一种沙蓬提取物和提取方法及其应用
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域，更具体地涉及一种沙蓬提取物和提取方法及其应用。
背景技术：
心血管系统疾病是人类最为常见的一类疾病，已成为当今世界人口的第一大死因。而心肌损伤是心血管系统疾病中一类，在心血管系统疾病占比越来越高。心肌损伤也就是心肌细胞的损伤，即是心肌细胞炎症、坏死、变性水肿，引起的这种变化。
心肌损伤的原因既可以是由严重缺血导致的冠状动脉病变引起的，比如说像急性冠状动脉综合征、冠心病、急性心肌梗死这一类。也可以是炎症引起的心肌损伤，比如说心肌炎、心包炎。
还有一类就是心肌应激的结果，包括情绪的和机体的，情绪包括比如说心爱的人去世，离婚或者一些财产的问题，像那种心碎的感觉，其实是引起了心肌损伤；
而机体的应激，比如说车祸或大手术，这两种都作为是心肌应激的结果，主要是由于诱发体内激素在体内水平的升高，会引起高血压和心肌梗塞，导致了心肌的损伤；
还有一些自身免疫性疾病累及心脏，比如继发于系统性红斑狼疮的狼疮性的心脏病，也会引起心肌损伤。
比如像物理的或化学的一些损伤，比如像刀枪刺伤心肌，或者一些药物，药物对心脏的一些毒性作用，比如像那些治疗肿瘤的药物，治疗血液病的药物，这些药物对心脏也有毒性的作用，引起心肌的损伤。
心肌细胞损伤病情轻的时候可以没有明显的症状，但是对于病情较重的这些患者，他就会表现为比较强烈的胸闷、各种各样的胸痛，并且呼吸困难，还有的人乏力、恶心、呕吐、急性心衰，甚至恶性的心律失常，心包破裂甚至猝死，都有可能。
所以一旦引起心肌损伤，我们就必须要确定病情的严重程度，我们可以通过心电图和一些特殊的心肌损伤标志物，来评价心肌损伤轻和重的程度。
因此，由于心肌细胞损伤病情轻的时候可以没有明显的症状，且由于导致心肌损伤的原因多而杂，所以心肌损伤的预防和治疗一直是心血管系统疾病的一大难题，特别是异丙肾上腺素诱导的心肌损伤，异丙肾上腺素可以诱导上述的多种类型的心肌损伤。
异丙肾上腺素是一个强的β受体兴奋剂，能通过加快心率、增强心肌收缩力等环节增加心肌耗氧量，造成心脏负荷过重，心肌微循环障碍，冠状动脉痉挛、心肌梗死样变化、心肌坏死、甚至猝死。这些病理损伤可能与线粒体能量代谢紊乱、凋亡基因的激活、氧化应激等有关。
异丙肾上腺素诱导的心肌损伤由于病理表现种类多、病理机制复杂，能够针对异丙肾上腺素多种病理诱导的心肌损伤一直没有很好地特效药物。寻找新型、高效、低毒的，具有多靶点调节作用的防治药物仍是药学研究的重点之一。
发明内容：
为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种沙蓬提取物和提取方法及其应用，能够有效的解决针对异丙肾上腺素多种病理诱导的心肌损伤一直没有很好地特效药物的问题。
本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：沙蓬提取物，其特征在于所述的沙蓬提取物的主要成分是沙蓬低聚糖。
沙蓬提取物的提取方法，其特征在于所述提取方法制备所述的沙蓬提取物，所述提取方法包括沙蓬粉碎加乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，再加等体积水稀释，滤过，滤液通过吸附树脂柱，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩即得。
所述的沙蓬提取物的提取方法，其特征在于包括取沙蓬粉碎成粗粉，依次加10、8倍量的95％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，弃渣，脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70％乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味(1g:1ml)，再加等体积水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液通过D101型大孔吸附树脂柱，适量水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩，活性炭脱色，精制，减压浓缩至浸膏，减压干燥，粉碎即得沙蓬提取物。
沙蓬提取物的用途，所述沙蓬提取物采用所述的沙蓬提取物的提取方法制备而成，其特征在于用于对心脏损伤的保护。
所述的沙蓬提取物的用途，其特征在于所述的心脏损伤为异丙肾上腺素诱导的心肌损伤。
所述的沙蓬提取物的用途，其特征在于所述的沙蓬提取物用于异丙肾上腺素诱导的多种病理心肌损伤的保护，所述心肌损伤包括心肌细胞坏死心肌损伤、心肌缺血心肌损伤和心动过速的心肌损伤，并能够改善异丙肾上腺素诱导激素水平的心肌损伤。
本发明的有益效果是：
本发明通过提取工艺获得一种能够用于异丙肾上腺素诱导的心肌损伤保护的天然物质沙蓬低聚糖；
沙蓬低聚糖能够通过维持心肌细胞完整性，减轻心肌缺血，改善异丙肾上腺素诱导的急性心肌损伤，沙蓬低聚糖能够对于异丙肾上腺素多种病理机制诱导心肌损伤均具有良好的效果，
沙蓬低聚糖对异丙肾上腺素多种病理机制所致心肌损伤均具有一定的改善作用，对心肌损伤具有一定的保护作用，是一种新型、高效、低毒的，针对异丙肾上腺素诱导的急性心肌损伤的多靶点调节作用防治药物。
附图说明：
附图1是本发明正常对照组给药前大鼠心电图变化心电图；
附图2是本发明正常对照组用生理盐水后大鼠心电图变化心电图；
附图3是本发明异丙肾上腺素造模后大鼠心电图变化心电图；
附图4是本发明沙蓬低聚糖低剂量大鼠心电图变化心电图；
附图5是本发明沙蓬低聚糖中剂量大鼠心电图变化心电图；
附图6是本发明沙蓬低聚糖高剂量大鼠心电图变化心电图；
附图7是本发明大鼠心脏200倍HE染色组织切片图；附图中：
具体实施方式：
在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明的具体实施方式：
沙蓬提取物的主要工艺条件：沙蓬粉碎加乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，再加等体积水稀释，滤过，滤液通过吸附树脂柱，水洗脱，收集水洗脱液，减压浓缩即得。
上述工艺可以进一步优化：取沙蓬，粉碎成最粗粉，依次加10、8倍量的95％乙醇回流提取2次，每次2h，提取液合并，弃渣；脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70％乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味(1g:1ml)，再加等体积水稀释，低温放置过夜；滤过，滤液通过D101型大孔吸附树脂柱，适量水洗脱，再用70％乙醇解吸。收集水洗脱液，减压浓缩，活性炭脱色，精制，减压浓缩至浸膏，减压干燥，粉碎，得沙蓬提取物。
为了更加直观的展现本发明的工艺优势，特以本发明工艺简述：
一、工艺条件的优化
1.乙醇提取工艺条件的优化：
沙蓬提取物采用乙醇热回流法提取，乙醇浓度、乙醇用量、提取次数及提取时间是影响提取效果的主要因素。因此，我们为上述因素各取3个水平，选用L9(34)正交表设计试验，以低聚糖的提取量(总糖)为评价指标，研究筛选最佳工艺条件：
⑴实验设计
采用L9(34)正交表进行试验设计，见下表1、表2。
表1乙醇回流提取工艺正交试验因素水平表
⑵供试品溶液的制备
根据表1、表3正交试验设计要求，精密称取沙蓬粗粉25g，置500ml圆底烧瓶中，加A浓度乙醇B倍量，电热套加热提取C次，每次回流D小时，抽滤，合并滤液于1000ml量瓶中，加A浓度乙醇至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于原药材0.025g)。
⑶低聚糖含量的测定
低聚糖即总糖含量的测定采用苯酚-硫酸分光光度法。
对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，准确吸取5ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置5ml具塞刻度试管中，各加水至1.0ml，摇匀。分别加5％苯酚溶液0.5ml，混匀，迅速加入硫酸3.5ml，摇匀，于40℃水浴中保温30分钟，取出，置冰水浴中冷却5分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外－可见分光光度法，在490nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。
得标准曲线回归方程：A＝9.6930C-0.1092，r＝0.9998。
表2不同浓度葡萄糖对照品的吸光度
样品测定精密量取供试液0.6ml，置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置5ml具塞刻度试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加4％苯酚溶液0.5ml”起，依法测定吸光度，并计算含量；结果见表3。
表3乙醇回流提取工艺正交试验设计及结果(％)计算表
(4)结论
沙蓬乙醇回流提取的最佳工艺条件为:A2B2C3D1组合方案，即取药材最粗粉，依次加10、8、8倍量70％乙醇，须提取3次，依次回流2、1、1小时，沙蓬低聚糖提取量最高。
2.大孔吸附树脂分离纯化工艺研究
提取物水溶液在中性条件下通过适宜的非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，经水洗脱后，黄酮、生物碱、色素等有机亲脂性物质被吸附在大孔吸附树脂上，而糖类组分极性大不能吸附于大孔吸附树脂上，从而糖类组分得到进一步的纯化。
吸附在大孔吸附树脂上的物质以乙醇进行梯度洗脱，可以将不同物质根据其极性的大小依次洗脱下来。以下实验欲通过比较几种大孔吸附树脂对沙蓬低聚糖的吸附纯化性能，寻找对沙蓬低聚糖提取液分离纯化效果良好的树脂，并对其分离纯化工艺进行优化，
⑴沙蓬的提取液的制备
照“沙蓬低聚糖的制备工艺”项下方法，取沙蓬，粉碎成最粗粉，依次加10、8倍量的95％乙醇回流提取2次，每次2h，去除叶绿素等脂溶性成分；脱脂药粉，依次加10、8、8倍量的70％乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二、第三次1小时，提取液滤过，合并滤液减压回收乙醇，浓缩至无醇味(1g:1ml)，再加等体积水稀释，低温放置过夜，滤过，既得提取液，冷藏。每1ml含生药0.5g。临用加水稀释至所需浓度；
⑵分析方法的确定
依据定量分析糖的苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法，是基于糖在浓硫酸作用下，水解脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛后，与苯酚缩合成一种橙红色化合物，或与蒽酮缩合成蓝绿色衍生物，在一定范围内其颜色深浅与糖溶液的浓度成正比，且于特定波长处有最大吸收，而用比色法在此波长下测定含量。沙蓬初提取物中含有的黄酮等苷类化合物在此含量测定过程中，在浓硫酸作用下水解成的糖，进一步水解而干扰低聚糖的测定结果。总黄酮的含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。
所以，本试验主要以待分离去除的黄酮类成分为考查指标，适宜条件下考察测定总低聚糖，综合评价大孔吸附树脂分离除杂纯化制备其低聚糖的工艺。
⑶大孔吸附树脂的筛选
①7种大孔吸附树脂的静态吸附、解吸试验
大孔吸附树脂的预处理分别取一定量的待选树脂，用95％的乙醇浸泡24h，然后用乙醇洗涤，直到洗出液中加适量蒸馏水无白色浑浊，再用蒸馏水洗至无醇，继而依次用5％HCI、4％NaOH浸泡2～4h，分别用纯净水洗至中性，布氏漏斗抽滤，备用。待选7种大孔吸附树脂的物理性能参数见表4：
表4 7种大孔吸附树脂物理性能参数表
静态吸附量考察量取沙蓬初提取液40ml，加水稀释至1000ml，摇匀(0.2g生药/ml)，测定总黄酮含量(C0)。称取大孔吸附树脂各三份，每份1g(W)，置100mL的具塞三角烧瓶中，准确加入上述沙蓬初提取物水溶液40mL(V0)，称定重量，置于摇床，摇24h后，再称定重量，加水补足损失重量，摇匀，过滤，滤液测定剩余总黄酮含量(C1)，水洗树脂滤饼，洗液弃。并照下列公式计算各大孔吸附树脂的总黄酮吸附量(Q)。结果见表5。
静态解吸率考察将吸附了沙蓬总黄酮的大孔吸脂再移入100mL的具塞三角烧瓶中，加入70％乙醇30ml(V1)，称定重量，置于摇床，摇24h，称定重量，加70％乙醇补足损失重量，摇匀，过滤，滤液测定剩余总黄酮含量C2。并照下列公式计算各大孔吸附树脂的总黄酮解吸量(D)以及解吸率(E)，结果见表5：
表5 7种大孔吸附树脂静态吸附及解吸性能表
(4)结论
表5所示试验结果表明：7种大孔吸附树脂静态吸附及解吸能力具有明显差异，静态吸附量与解吸量均最好者为D101型，其次为AB-8型；ADS-7型吸附量虽较好，但解吸率较差而解吸量较低。
故综合考量，选择D101型和AB-8型2种大孔吸附树脂继续进行动态吸附、解吸试验，以选择更优者。
二：沙蓬低聚糖对心脏损伤的药理性研究：
1.沙蓬低聚糖剂量
临床用法：口服，成人用量为0.075g/kg，一天一次；
大鼠与人的等效剂量比为6.3:1，故大鼠治疗的等效剂量为0.47g/kg。大鼠实验时采用三个剂量，分别相当于人临床用量的2倍、1倍(等倍)及0.5倍。给药量分别为药粉0.94、0.47、0.24g/kg。给药途径为口服(灌胃)，容量为5ml/kg，每天一次，均为上午8:00～10:00点给药。
2.心肌损伤动物模型的建立：异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤
90只SD大鼠适应性喂养1周，适应结束后，随机留取10只作为正常对照组，其余80只腹腔注射异丙肾上腺素诱导心肌损伤，剂量为5mg/(kg d)，正常对照组注射同等剂量生理盐水，连续2周；2周后注射异丙肾上腺素存活大鼠60只，以心脏超声评价大鼠模型是否成功；将造模成功40只大鼠随机分为4组：模型对照组10只、沙蓬低聚糖高剂量组0.94g/(kgd)10只、沙蓬低聚糖中剂量组0.47g/(kg d)10只、沙蓬低聚糖低剂量组0.24g/(kg d)10只。药物治疗组分别按上述药物剂量灌胃给药治疗，正常对照组和模型对照组给与同等体积蒸馏水，每天一次，均为上午8-10点给药，连续给药2周。
3.分组与给药
将符合成模标准的大鼠，随机分为5组，分别为正常对照组、模型对照组、沙蓬低聚糖高剂量组、沙蓬低聚糖中剂量组、沙蓬低聚糖低剂量组。
4.观察指标
4.1沙蓬低聚糖对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌损伤的保护作用
4.1.1检测大鼠血液中心肌酶和抗氧化指标
表6沙蓬低聚糖对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌酶含量的影响(
注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
表6结果显示：与正常对照组相比，模型组小鼠血清心肌酶学指标乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同功酶(CK-MB)显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，沙蓬低聚糖各给药组显著降低大鼠血清LDH、CK、CK-MB水平(P＜0.01，P＜0.05)。
表7沙蓬低聚糖对异丙肾上腺素诱导大鼠氧化应激的影响(
注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
表7结果显示：异丙肾上腺素诱导可不同程度地增加大鼠血清脂质过氧化水平，其中与正常对照组相比，模型组大鼠血清中的MDA、GSH-PX显著增加，而SOD显著降低(P＜0.01，P＜0.05)；单独应用高、中剂量的沙蓬低聚糖均可降低血清中MDA、GSH-PX水平，增高SOD水平。
从病理学上分析可知：
MDA是脂质过氧化的产物，MDA的显著增高提示细胞膜结构遭受了较大程度的氧化损伤，异丙肾上腺素进入机体后，使心肌细胞更容易发生脂质过氧化反应，使得MDA含量升高，故MDA是异丙肾上腺素诱导的心脏细胞损伤的严重程度的指标。
空白组经异丙肾上腺素诱导后血清中MDA含量明显增加，而经不同剂量沙蓬低聚糖治疗后，MDA含量显著降低。与此同时，在异丙肾上腺素的诱导下，可引起大鼠心肌酶的大量释放，从而诱导大鼠出现心肌损伤，可通过检测心肌酶水平间接反映心肌细胞是否有损伤坏死。模型组大鼠血清中LDH、CK和CK-MB心肌酶活性显著增高，各组沙蓬低聚糖组大鼠血清中LDH、CK和CK-MB活性显著降低。
因此，以上结果说明，沙蓬低聚糖通过降低受损心肌酶的释放，提高大鼠血清中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量，从而发挥对异丙肾上现素诱导的大鼠心肌损伤的保护作用。
大鼠可在异丙肾上腺素的诱导下，使得心脏内源性抗氧化系统下降导致氧化损伤，不同程度地增加大鼠血清脂质过氧化水平。由SOD，CAT和GSH-Px组成的内源性抗氧化酶系统是抗氧化应激的第一条细胞防御系统，与抗氧化剂包括超氧化物阴离子和羟基自由基的形成有关。异丙肾上腺素刺激后SOD的活性急剧下降，GSH-PX显著增加，表明自由基的不可抗拒性，导致心肌细胞的氧化损伤。
空白组使用异丙肾上腺素诱导后，SOD的显著降低，GSH-PX显著增加。实验组经不同剂量沙蓬低聚糖治疗后，使得异丙肾上腺素诱导的大鼠血清中SOD活性水平明显提高，GSH-PX显著降低，
因此，沙蓬低聚糖在异丙肾上腺素引起的大鼠心肌梗死中具有一定程度的抗氧化能力。
4.1.2大鼠心脏/体重指数
各大鼠取血后，立即剖腹取心脏，用滤纸吸干血液，立即用电子天平称心重，迅速取1-2立方毫米组织放于盛有戊二醛小瓶中，用于透色电镜观察超微结构；另取部分组织固定于4％多聚甲醛中(固定72h以上，中间换液2次)，进行常规石蜡包埋，HE染色光镜下观察病例结构。
各组大鼠的体重、心重及心脏/体重指数对比如表8所示：与正常对照组相比，模型组大鼠体重明显减轻，具有统计学意义(P＜0.05)，心重及心脏/体重指数明显增加，具有统计学意义(P＜0.05)；沙蓬低聚糖高、中、低治疗组大鼠的体重较模型组均有所增加，心重及心脏/体重指数较模型组均有所减少，其中沙蓬低聚糖高剂量组大鼠的体重、心重及心脏/体重指数与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05)。
表8沙蓬低聚糖对异丙肾上腺素诱导大鼠心脏/体重指数的影响(
注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
4.1.3大鼠心电图变化
异丙肾上腺素是β肾上腺素受体激动剂，具有激动兴奋心脏β受体的作用，连续大剂量应用时可以使心脏收缩力增强，加快心率，加大心脏输出量，同时会导致心肌细胞的耗氧量大大增加，发生心肌能量代谢紊乱，导致心肌缺血缺氧，进而导致大鼠心电图S-T段异常改变，发生心肌损伤坏死，大剂量异丙肾上腺素诱导动物心肌损伤时发生的心电图改变，血清酶学改变，以及心肌组织病理学改变与人类发生心肌梗死时的改变非常相似，
因此，可以通过心电图检查来检测心脏的正常电生理活动是否受到影响，推测是否产生心脏的器质和功能性病变，如图1-6所示，正常对照组在给生理盐水前，心率正常，给予生理盐水后大鼠心率略有增加，其他无明显影响，大鼠给与异丙肾上腺素造模后，大鼠心电图的S-T段抬高，T波低平，心率明显加快，说明有心肌缺血及心动过速情况；沙蓬低聚糖高、中剂量治疗组大鼠的心电图与模型组相比，心电图S-T段降低，T波上升，心率明显下降；沙蓬低聚糖低剂量治疗组大鼠的心电图与模型组相比无明显变化，但心率略有下降；
本发明数据表明，沙蓬低聚糖高、中剂量组能抑制异丙肾上腺素所引起的大鼠心电图S-T段抬高，T波低平，心率明显加快的情况，说明沙蓬低聚糖可改善心肌缺血及心动过速的情况。
4.1.4大鼠心脏病理学变化
如图7所示，其中：A：正常组B：模型组C：沙蓬低聚糖高剂量组D：沙蓬低聚糖中剂量组E：沙蓬低聚糖低剂量组；
由上述附图结果可知：正常对照组心肌组织细胞完整，结构正常，界限清晰，未见肥大、变性、坏死等病变，胞浆染色均一，胞核椭圆居于细胞中。与空白组比较，模型组大鼠心肌组织细胞崩解坏死，细胞排列紊乱，界限不清，细胞核散在，呈弥漫性坏死，胞浆混浊，细胞核散在于细胞之间；与模型组比较，沙蓬低聚糖高、中、低剂量治疗组大鼠心肌组织细胞排列有序，裂解坏死情况相较于模型组轻，沙蓬低聚糖高剂量组改善情况最好，其次为沙蓬低聚糖中剂量组，再次为沙蓬低聚糖低剂量组，治疗情况呈剂量依赖性，
沙蓬低聚糖各剂量组可改善异丙肾上腺素导致的大鼠心肌损伤，使心肌细胞形态结构趋于完整，排列紧密而整齐，界限分明，胞质染色均匀，胞核清晰，居于细胞中央。
根据上述分析可知：
(1)根据组织病理学显示沙蓬低聚糖能够改善坏死心肌细胞，通过维持心肌细胞完整性，改善异丙肾上腺素诱导细胞坏死缺血导致的冠状动脉病变引起的急性心肌损伤；
(2)根据心电图显示沙蓬低聚糖能够改善减轻心肌缺血和心动过速，改善异丙肾上腺素诱导心肌缺血和心动过速导致的的急性心肌损伤；
(3)沙蓬低聚糖还可以通过降低受损心肌酶的释放，提高大鼠血清中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量，从而发挥对异丙肾上现素诱导的大鼠心肌损伤的保护作用，改善异丙肾上腺素诱导激素水平的心肌损伤；
从而，沙蓬低聚糖能够有效地缓解由于异丙肾上腺素导致心肌酶和抗氧化指标显著升高的问题，导致心肌应激和机体应激的心肌损伤。
综上可知：沙蓬低聚糖能够对于异丙肾上腺素多种病理机制诱导心肌损伤均具有良好的效果，对异丙肾上腺素多种病理机制所致大鼠心肌损伤均具有一定的改善作用，对心肌损伤具有一定的保护作用。
