
2.3.2 CCK-8法检测细胞增殖
PC-9/GR、H1650和H1975细胞的增殖参见1.3.2部分描述的方法。
2.3.3 Western Blot分析细胞株中蛋白的表达
参见1.3.4部分的描述方法。
2.4实验结果
2.4.1非诺贝特对PPARα/LXRα/ABCA1信号轴的激动作用
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，使用不同浓度的非诺贝特(20、40、60μM)作用于细胞48h后检测胆固醇外排途径调控因子PPARα、LXRα、ABCA1蛋白表达水平。结果显示，非诺贝特可以激动PPARα/LXRα/ABCA1信号轴，使PPARα、LXRα、ABCA1蛋白表达量明显升高，结果见图4。
2.4.2非诺贝特体外抗肿瘤药效检测结果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，CCK-8法检测不同浓度非诺贝特(0、5、10、20、40、80、160μM)单独作用48h对细胞系的抑制作用，结果显示最大浓度的抑制率不超过50％，经计算IC50值分别为144.7μM、161.7μM和165.5μM，这说明非诺贝特单独作用对吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975的抑制效果较弱，结果见图5。
2.4.3非诺贝特呈剂量依赖性增强吉非替尼药效
选择吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用不同浓度非诺贝特(20、40、60μM)与不同浓度吉非替尼(0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、60(20、40、60μM))联合给药，CCK-8法检测细胞活力。结果显示，非诺贝特能显著增加NSCLC耐药株对吉非替尼的敏感性，且随着非诺贝特浓度增大，增殖抑制作用越强，表现出明显的剂量依赖性，结果见图5。
2.4.4非诺贝特和吉非替尼在非小细胞肺癌中联合应用具有协同效果
选择吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用不同浓度非诺贝特(20、40、60μM)与不同浓度吉非替尼(0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、60μM)联合给药，CCK-8法检测细胞活力，计算IC50值和联合系数CI值。结果显示，联合非诺贝特后吉非替尼的IC50值显著降低，联合指数CI≤1，说明非诺贝特可以增加吉非替尼NSCLC耐药株对吉非替尼的敏感性，与吉非替尼具有协同抗肿瘤作用，结果见表1、2、3和图6。
表1 PC-9/GR细胞株非诺贝特与吉非替尼联合用药指数
表2 H1975细胞株非诺贝特与吉非替尼联合用药指数
表3 H1650细胞株非诺贝特与吉非替尼联合用药指数
三、苯扎贝特逆转NSCLC吉非替尼耐药的作用研究
3.1实验材料
3.1.1实验细胞
吉非替尼耐药PC-9/GR、H1650、H1975细胞株。
3.2实验试剂
吉非替尼，苯扎贝特，CCK-8试剂盒，DMEM高糖培养基，胎牛血清，青链霉素混合液，胰蛋白酶。
3.3实验方法
3.3.1细胞培养
PC-9/GR、H1650、H1975细胞株培养在含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。
3.3.2 CCK-8法检测细胞增殖
PC-9/GR、H1650和H1975细胞增殖参见1.3.2部分描述的方法。
3.4实验结果
3.4.1苯扎贝特体外抗肿瘤药效检测结果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，CCK-8法检测不同浓度苯扎贝特(0、5、10、20、40、80、160μM)单独作用48h对细胞系的抑制作用，结果显示最大浓度的抑制率不超过50％，经计算IC50值分别为777.5μM、1523μM和1055μM，这说明苯扎贝特单独作用对吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975的抑制效果较弱，结果见图7。
3.4.2苯扎贝特呈剂量依赖性增强吉非替尼药效
选择吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用特定浓度苯扎贝特(40μM)与不同浓度吉非替尼(0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、60μM)联合给药，CCK-8法检测细胞活力。结果显示，苯扎贝特能显著增加NSCLC耐药株对吉非替尼的敏感性，结果见图7。
3.4.3苯扎贝特和吉非替尼在非小细胞肺癌中联合应用具有协同效果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用吉非替尼单独或者与苯扎贝特联合处理，CCK-8法检测吉非替尼单独作用或联合苯扎贝特作用时吉非替尼的IC50值，计算联合系数CI值。结果显示，联合苯扎贝特后吉非替尼的IC50值显著降低，且联合指数在不同浓度均小于1(CI<1)，表明苯扎贝特和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用，结果见表4和图8，结果表明苯扎贝特和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用。
表4苯扎贝特与吉非替尼联合用药指数
四、氯贝特逆转NSCLC吉非替尼耐药的作用研究
3.1实验材料
3.1.1实验细胞
吉非替尼耐药PC-9/GR、H1650、H1975细胞株。
3.2实验试剂
吉非替尼，氯贝特，CCK-8试剂盒，DMEM高糖培养基，胎牛血清，青链霉素混合液，胰蛋白酶。
3.3实验方法
3.3.1细胞培养
PC-9/GR、H1650、H1975细胞株培养在含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。
3.3.2 CCK-8法检测细胞增殖
PC-9/GR、H1650和H1975细胞增殖参见1.3.2部分描述的方法。
3.4实验结果
3.4.1氯贝特体外抗肿瘤药效检测结果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，CCK-8法检测不同浓度氯贝特(0、5、10、20、40、80、160μM)单独作用48h对细胞系的抑制作用，结果显示最大浓度的抑制率不超过50％，经计算IC50值分别为1268μM、1136μM和1227μM，这说明氯贝特单独作用对吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975的抑制效果较弱，结果见图9。
3.4.2氯贝特呈剂量依赖性增强吉非替尼药效
选择吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用特定浓度氯贝特(40μM)与不同浓度吉非替尼(0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、60μM)联合给药，CCK-8法检测细胞活力。结果显示，氯贝特能显著增加NSCLC耐药株对吉非替尼的敏感性，结果见图9。
3.4.3氯贝特和吉非替尼在非小细胞肺癌中联合应用具有协同效果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用吉非替尼单独或者与氯贝特联合处理，CCK-8法检测吉非替尼单独作用或联合氯贝特作用时吉非替尼的IC50值，计算联合系数CI值。结果显示，联合氯贝特后吉非替尼的IC50值显著降低，且联合指数在不同浓度均小于1(CI<1)，表明氯贝特和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用，结果见表5和图10，结果表明氯贝特和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用。
表5氯贝特与吉非替尼联合用药指数
五、吉非罗齐逆转NSCLC吉非替尼耐药的作用研究
3.1实验材料
3.1.1实验细胞
吉非替尼耐药PC-9/GR、H1650、H1975细胞株。
3.2实验试剂
吉非替尼，吉非罗齐，CCK-8试剂盒，DMEM高糖培养基，胎牛血清，青链霉素混合液，胰蛋白酶。
3.3实验方法
3.3.1细胞培养
PC-9/GR、H1650、H1975细胞株培养在含10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃5％CO2细胞培养箱中。
3.3.2 CCK-8法检测细胞增殖
PC-9/GR、H1650和H1975细胞增殖参见1.3.2部分描述的方法。
3.4实验结果
3.4.1吉非罗齐体外抗肿瘤药效检测结果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，CCK-8法检测不同浓度吉非罗齐(0、5、10、20、40、80、160μM)单独作用48h对细胞系的抑制作用，结果显示最大浓度的抑制率不超过50％，经计算IC50值分别为871.9μM、1059μM和1147μM，这说明吉非罗齐单独作用对吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975的抑制效果较弱，结果见图11。
3.4.2吉非罗齐呈剂量依赖性增强吉非替尼药效
选择吉非替尼NSCLC耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用特定浓度吉非罗齐(40μM)与不同浓度吉非替尼(0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、60μM)联合给药，CCK-8法检测细胞活力。结果显示，吉非罗齐能显著增加NSCLC耐药株对吉非替尼的敏感性，结果见图11。
3.4.3吉非罗齐和吉非替尼在非小细胞肺癌中联合应用具有协同效果
选择吉非替尼耐药细胞株PC-9/GR、H1650、H1975，采用吉非替尼单独或者与吉非罗齐联合处理，CCK-8法检测吉非替尼单独作用或联合吉非罗齐作用时吉非替尼的IC50值，计算联合系数CI值。结果显示，联合吉非罗齐后吉非替尼的IC50值显著降低，且联合指数在不同浓度均小于1(CI<1)，表明吉非罗齐和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用，结果见表6和图12，结果表明吉非罗齐和吉非替尼具有协同抗肿瘤作用。
表6吉非罗齐与吉非替尼联合用药指数
从以上结果可以看出，本发明发现肿瘤细胞内胆固醇在NSCLC吉非替尼耐药中的发生积累并且吉非替尼持续作用于NSCLC吉非替尼耐药株后引起胆固醇水平持续升高，这是由于胆固醇外排途径PPARα/LXRα/ABCA1失调所导致，本发明发现一种新的联合用药方式即选择外排途径PPARα靶点激动剂贝特类药物与吉非替尼联用，可以激活PPARα/LXRα/ABCA1途径促进胆固醇外排从而改善非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药现象，从而增强吉非替尼的敏感性。此外，本发明还发现贝特类药物包括非诺贝特、苯扎贝特、氯贝特以及吉非罗齐与吉非替尼的复方制剂对肿瘤具有协同治疗效果。
