一种阳虚型便秘动物模型的构建方法及其用途
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种阳虚型便秘动物模型的构建方法及其用途。
背景技术
便秘是常见的消化道功能紊乱性疾病，临床表现症状有粪便干结、排便困难或不尽感、粪便重量和次数减少等。根据流行病学调查，在我国，便秘的发病率为3% ~ 17%。随着现代社会的发展、生活方式及饮食结构的改变，慢性便秘的发生率呈上升趋势，并具有普遍性、反复性和年龄相关性等特点。然而便秘的非致死性，常常造成治疗上的忽略。但便秘危害巨大，轻则导致患者生活质量的下降，比如引起神经衰弱、失眠、烦躁不安、口臭等；重则继发各种肛肠疾病，同时也会增加结肠癌、心血管疾病以及老年痴呆等疾病的发病风险。
西医认为便秘只是一个临床症状，不属于独立的疾病。而中医把便秘作为独立的疾病，发挥辨证论治的优势，并对患者实施个体化治疗。
中医对便秘的治疗已有2000多年的历史，在实践摸索中积累了丰富的理论经验。《素问ㆍ五脏别论》曰：“魄门亦为五脏使”，即便秘与心、肺、肝、脾胃、肾等均有关系，其中和脾、肾的关系最为密切。《素问ㆍ厥论》曰：“太阴之厥，则腹满䐜胀，后不利，不欲食，食则呕，不得卧。”指出便秘和脾的关系。《素问ㆍ刺疟篇》中写到，“肾疟者，令人洒洒然，腰脊痛，宛转，大便难，目眴眴然，手足寒”，明确指出便秘和肾阳虚有关。
综上，便秘和脾、肾两大脏器关系密切。因此，阳虚便秘动物模型既在证型上符合中医理论中阳虚的表现，又在疾病上符合“大便难”和“秘结”病范畴，并且能较好地模拟临床上阳虚便秘患者的临床表现。
作为科研先导，动物实验可以弥补临床研究的不足。因此，一个客观性、公认性、重复性较好的动物模型对认识疾病的发病机制、病理生理过程及其药物研发具有重要作用。目前国内虽有阳虚型便秘中医证型的动物模型的实验研究，但是高死亡率和重现性不好是该模型研究的重大缺陷。
发明内容
本发明为了解决目前阳虚型便秘动物模型死亡率高、重现性差等问题，提供了一种阳虚型便秘动物模型的构建方法及其用途。
本发明由如下技术方案实现的：一种阳虚型便秘动物模型的构建方法，用1% ~ 8%v/v的乙酸溶液和含5 % ~ 50% g/v活性炭的冰水混合物对实验动物进行灌胃1~8周，具体给药方法为：乙酸溶液的首剂量为0.5~10.0mL/只，此后按0.5~10 mL/100g给予乙酸溶液，0.5~8小时后，每只按0.5~10 mL/100g灌胃给予含活性炭的冰水混合物，乙酸溶液和活性炭冰水混合溶液的灌胃时间是1~8周即7~56天，每周灌胃1~7次；
当实验动物出现下列第（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）主要症状中的5项和（8）（9）（10）（11）次要症状中3项时，阳虚型便秘大鼠动物模型构建成功；
所述主要症状为：（1）肛温下降；（2）12h排便粒数减少；（3）排便时间延长；（4）小肠推进率减小；（5）粪便含水量降低；（6）结肠病理组织中：上皮细胞脱落或见局部粘膜下层水肿，结缔组织排列疏松，胞质疏松淡染，但固有层肠腺丰富，可见较多杯状细胞，未见明显炎症；（7）结肠的粘液分泌减少；
所述次要症状为：（8）大鼠毛色变灰暗、无光泽；（9）体重下降；（10）自主活动能力降低；（11）胸腺指数下降；（12）摄食量量减少。
所述实验动物为SPF级健康的成年动物，所述成年动物为SD大鼠、Wistar大鼠、C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠或昆明小鼠中的任意一种。
所述的乙酸浓度用pH值进行控制。所述的病理标本主要是结肠部位。
本发明的有益效果主要体现在：现有的阳虚便秘模型存在造模不稳定、致死率高等缺点。本发明提供一种稳定性高，易于推广、死亡率低、经济适用的阳虚型便秘动物模型，为临床前期实验研究，以及研发具有改善阳虚型便秘作用的食品和药物提供实验基础。为治疗阳虚型便秘的处方筛选、药物的临床前研发、功能评价、机制研究等，以及功能食品、保健食品的研发提供实验基础。
本发明在前期的研究基础上对模型进行改进，新模型可以大幅度的减少实验动物的死亡情况，并能显著提高模型的复制率。本发明不仅可以加深对阳虚便秘病证的认识，而且可以为转化医学和新药研发提供高水平的动物模型。
附图说明
图1为本发明实施例中，建模后大鼠的肛温；
图2为本发明实施例中，建模后各组大鼠小肠推进率；
图3为本发明实施例中，结肠组织标本HE染色的光学显微镜图，其中（a）为对照组（×200倍），（b）为3%乙酸组（×200倍），（c）为5%乙酸组（×200倍）；
图4为本发明实施例中，结肠组织标本AB-PAS染色的光学显微镜图，其中a为对照组（×200倍），b为3%乙酸组（×200倍），c为5%乙酸组（×200倍），d为各组的粘液量；
图5为本发明实施例中，建模后各组大鼠粪便形态图；
图6为本发明实施例中，建模后大鼠的体重增量变化图；
图7为本发明实施例中，建模大鼠的胸腺指数；
图8为本发明实施例1中乙酸诱导的阳虚型便秘大鼠动物模型造模35天的生存曲线图；
图9为对比实验例1中采用白醋造模35天的大鼠生存曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，但凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：乙酸诱导的阳虚型便秘大鼠动物模型的建立
试剂的制备：3%（v/v）乙酸溶液：将食用冰乙酸溶液（CH3COOH，天宇食品制造厂（韩国））加入到室温（约25℃）蒸馏水中，用玻璃棒搅拌，使充分混匀。当溶液pH值为2.53时，停止加酸。
5%（v/v）乙酸溶液：将食用冰乙酸溶液（CH3COOH，天宇食品制造厂（韩国））加入到室温（约25℃）蒸馏水中，用玻璃棒搅拌，使充分混匀。当溶液pH值为2.42时，停止加酸。
活性炭冰水混合物：取200 g的活性炭粉末（福晨（天津）化学试剂有限公司），加入到1000 mL的冰水中，制备含20%活性炭的冰水混合物。用前搅拌，使活性炭均匀的分散在溶液中。
实验动物：SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重180~200g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（合格证号：SCXK(京)2016-0006），并由山西大学动物房饲养室喂养。饲养期间自由进食和饮水，采用12小时的光照/黑暗交替，饲养环境温、湿度适宜。
动物分组：SD大鼠50只，根据数字随机表随机选取10只为对照组，40只为模型组。模型组大鼠再随机分成3%（v/v）乙酸模型组和5%（v/v）乙酸模型组，每组20只。
造模方法：用1% ~ 8%（v/v）的乙酸溶液和含5% ~ 50%（g/v）活性炭的冰水混合物灌胃1~8周（7~56天），并采用主要症状和次要症状相结合的评价方法对所建立的阳虚型便秘动物模型进行评价。当实验动物出现下列第（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）主要症状中的5项和（8）（9）（10）（11）次要症状中3项时，阳虚型便秘大鼠动物模型构建成功：（1）肛温下降（2）12h排便粒数减少（3）排便时间延长（4）小肠推进率减小（5）粪便含水量降低（6）结肠病理组织中上皮细胞脱落或见局部粘膜下层水肿，结缔组织排列疏松，但固有层肠腺丰富，可见较多杯状细胞，未见明显炎症（7）结肠的粘液分泌减少（8）大鼠毛色变灰暗、无光泽（9）体重下降（10）自主活动能力降低（11）胸腺指数下降（12）摄食量量减少。
具体步骤如下：
A、3%乙酸模型组大鼠正常饮食的同时给予首剂量5 mL/只的3%（v/v）乙酸溶液，次日起按1.5 mL/100g的剂量灌胃3%（v/v）乙酸溶液，2小时后，每只按2.5 mL/ 100g灌胃给予含活性炭20%（g/v）的活性炭冰水混合物，每周给予3次；连续35天。
B、5%乙酸模型组大鼠正常饮食的同时给予首剂量5.0 mL/只的5%（v/v）乙酸溶液，次日起按1.5 mL/100g的剂量灌胃5%（v/v）乙酸溶液，2小时后，每只按2.5 mL/ 100g灌胃给予含20%（g/v）活性炭的冰水混合物，每周给予3次；连续35天。
C、对照组大鼠正常饮食的同时给予和模型组等量的蒸馏水，每周给予3次；连续35天。
建立大鼠动物模型的评价：将上述实施例中建立的阳虚便秘大鼠模型进行以下项目的评价试验。
一、主要症状的评价
1、肛温的测定：造模结束后，用电子温度计测量所有老鼠的肛温。
2、12小时排便粒数：在第0、7、14、21、28、35天，将所有大鼠置于代谢笼中收集每只大鼠12小时内的粪便数目；正常组大鼠同期观察。
3、首粒黑便排出时间的测定：造模结束后，对所有大鼠灌胃自制的墨汁（1 mL/100g），将所有大鼠置于代谢笼中，观察并记录从灌胃墨汁到首次排除黑色粪便的时间。
4、小肠推进率测定：大鼠禁食12小时后，自制墨汁（1 mL/100g）灌胃，30 min后，处死大鼠，剖腹取出全部胃肠道，测量墨汁前端至幽门括约肌距离（cm）和幽门括约肌至小肠末端距离（cm）。按下式计算小肠推进率。
小肠推进率 = 墨汁前端至幽门括约肌（cm）/ 幽门括约肌至小肠末端距离（cm）×100%
5、粪便含水量测定：造模结束后，将大鼠置于代谢笼中，收集大鼠的新鲜粪便，称粪便湿重。将粪便置于60℃烘箱中，干燥24小时，称粪便干重。按下式计算粪便含水量。
粪便含水量 = （粪便湿重－粪便干重）/粪便湿重×100%
6、结肠病理组织形态观察：所有大鼠禁食不禁水12小时后，处死，取结肠组织标本（距离盲肠约2cm处留取结肠组织），10%（v/v）甲醛固定24小时后，进行HE染色。利用光学显微镜观察粘膜层、固有层和肌层的病理变化以及是否有炎症发生。
7、结肠组织内粘液的分泌情况：所有大鼠禁食不禁水12小时后，处死，取结肠组织标本（距离盲肠约2cm处留取结肠组织），10%（v/v）甲醛固定24小时后，进行AB-PAS染色。利用Image Pro Plus 6.0软件，对分析粘液的阳性细胞的平均数量进行统计。
二、次要症状的观察和测定：
1、阳虚体征一般观察：造模结束，观察所有大鼠的精神状态、腹胀程度、毛发光泽度和身体蜷缩度，饮食情况，粪便形态等阳虚特征。
2、体重增值变化：上午9点测量大鼠体重，每只大鼠测量三次，取平均值记录。一周记录三次体重。
3、自主活动能力的测定：在第0、7、14、21、28、35天，将所有大鼠置于100 cm ×100 cm，高60cm的旷场实验装置中。测试进行5分钟，前1分钟适应环境，后4分钟记录大鼠的直立次数和穿越格数。
4、胸腺指数：造模结束后，实验动物处死前，对所有大鼠的体重进行统计，处死后取出胸腺，并记录胸腺的重量。按下式计算胸腺的脏器指数。
胸腺的脏器指数 = 胸腺的重量 / 体重。
三、统计方法：实施例中的实验数据采用方差分析中的One-way ANOVA进行分析，结果用平均值±标准差(`x ± SD)表示。
四、实验结果
（一）主要症状的实验结果
1、肛温：造模结束后，和空白组相比，3%乙酸组和5%乙酸组的肛温均显著下降，其差异具有统计学意义（P < 0.01）。结果如图1所示。肛温接近深部血液温度，更能反映出大鼠真实的体温。结果表明，乙酸加上活性炭冰水能够显著降低大鼠肛温，表现出阳虚症状。
2、大鼠12小时排便粒数：结果如表1所示。在造模第21天，和空白组相比，5%乙酸组的12小时排便粒数显著下降，其差异具有统计学意义（P < 0.05）。在造模第28天，和空白组相比，3%乙酸组的12小时排便粒数显著下降，其差异具有统计意义（P < 0.05）。结果表明，造模结束后，便秘组显著减少了12小时内的排便粒数，便秘症状显著。
表1 各组大鼠12小时排便粒数（
注：与空白组比较，*P < 0.05。
3、粪便转运时间：结果如表2所示，在造模14天，和空白组相比，3%乙酸组和5%乙酸组的粪便转运时间显著延长，差异具有统计学意义（P < 0.05）。模型组粪便转运时间延长，表明便秘大鼠排便间隔时间的延长，便秘显著。
表2 各组大鼠的粪便转运时间（
注：与空白组比较，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05。
4、小肠推进率：结果如图2所示，从小肠推进率看，3%乙酸组和5%乙酸组的小肠推进率较对照组均显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。小肠推进率是便秘的重要指标之一。与空白组相比，便秘大鼠小肠推进率降低，表明便秘大鼠胃肠动力不足。
5、粪便含水量的结果：结果如表3所示。在造模结束后，与空白组相比，3%乙酸组和5%乙酸组的粪便含水量均显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。粪便含水量反映粪便的干燥程度。与空白组相比，模型组粪便含水量显著降低，表明造模后，模型组大鼠肠道内水分含量减少，增加了排便的难度。
表3 各组大鼠的粪便含水量（
注：与空白组比较，**P < 0.01，*P < 0.05。
6、结肠病理组织形态观察：结果如图3所示。造模结束后，空白组大鼠的结肠粘膜上皮、固有层和肌层以及粘膜下层的腺体结构清晰整齐，排列完整，可见较多杯状细胞，未见明显炎症。3%乙酸组的结肠粘膜层肠上皮结构完整，上皮细胞形态结构正常、排列紧密，固有层肠腺丰富，可见较多杯状细胞，未见明显炎症。5%乙酸组的粘膜层多见肠上皮细胞脱落（黑色箭头）；局部粘膜下层可见水肿，结缔组织排列疏松（黑色箭头）；局部肌层可见肌纤维水肿，胞质疏松淡染（黑色箭头），但可见较多杯状细胞，未见明显炎症。阳虚便秘模型属于功能性便秘，结肠病理组织虽有上皮细胞脱落和局部粘膜水肿症状，但是杯状细胞数量正常，又未见炎症，表明阳虚便秘模型未表现出显著的器质性损伤。
7、结肠组织内粘液的分泌情况：造模结束后，与空白组相比，3%乙酸组和5%乙酸组的分泌粘液的阳性细胞平均数量显著降低，其差异均具有统计学意义（P < 0.01）。结果如图4所示。结肠粘液是一类高分子量上皮糖蛋白，形成的免疫屏障可以抵御微生物和难溶物质的侵蚀，为表层粘膜提供保护作用。模型组分泌粘液的阳性细胞平均数量显著降低，使得粘膜表面的粘液层变薄或消失，使便秘大鼠结肠上皮细胞受到细菌的侵袭的概率增加，造成结肠免疫屏障的损害。
二、次要症状的结果
1、阳虚体征观察一般观察：对照组大鼠毛色光亮、爪尾红润、食欲正常，粪便成形，纺锤状，未出现异常特征，无死亡。3%乙酸组大鼠体毛亮度减退，爪尾苍白，食欲减退，活动量减少，精神出现不同程度的萎靡。5%乙酸组大鼠体毛亮度减退、枯槁质硬，爪尾苍白，食欲减退，粪便质硬，静卧少动，精神出现不同程度的萎靡。粪便形态如图5所示。结果表明，便秘大鼠表现出明显的阳虚特征。
2、体重增值变化曲线：从体重增值变化上看，造模后，3%模型组和5%模型组大鼠体重较对照组均有显著降低，但不具有统计学意义。结果如图6所示。结果表明，造模因素对便秘大鼠的体重没有显著影响。
3、自主活动能力：造模21天后，和空白组相比，3%乙酸模型组和5%乙酸模型组的直立次数和穿越格数显著降低，其差异具有统计学意义（P < 0.05）。结果如表4所示。研究结果表明，便秘大鼠的自主活动能力下降。
表4 旷场实验中各组大鼠的直立次数和穿越格数（
注：与空白组比较，***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05。
4、胸腺指数：造模结束后，与空白组相比，3%乙酸组和5%乙酸组的胸腺指数显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。结果如图7所示。胸腺，是重要的中枢免疫器官，有助于T细胞的分化、成熟。模型组大鼠的胸腺指数低，表明便秘会引起大鼠胸腺萎缩，免疫力下降。
实验大鼠主要症状和次要症状的测定结果表明，乙酸和活性炭冰水构建的阳虚型便秘模型能够表现出显著的阳虚症状和便秘症状。说明阳虚型便秘模型构建成功。此外，本发明的实施例1无实验动物死亡，生存曲线详见图8。为突出和进一步验证本发明构建的阳虚型便秘模型致死率低的优点，采用白醋诱导的便秘大鼠模型作为对比实验，在造模时间一致的情况下，评价乙酸诱导的阳虚型便秘大鼠模型的构建方法。
实验例1：白醋诱导的阳虚型便秘大鼠动物模型的建立
试剂的制备：市购食用白醋（山西老陈醋厂，批号：20140513，总酸度 ≥ 6.0 度）、活性炭粉末（福晨（天津）化学试剂有限公司）
实验动物：同实施例1
动物分组：30只健康的雄性SD大鼠随机地分为空白对照组（n=10）和白醋模型组（n=20）。
造模方法：按首剂量5mL/只给予大鼠山西白醋灌胃，第二次开始往后即按3 mL/200g体重给醋灌胃。在每次给醋完后的第二天，按5 mL/200g体重给予动物 16.67 mol/L的 0℃活性炭冰水灌胃。白醋和活性炭冰水单双日交替造模。造模时间共计为35天。
生存率评价：记录实验过程中实验大鼠的存活情况，并构建生存曲线。结果如图9所示。结果显示，醋酸诱导35天的便秘大鼠模型中，大鼠存活率仅有50%。而图8中明显得到本发明所述方法构建的大鼠模型，造模35天存活率为100%，无一例死亡，显然本发明所述构建方法死亡率极低，重现性好。
