羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用
技术领域
本发明是关于羊水干细胞的新的应用，具体而言，本发明是羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种累及多个器官的复杂自身免疫性疾病，多种因素与SLE的发病密切相关，包括遗传、药物、环境、感染、内分泌及精神因素等，这些因素造成机体免疫功能紊乱，免疫耐受异常，自身抗体如抗dsDNA抗体、抗核抗体等大量产生，累及多种脏器，给人们的健康带来很大的危害。SLE在女性患者中多见(男女患病比例约为1:9)，尤以育龄期的女性最为多见。男性患者虽然较为少见，但是疾病活动度和临床症状都较女性患者严重。在遗传背景方面，亚裔人群SLE的发病率和流行率比欧裔更高。
狼疮肾炎(Lupus Nephritis,LN)是SLE最为常见且最为严重的并发症之一，目前认为LN是一种复杂的免疫复合物介导的免疫性肾炎，其可能的发病机制是免疫复合物沉积于肾脏的肾单位，从而激活机体的补体系统，引起一系列免疫损伤反应，但其具体发病机制尚未能完全阐明。从流行病学角度来看，相比于欧裔，亚裔及西班牙裔人群更易罹患LN且病情更重。当前，狼疮肾炎的一线药物是激素和免疫抑制剂，但对于某些难治性狼疮肾炎患者无效，而且长期使用会造成严重的副作用。因此，寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫。
干细胞是近年来生命科学领域的重大研究热点，它们除了具有自我更新，并在一定条件下分化为特定细胞的能力之外，还有一种重要的能力，即通过自分泌/旁分泌的方式，可以起到免疫调控的作用，在某种程度上也属于一种免疫细胞，这一显著特点为免疫性疾病的治疗开辟了一个新的领域。间充质干细胞是干细胞领域的研究热点，目前公认其具有免疫调控的作用，可以用来治疗免疫性疾病。目前已经有动物实验和临床应用证实，来源于骨髓、脐带等的间充质干细胞可以通过免疫调控延缓狼疮肾炎的进展，但是使用骨髓、脂肪等间充质干细胞治疗疾病有两个不容忽视的缺陷：一是间充质干细胞取材时会对供体造成不同程度的损伤；二是间充质干细胞的数量、增殖和分化能力会随着供体的年龄增加而下降。
羊水干细胞因其来源广泛，分离操作简单，低免疫原性的特点，受到研究者的重视，目前已有研究报道羊水干细胞在治疗神经系统、心血管系统、泌尿系统的多种疾病中取得了进展；同时，Hauser等通过对急性肾损伤模型的研究发现，羊水干细胞移植可以提高急性肾损伤后肾脏的自我修复能力[Hauser P V,De Fazio R,Bruno S,et al.Stem cellsderived from human amniotic fluid contribute to acute kidney injury recovery[J].The American journal of pathology,2010,177(4):2011-21.]。但是，羊水干细胞能否对狼疮肾炎起到治疗作用目前仍未可知。
发明内容
本发明的一个目的在于提供羊水干细胞的新应用，具体包括其在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用。
本发明成功从人孕中期羊水中分离、培养并鉴定了羊水干细胞，且发现羊水干细胞治疗可以降低狼疮小鼠尿蛋白水平，改善其肾脏病理损伤，减少促炎因子(IL-17、IL-12p40)产生，增加抑炎因子(IL-1ra)产生，证明羊水干细胞治疗狼疮肾炎有效。本发明进一步发现羊水干细胞治疗通过下调促炎性的M1型巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞，上调抑炎性Th2细胞的机制，明显减轻狼疮肾炎病理损伤，有效治疗狼疮性肾炎。
从而，一方面，本发明提供了羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了羊水干细胞在制备治疗系统性红斑狼疮的药物中的应用。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞具有向脂肪细胞和/或骨细胞分化的能力。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞MHCⅠ类分子HLA-ABC阳性，MHCⅡ类分子HLA-DR阴性。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞来自人孕中期的羊水。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞是通过差异性贴壁和机械分离法分离获得。在本发明的一些具体实施方案中，通过差异性贴壁和机械分离法分离孕中期羊水中的羊水干细胞，羊水干细胞分离顺利，经3次左右细胞刮刀刮除上皮样细胞集落后，得到形态均一的成纤维样细胞，呈放射状排列，排列紧密。在合适的条件下能够被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞，且流式细胞术检测其表面标志物结果证明其表达间充质干细胞标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD105)和多能干细胞标志物(SSEA-4)，不表达造血干细胞标志物(CD34、CD45、CD133)，且不表达MHCⅡ类抗原HLA-DR证明其具有低免疫原性。
根据本发明具体的实施方案，本发明所述的羊水干细胞能降低狼疮小鼠尿蛋白水平，改善狼疮个体肾脏病理损伤。即，本发明中的药物用于降低狼疮个体尿蛋白水平，改善狼疮个体肾脏病理损伤。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞能够下调促炎因子IL-17、IL-12p40的表达；上调抑炎因子IL-1ra的表达。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞能够下调促炎性的M1型巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞。
M1型巨噬细胞为促炎型，分泌促炎因子IL-6、IL-1β等。在狼疮肾炎患者肾脏中M1型巨噬细胞浸润的比例比正常人显著增高。树突状细胞能浸润至肾脏进行抗原递呈，引起淋巴细胞活化并放大炎症表现；嗜酸性粒细胞是免疫反应炎症中极为重要的细胞，可以释放颗粒中的内容引起组织损伤并促进炎症进展。
根据本发明具体的实施方案，本发明中的羊水干细胞能够上调抑炎性的Th2细胞。Th2细胞属于抑炎细胞，分泌抑炎因子(IL-4、IL-10)。
在本发明的一些具体实施方案中，采用本发明的羊水干细胞治疗后，与CON组相比，AF组和UC组24小时尿蛋白下降(P＜0.05)；镜下观察PAS染色肾脏组织形态学表现，CON组主要表现为弥漫性系膜增生、基底膜增厚并伴有肾小球硬化，肾间质炎症浸润及纤维化程度较重。与CON组相比，AF组和UC组病理结果显示肾小球系膜增殖减轻，且间质炎细胞浸润及纤维化程度较轻。蛋白芯片筛选出AF组和CON组有差异的蛋白共22个，14个治疗后上调，8个治疗后下调，其中，促炎因子IL-17、IL-12p40下调，抑炎因子IL-1ra上调。
在本发明的一些具体实施方案中，通过质谱流式细胞技术，采用42个marker将MRL/lpr小鼠肾脏免疫细胞分成22个亚群。从22个免疫细胞亚群变化来看，羊水干细胞组和模型对照组差异显著的亚群有7个。采用本发明的羊水干细胞治疗后，与模型对照组相比，羊水干细胞组促炎性的M1型巨噬细胞(亚群3)占比下降，起到抗原递呈作用的树突状细胞(亚群6)占比下降，反映炎症状态的嗜酸性粒细胞(亚群9)占比下降，抑炎性Th2细胞(亚群16)占比升高。结果表明羊水干细胞治疗后，狼疮小鼠肾脏的炎症状态有所改善。从主要免疫细胞类型占比变化来看，在干细胞治疗后，CD4+T细胞、CD8+T细胞均有升高趋势，各髓系细胞(包括DC、单核巨噬细胞、MDSC及嗜酸性粒细胞)均呈下降趋势。在这些变化中，CD4+T细胞在羊水干细胞组与在模型对照组相比显著升高，其余变化无显著性。
此外，本发明提供了一种羊水干细胞制品，其中，所述羊水干细胞MHCⅠ类分子HLA-ABC阳性，MHCⅡ类分子HLA-DR阴性；表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和SSEA-4，不表达CD34、CD45、CD133。本发明中，某因子或标志物表达“阳性”或“表达”是指表达率在70％以上，优选在80％以上，更优选在90％以上；某因子或标志物表达“阴性”或“不表达”是指表达率在5％以下，优选在3％以下，更优选在1％以下。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的羊水干细胞制品，其中羊水干细胞CD34表达率在1％以下，优选在0.5％以下；CD45表达率在3％以下，优选在2.5％以下；CD133表达率在1％以下，优选在0.5％以下；CD29表达率在90％以上，优选95％以上；CD44表达率在95％以上，优选99％以上；CD73表达率在95％以上，优选99％以上；CD90表达率在95％以上，优选99％以上；CD105表达率在90％以上，优选95％以上；HLA-ABC表达率在90％以上，优选95％以上；HLA-DR表达率在1％以下，优选在0.5％以下；SSEA-4表达率在70％以上，优选80％以上。
根据本发明的一些具体实施方案，所述羊水干细胞制品是通过差异性贴壁和机械分离法分离获得的。在本发明的一些更具体实施方案中，所述羊水干细胞制品是按照以下方法制备得到的：对人孕中期羊水进行过滤除去比较大的组织碎片，然后离心收集细胞沉淀，再用完全培养基(DMEM/F12培养基内含20％的FBS，1％的青链霉素和10ng/ml的bFGF)重悬细胞，于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中培养到有散在的贴壁细胞出现，换新鲜的完全培养基，贴壁细胞继续培养至贴壁细胞呈集落样生长，刮除上皮样细胞集落，培养成纤维样细胞。得到的细胞集落形态基本均一的成纤维样细胞即为所述的羊水干细胞制品，可进一步传代、扩增，冷冻保存。
综上所述，本发明成功从人孕中期羊水中分离、培养并鉴定了羊水干细胞，且羊水干细胞治疗可以降低狼疮小鼠尿蛋白水平，改善其肾脏病理损伤，减少促炎因子IL-17、IL-12p40产生，增加抑炎因子IL-1ra产生，证明羊水干细胞治疗狼疮肾炎有效。羊水干细胞治疗通过下调促炎性的M1型巨噬细胞、树突状细胞和嗜酸性粒细胞，上调抑炎性Th2细胞的机制，明显减轻狼疮肾炎病理损伤，有效治疗狼疮性肾炎。与胚胎干细胞和成体间充质干细胞相比，羊水干细胞具有以下优势：(1)易获取，无伦理纠纷：可以在产前诊断时通过羊膜穿刺术获取，对母体及胎儿的损伤很小，同时也避免了使用胚胎干细胞出现的伦理问题；(2)体外培养简单迅速：体外扩增十分迅速，24-48小时即可完成一次克隆；(3)诱导分化能力强：羊水干细胞来源于胎儿及其附属物，具有向内、中、外三个胚层分化的能力，可被诱导分化为多种细胞；(4)免疫原性低：不表达或弱表达MHCII类分子，可以避免降低机体发生免疫排斥的几率。本发明为狼疮肾炎和系统性红斑狼疮这两种疾病的治疗提供了新的治疗策略。
附图说明
图1A-图1C显示羊水干细胞分离、培养、传代结果。其中图1A为原代羊水细胞图；图1B为第2代羊水干细胞图；图1C为第5代羊水干细胞图。
图2显示第5代羊水干细胞表面标志物的表达。其中，以下分子的阳性表达率分别为CD34 0.1％、CD45 2.1％、CD133 0.3％、CD29 98.5％、CD44 99.7％、CD73 99.8％、CD9099.2％、CD105 97.7％、HLA-ABC 97.8％、HLA-DR 0.1％、SSEA-4 82.6％。
图3A与图3B显示羊水干细胞分化潜能的鉴定结果。其中，图3A为羊水干细胞的成脂分化结果，图3B为羊水干细胞成骨分化结果。
图4A-图4C为肾脏病理PAS染色图。其中，图4A为CON组；图4B为AF组；图4C为UC组。
图5为MRL/lpr小鼠尿蛋白水平变化曲线图。
图6为差异蛋白火山图。其中，红点FALSE代表无差异的蛋白，蓝点TRUE代表有差异的蛋白，入选标准是P＜0.05，差异倍数(foldchange)＞1.2或＜0.83。
图7为差异蛋白的热图。其中，X1、X2、X3代表A组的3个样本，X4、X5、X6代表B组的3个样本，红色代表上调，蓝色代表下调。
图8A-图8C为42个marker将三组小鼠肾脏免疫细胞分为22个亚群(热图)。其中，图8A：模型对照组；图8B：羊水干细胞组：图8C：脐带间充质干细胞组。
图9A-图9C显示42个marker将三组小鼠肾脏免疫细胞分为22个亚群(viSNE)。其中，图9A：模型对照组；图9B：羊水干细胞组：图9C：脐带间充质干细胞组。不同颜色代表不同亚群，不同散点致密度代表每个细胞亚群所占的细胞数量。
图10为22个免疫细胞亚群在三组间的占比差异图。
图11为羊水干细胞组与模型对照组之间差异显著的7个亚群。
图12A-图12D为三组间主要免疫细胞亚群的差异，其中，图12A：模型对照组，图12B：羊水干细胞组，图12C：脐带间充质干细胞组，图12D：三组间定量比较。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例中未详细说明的方法，按照所属领域中的常规方法进行，或按照仪器厂商建议的操作条件进行。
实施例1、羊水干细胞的分选、培养与鉴定
本实验中，通过差异性贴壁和机械性分离的方法，分选纯化孕中期羊水中的羊水干细胞，然后采用流式细胞术检测表面抗体和成脂成骨诱导分化的方法鉴定羊水干细胞，以便下一步利用羊水干细胞进行研究。
1.1实验材料
1.1.1实验样本
人孕中期羊水样本来源于中国人民解放军总医院妇产科，其是在排除胎儿畸形和母体疾病的基础上，于孕中期(指孕14周至孕27周末)行羊膜穿刺术抽取10至15ml采集获得的，羊水样本的采集经患者和家属知情同意和医院伦理委员会批准。
1.1.2实验试剂
DMEM/F12培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(以色列BI)；人bFGF细胞因子(美国Peprotech)；0.25％胰酶(美国Sigma-Aldrich)；二甲亚砜(DMSO)(美国Sigma-Aldrich)；青链霉素混合液(美国Hyclone)；CD29-APC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD90-PE小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；SSEA-4小鼠单克隆抗体(美国MiltenyiBiotec)；CD133-PE小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD73-PE小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；HLA-DR-PE小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；HLA-ABC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD105-FITC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD34-APC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD44-FITC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；CD45-FITC小鼠单克隆抗体(美国Miltenyi Biotec)；基因工程重组抗体PE-IgG同型对照(美国Miltenyi Biotec)；基因工程重组抗体FITC-IgG同型对照(美国Miltenyi Biotec)；基因工程重组抗体PC7-IgG同型对照(美国Miltenyi Biotec)；基因工程重组抗体APC-IgG同型对照(美国Miltenyi Biotec)；间质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒(中国Cyagen)；间质干细胞成脂诱导分化培养基试剂盒(中国Cyagen)。
1.2实验方法
1.2.1羊水干细胞的收集、培养和纯化
(1)取羊水样本10-15ml先用无菌200目滤纱进行过滤，这样可以除去比较大的组织碎片；
(2)将羊水样本移入15ml离心管，然后在室温下以1500rpm/min的转速离心10分钟，弃上清，收集细胞沉淀；
(3)弹松细胞后，向细胞中加入10ml完全培养基(DMEM/F12培养基内含20％的FBS，1％的青链霉素和10ng/ml的bFGF)重悬细胞；
(4)吹打混匀后，均匀接种至100mm培养皿中，于饱和湿度、37℃、5％CO2培养箱中进行培养；
(5)原代羊水细胞培养7天后，镜下观察到有散在的贴壁细胞出现，进行第一次换液，用移液枪吸除去含有未贴壁的细胞和杂质的培养液，换10ml新鲜的完全培养基(DMEM/F12培养基内含20％的FBS，1％的青链霉素和10ng/ml的bFGF)；
(6)贴壁细胞继续培养3天后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，贴壁细胞呈集落样生长，可见贴壁细胞集落中有两种不同的形态，一种为上皮样细胞，一种为成纤维样细胞，在培养皿底部用黑色记号笔标记出成纤维样细胞集落的生长范围，然后用无菌细胞刮刀在标定区域以外反复刮除上皮样细胞集落，接下来用含青霉素及链霉素的PBS溶液冲洗3次(注意不要把标定区域里面的细胞团冲掉)，再向培养皿中添加10ml完全培养基继续培养；
(7)以后每3天换液，当再次观察到有上皮样细胞集落出现时，重复上述操作；
(8)经过3次左右细胞刮刀刮除之后，上皮样细胞集落基本被完全刮除，只剩下一些散在的上皮样细胞，其余细胞集落形态均一，成纤维样，呈漩涡状排列，即得到初步纯化的成纤维样细胞。
1.2.2.羊水细胞的传代与扩增
(1)待成纤维样细胞生长至80％融合时，按1：3的比例传代；
(2)弃上清，加入1.5ml的0.25％胰酶消化细胞，于37℃培养箱中消化约1.5分钟；
(3)于倒置相差显微镜下观察，发现培养皿上的细胞团出现胞质回缩、细胞间隙变大，加入1.5ml完全培养基(DMEM/F12培养基内含20％的FBS，1％的青链霉素和10ng/ml的bFGF)终止消化；
(4)吹打细胞至完全松散脱落，用移液枪移入15ml离心管中；
(5)在室温下以1300rpm/min的转速离心5分钟，弃上清，弹松细胞；
(6)加入完全培养基，吹打混匀后将单细胞悬液接种到100mm培养皿中继续培养；
(7)根据细胞群落的生长速度，当细胞生长至80％融合时继续传代，每2-3天传代一次，操作同上。
1.2.3羊水干细胞的冻存与复苏
(1)弃上清，加入1.5ml的0.25％胰酶消化细胞，于37℃培养箱中消化约1.5分钟；
(2)于倒置相差显微镜下观察，发现培养皿上的细胞团出现胞质回缩、细胞间隙变大，加入1.5ml完全培养基(DMEM/F12培养基内含20％的FBS，1％的青链霉素和10ng/ml的bFGF)终止消化；
(3)在室温下以1300rpm/min的转速离心5分钟，弃上清，弹松细胞；
(4)向沉淀中加入1ml冻存液(90％FBS+10％DMSO)，吹打混匀后移入冻存管，封口并做好标记；
(5)首先放入4℃冰箱保存半小时，然后将其放入程序性降温盒中，置于-20℃保存2小时，再移入-80℃超低温冰箱长期保存；
(6)复苏细胞时速度要快，遵从“慢冻速溶”的原则，取出待复苏的细胞后直接置于37°恒温水浴锅中，观察到细胞完全融化后立即取出；
(7)将细胞悬液移入含有9ml不完全培养基(无FBS)的离心管中，吹打混匀后，以1300rpm/min的转速离心5分钟；
(8)弃上清，弹松细胞，加入10ml完全培养基重悬细胞，接种到100mm培养皿继续培养。
1.2.4流式细胞术检测羊水干细胞表面标志物
(1)取第5代羊水干细胞，用0.25％胰酶消化细胞后加入完全培养基终止，移入15ml离心管后离心收集细胞(1300rpm/min，5分钟)；
(2)用无菌PBS离心洗涤细胞(1300rpm/min，5分钟)3遍，最后一次洗涤后，留取约100μl上清液，重悬细胞；
(3)调整细胞浓度在1×106-107之间，置于流式管中；
(4)以下步骤在避光处操作：分别向细胞悬液中加入5μl荧光标记抗体(CD29、CD33、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133、SSEA-4、HLA-ABC、HLA-DR、PE-IgG同型对照、APC-IgG同型对照、PC7-IgG同型对照、FITC-IgG同型对照)，室温避光处孵育30min；
(5)用无菌PBS溶液洗涤(1300rpm/min，5分钟)2遍，然后补入300μl PBS溶液重悬细胞，上流式细胞仪进行检测。
1.2.5检测羊水干细胞分化潜能
向脂肪细胞诱导分化
(1)按照OriCell Blb/c小鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司，货号MUCMX-90031)的说明，配置成脂诱导分化培养基A液和B液；
(2)取生长状态良好的第5代羊水干细胞，当细胞融合至80％时，胰酶消化收集细胞，调整细胞悬液的浓度，按照1×106/ml浓度均匀接种至6孔板上；
(3)6孔板每孔加入2ml完全培养基，将6孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
(4)3天换1次液，当孔内细胞生长至100％融合或过融合的时候，弃上清，向孔中加入2ml A液，诱导3天后，吸走A液，加入2ml B液，于24h后吸走B液，再次加入A液继续诱导培养；
(5)A液与B液交替培养5次左右，继续用B液维持培养4-7天，每2-3天换新鲜B液，每天进行镜下观察，当脂滴变得大而圆时结束诱导；
(6)弃上清，用PBS溶液轻轻冲洗两次，然后在每孔中加入油红O染液1ml，染色半小时后吸走染液，用PBS溶液洗涤3次后镜下观察。
向骨细胞诱导分化
(1)按照OriCell Blb/c小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司，货号MUCMX-90021)试剂盒的说明，配置成骨诱导分化完全培养基；
(2)取生长状态良好的第5代羊水干细胞，当细胞融合至80％时，胰酶消化收集细胞，调整细胞悬液的浓度，按照1×106/ml浓度均匀接种于事先包被0.1％明胶的6孔板上；
(3)6孔板每孔中加入2ml完全培养基，将细胞置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
(4)3天换1次液，待细胞生长融合至70％左右时，弃上清，向孔中加入2ml成骨诱导分化完全培养基；
(5)每隔3天换1次液，诱导培养20天左右；
(6)观察细胞形态变化及生长情况，弃上清，用PBS溶液洗涤2次，每孔中加入2ml的4％多聚甲醛溶液，孵育30min后吸走固定液，用PBS溶液洗2次，然后在每孔中加入1ml茜素红染液，染色3-5min，弃上清，用PBS洗涤2次后镜下观察。
1.3实验结果
1.3.1羊水干细胞的形态学观察
刚从羊水中分离接种到培养皿上的原代羊水细胞有很多不同的形态，其中也存在一些杂质，包括梭形、圆形、条状、不规则状等(如图1A所示)，培养3天左右时，可见单个的贴壁细胞散落分布在培养皿底部，平均每个培养皿中有3-5个左右(也有的培养皿中无任何贴壁细胞)(如图1B所示)。经过3次左右用细胞刮刀刮除上皮样细胞群落之后，培养至第15天左右时，95％以上的细胞都为成纤维样，形态基本均一，在培养皿中呈旋涡状或放射状排列，细胞排列紧密，从而得到初步纯化的细胞(如图1C所示)。虽然其中还有少量上皮样细胞混杂在其中，但是经过传代3-4次之后基本消失。传代培养后的成纤维样细胞生长非常旺盛，形态稳定，多次传代而细胞形态无明显变化。本结果可初步认为，分离培养的细胞是羊水干细胞。
1.3.2羊水干细胞表面标志物的鉴定
流式细胞术检测细胞表面标志物的结果表明，本发明分离培养的细胞表达间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45、CD133，表达多能干细胞标志物SSEA-4，表达MHCⅠ类分子HLA-ABC而不表达MHCⅡ类分子HLA-DR(图2)，证明分离的细胞具有低免疫原性，免疫原性低表示此细胞在进行细胞移植时一般不会发生较严重的排斥反应，比较适合进行体内移植治疗疾病。流式细胞术的结果，进一步证明了本实验中分离的成纤维样细胞为羊水干细胞。
1.3.3羊水干细胞分化潜能的鉴定
对第5代羊水干细胞向脂肪细胞定向诱导分化，羊水干细胞在经过A、B液交替诱导和B液维持培养后，镜下观察可以见到脂滴大而圆，油红O染色后脂滴被染成粉红色(图3A)，证明羊水干细胞被诱导分化为脂肪细胞。
对第5代羊水干细胞向骨细胞定向诱导分化，经过成骨诱导液诱导培养20天后，茜红素染液染色后，可见大量橘红色矿化结节形成(钙盐沉积)(图3B)，证明羊水干细胞被诱导分化为骨细胞。
结合细胞形态学表现、细胞表面标志物的鉴定结果以及细胞诱导分化能力的测定结果，可以确定本实验中分离培养的细胞即为羊水干细胞，细胞分离培养成功，可以用来进行下一步实验。
实施例2、羊水干细胞治疗狼疮肾炎的体内有效性研究
2.1实验材料
2.1.1实验动物
3-4周龄雌性狼疮肾炎小鼠(MRL/lpr)小鼠30只，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养条件：SPF级，室温26℃，相对湿度50％，恒温恒湿，光照和黑暗12小时交替一次，小鼠在饲养笼内自由摄食摄水，每3天更换垫料。本实验通过医院伦理委员会审查。
2.1.2实验试剂
1％过碘酸、Schiff氏液、苏木素染液、氨水、二甲苯、酒精、脐带间充质干细胞(天津国家干细胞中心)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天)、GSM-CAA-4000试剂盒(试剂盒包含内容见下表1)：
表1
2.2实验方法
2.2.1动物分组、干细胞治疗
(1)30只MRL/lpr小鼠随机分为3组，每组10只；
(2)第一组分别于第16、18周每只小鼠、每次通过尾静脉注射第5代羊水干细胞1×106个/0.5ml，后称AF组(羊水干细胞组，Amniotic)(n＝10)；
(3)第二组分别于第16、18周每只小鼠、每次通过尾静脉注射脐带干细胞1×106个/0.5ml，后称UC组(脐带干细胞组，Umbilical)(n＝10)；
(4)第三组分别于第16、18周每只小鼠、每次通过尾静脉注射生理盐水0.5ml，后称CON组(模型组，Model)(n＝10)。
2.2.2肾脏取材、固定、包埋及切片
肾脏取材及固定：在第20周时，小鼠麻醉后，全身用75％酒精消毒，然后沿腹部正中线剪开腹部皮肤，分离出两侧肾脏组织，用镊子轻轻撕去肾脏表面的被膜，然后切下肾脏的上下两极，将其置于4％的多聚甲醛溶液中固定48小时，注意全程冰上操作，动作要快。每个肾脏切下一块肾组织后，用组织剪将其剪碎成小粒状，置于液氮中迅速冻实，然后置于冻存管中做好标记，置于-80℃超低温冰箱长期保存。
肾组织脱水包埋及切片：
(1)肾组织在4％的多聚甲醛溶液中固定至少48小时；
(2)取出肾组织后依次浸入75％、85％、95％、100％浓度的乙醇中脱水，每梯度2次，每次30min；
(3)接下来浸入二甲苯中透明40min；
(4)浸入事先融化的蜡中2小时；
(5)取出后室温通风晾干24小时；
(6)提前2小时打开包埋机预热，进行石蜡包埋；
(7)包埋后的石蜡块置于-20℃冰箱冷冻半小时后取下；
(8)室温下可长期保存；
(9)石蜡块置于冷台上预冷，进行切片，可长期保存。
2.2.3 PAS染色评估小鼠肾脏病理损伤
(1)将石蜡切片依次浸入二甲苯和梯度乙醇中脱蜡，顺序为二甲苯溶液第一次20分钟、二甲苯溶液第二次20分钟、100％乙醇20分钟、95％乙醇20分钟、85％乙醇20分钟、75％乙醇20分钟、去离子水5分钟；
(2)浸入1％的过碘酸溶液氧化25-30分钟，水洗数秒；
(3)浸入Schiff氏溶液染色30分钟；
(4)浸入温水中浸泡30分钟；
(5)苏木素溶液染色1-2分钟，水洗数秒；
(6)1％的盐酸乙醇溶液分化数秒，水洗数秒；
(7)氨水返蓝数秒后用流水冲洗；
(8)镜下观察细胞核成蓝色，基底膜染成粉红色；
(9)完成染色后的切片依次浸入梯度乙醇和二甲苯溶液中脱水透明，顺序为75％乙醇10分钟、85％乙醇10分钟、95％乙醇10分钟、100％乙醇10分钟、二甲苯溶液第一次10分钟、二甲苯溶液第二次10分钟；
(10)中性树胶封片后，镜下观察。
2.2.4 ELISA法检测小鼠尿蛋白
(1)样本收集：分别于第16、18、20周，用代谢笼收集小鼠的24小时尿液，在4℃条件下，1500rpm/min，离心40分钟，取上清，记录尿液体积，分装至EP管中-80℃超低温冰箱中保存，注意不要反复冻融；
(2)按试剂盒说明书配置蛋白标准品；
(3)配置BCA工作液，4℃条件下，BCA工作液可稳定保存24小时；
(4)待测样本稀释300倍；
(5)96孔板中加入BCA工作液，每孔200μl；
(6)分别将蛋白标准品和待测样品加入相应的孔中，每个样品设两个复孔；
(7)然后将96孔板37℃恒温孵育30分钟；
(8)用多功能酶标仪检测每个孔在570nm波长下的吸光度，拟合标准曲线，计算待测样本蛋白浓度。
2.2.5蛋白芯片技术检测小鼠肾脏组织炎症因子
待测样品准备：
组织裂解：
(1)用双蒸水将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用；
(2)配置蛋白酶抑制剂：将装着蛋白酶抑制剂的小管简单离心，然后加入60μL稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂；
(3)按10μl蛋白酶抑制剂，990μL的1X Cell Lysis Buffer的比例进行裂解液配制；
(4)向每个组织中加入上述裂解液；
(5)将其置于冰上裂解30min，每隔5分钟震荡一次；
(6)离心：13000rpm/min，20分钟，取上清。
蛋白浓度测定：
(1)配置BCA标准液
取9个干净的离心管，分别标记为A、B、C、D、E、F、G、H、I，分别向B、C、D、E、F、G、H、I中加入125μL、325μL、175μL、325μL、325μL、325μL、400μL、400μL pH为8.0的PBS溶液。取试剂盒中BSA标准品储存液，向A、B、C管中分别加入300μL、375μL、325μL，混匀后即浓度为2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL的标准品。抽取B管中的标准品175μL加入D管中，混匀后得750μg/mL的标准品D,抽取C管中的标准品325μL加入E管中，混匀后得500μg/mL的标准品E,抽取E管中的标准品325μL加入F管中，混匀后得250μg/mL的标准品F,抽取F管中的标准品325μL加入G管中，混匀后得125μg/mL的标准品G,抽取G管中的标准品100μL加入H管中，混匀后得25μg/mL的标准品H，I管蛋白质浓度为0。
标准品系列稀释如下表2所示：
表2
(2)配置BCA工作液
首先计算所需要的总BCA工作液体积：
总BCA工作液体积＝(标准品+待测样品)×重复孔数×200μL
配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(A:B＝50:1),充分混匀。注意：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。
(3)上机检测
各取10μL标准品或者待测样品加入微孔板中：
a.每孔加入200μL BCA工作液，轻微震荡充分混匀，37℃放置30min。
b.冷却到室温，在酶标仪上的540～595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。
c.根据BSA标准品的吸光度，绘制标准曲线。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白质浓度。
测定结果如下表3：
表3
按500μg/ml的终浓度上样
玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
芯片操作：
(1)每个孔中加100μl的样品稀释液(样品蛋白终浓度为500μg/ml)，室温摇床上孵育1h，封闭定量抗体芯片；
(2)抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育；
(3)清洗：使用Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μL的1×洗液I，清洗10次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II；
(4)检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时；
(5)清洗，步骤同(3)；
(6)Cy3-链霉亲和素的孵育：离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时；
(7)清洗，步骤同(3)；
(8)荧光检测：首先将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面，然后采用InnoScan 300激光扫描仪扫描信号，选用Cy3或绿色通道(激发频率532nm)，采用GSM-CAA-4000的数据分析软件来进行数据分析。
2.2.6统计分析
数据统计分析及作图均使用Graphpad Prism 8.0，多组数据间差异分析及多重比较应用单因素方差分析(ANOVA)，当P＜0.05时，数据间的差异被认为具有统计学意义，且0.01≤P＜0.05时，用“*”表示，P＜0.01时，用“**”表示。
2.3实验结果
2.3.1干细胞治疗后MRL/lpr小鼠肾脏组织形态学改变
光镜下观察PAS染色肾脏组织形态学表现，CON组主要表现为弥漫性系膜增生、基底膜增厚并伴有肾小球硬化，肾间质炎症浸润及纤维化程度较重(图4A)。与CON组相比，AF组和UC组病理结果显示肾小球系膜增殖减轻，且间质炎细胞浸润及纤维化程度较轻(图4B、图4C)。
2.3.2干细胞治疗后MRL/lpr小鼠尿蛋白水平的变化
检测3个时间点(第16、18、20周)24小时尿蛋白水平，结果显示，治疗前(第16周)三组小鼠尿蛋白水平无明显差异(P>0.05)，而第18和20周时，AF组和UC组与CON组相比均有明显差异(P<0.05)，CON组24小时尿蛋白水平呈升高趋势，干细胞治疗后尿蛋白水平呈下降趋势。结果表明羊水干细胞和脐带干细胞治疗均能降低狼疮肾炎小鼠尿蛋白水平(图5)。
2.3.3干细胞治疗后MRL/lpr小鼠肾脏组织中炎症因子水平的变化
利用GSM-CAA-4000细胞因子蛋白芯片，检测第20周AF组和CON组200种细胞因子的表达差异，将AF组定义为A组，CON组定义为B组。
表达有差异的蛋白：将P＜0.05，差异倍数(foldchange)＞1.2或＜0.83的蛋白定义为差异蛋白(图6)，共有22种，见图7及表4。结果表明：22个表达有差异的蛋白，分别是LOX-1、Fas L、Nope、BLC、MIG、MMP-2、IL-1ra、CD30L、KC、LIX、TCA-3、TACI、Epigen、EGF、ALK-1、IL-12p40、IL-17、ADAMTS1、MIP-1b、IGFBP-6、Pentraxin 3、SCF。
22个表达有差异的蛋白主要涉及炎症因子和免疫调节相关细胞因子，其中白细胞介素：IL-1ra、IL-12p40、IL-17；金属蛋白酶：MMP-2；生长因子：EGF、IGFBP-6；肿瘤坏死因子受体超受体：TACI；趋化因子：BLC、MIP-1b。
羊水干细胞治疗后上调的蛋白：LOX-1、Fas L、BLC、MIG、MMP-2、IL-1ra、KC、TACI、Epigen、ALK-1、ADAMTS1、MIP-1b、Pentraxin 3、SCF，共14种。其中，干细胞治疗后抑炎因子IL-1ra(白细胞介素-1受体拮抗剂)表达明显上调。
羊水干细胞治疗后下调的蛋白：Nope、CD30L、LIX、TCA-3、EGF、IL-12p40、IL-17、IGFBP-6，共8种。其中，干细胞治疗后促炎因子IL-17及IL-12p40表达水平明显下调。
表4 A、B两组间表达有差异的蛋白
本发明通过对小鼠尿液尿蛋白的检测直接反映小鼠肾功能，结果发现，羊水干细胞移植和脐带间充质干细胞移植均可以改善MRL/lpr小鼠的肾功能：在第16周，三组小鼠的尿蛋白水平无明显差异，而在第18和第20周，AF组和UC组尿蛋白明显低于CON组。本结果说明，与脐带间充质干细胞相同，羊水干细胞治疗对狼疮小鼠同样有效。
本发明采用肾脏PAS染色，观察治疗前后狼疮小鼠肾脏病理的变化，结果发现CON组主要表现为弥漫性系膜增生、基底膜增厚并伴有肾小球硬化，肾间质炎症浸润及纤维化程度较重，与CON组相比，AF组和UC组病理结果显示肾小球系膜增殖减轻，且间质炎细胞浸润及纤维化程度较轻。结果说明，与脐带间充质干细胞相同，羊水干细胞治疗狼疮小鼠也可以在一定程度上改善肾脏结构。
本发明利用蛋白芯片技术检测AF组和CON组的细胞因子表达差异(因脐带间充质干细胞组在本发明中仅作为研究羊水干细胞治疗狼疮肾炎有效性的参考，故此处不做讨论)，共检测200种细胞因子，将P＜0.05，差异倍数(foldchange)＞1.2或＜0.83的蛋白定义为差异蛋白，结果显示共有22种差异蛋白，分别是LOX-1、Fas L、Nope、BLC、MIG、MMP-2、IL-1ra、CD30L、KC、LIX、TCA-3、TACI、Epigen、EGF、ALK-1、IL-12p40、IL-17、ADAMTS1、MIP-1b、IGFBP-6、Pentraxin 3、SCF。其中14种蛋白上调(LOX-1、Fas L、BLC、MIG、MMP-2、IL-1ra、KC、TACI、Epigen、ALK-1、ADAMTS1、MIP-1b、Pentraxin 3、SCF)，8种蛋白下调(Nope、CD30L、LIX、TCA-3、EGF、IL-12p40、IL-17、IGFBP-6)。白介素IL-1家族成员是先天免疫和炎症的中枢介质，在多种免疫性疾病中起关键作用。大多数IL-1家族细胞因子具有促炎作用(如IL-1α、IL-1β等等)，但是IL-1ra具有抗炎作用，有学者报道SLE患者血清IL-1ra下降，本发明用羊水干细胞治疗狼疮小鼠后，检测到IL-1ra升高，从另一方面证明了治疗的有效性。
综上结果分析，可以认为羊水干细胞治疗狼疮肾炎小鼠有效。
实施例3、羊水干细胞在狼疮肾炎中的免疫调控作用及机制
3.1实验材料
3.1.1实验标本
每例样本由2只经过相同处理的MRL/lpr小鼠肾脏混合而成，实验分3组，每组3例样本，共9例样本。其中：CON组3例，AF组3例，UC组3例。
3.1.2实验仪器和设备
Helios质谱流式细胞仪(美国FLUIDIGM公司)
3.1.3实验试剂
42个质谱流式金属同位素耦联的抗体(见表2，用于标记不同细胞亚群(T细胞、B细胞、NK细胞、粒细胞、髓系细胞等)(美国FLUIDIGM)
194Pt(美国FLUIDIGM)、Cisplatin染液(美国FLUIDIGM)、FACS Buffer(美国FLUIDIGM)、Block Solution试剂(美国FLUIDIGM)、Intercalator-Ir染液(美国FLUIDIGM)、Fix and Perm Buffer试剂(美国FLUIDIGM)、10×Permeabilization Buffer试剂(美国FLUIDIGM)、Fixation/Permeabilization Diluent试剂(美国FLUIDIGM)、Fixation/Permeabilization Concentrate试剂(美国FLUIDIGM)。
3.2实验方法
3.2.1肾脏组织消化
(1)将肾脏组织从组织保护液中取出，放入培养皿中；
(2)加入1640基础培养基冲洗组织3遍；
(3)组织称重；
(4)然后用组织剪将肾脏组织剪碎，分成每份重量在0.1-1g之间；
(5)将剪碎的组织放入5mlEP管中，每管加入DMEM溶液177μl(1mg/ml)，LiberaseTM 1250μl(1mg/ml),然后补DMEM溶液至5ml，进行消化；
(6)消化条件：37℃，250rpm/min,消化30min至组织无残留；
(7)使用70μm滤筛把消化结束的液体过滤一遍，用FACS buffer清洗滤筛和消化管，然后进行离心：转速400g，离心10min，弃上清，弹松细胞；
(8)用红细胞裂解液裂解1分钟，离心：400g，5分钟，观察若红细胞未裂解完成需要再裂解一次；
(9)用FACS buffer重悬细胞，取10μL计数，计数共2次，活细胞、死细胞分别计数。
3.2.2质谱流式细胞染色
(1)细胞死活染色：用PBS溶液来配置194Pt死活染液，重悬细胞，置于冰上染色5min，然后用染色缓冲液洗涤两次。
(2)非特异性封闭：使用染色缓冲液配置Fc受体封闭液，重悬细胞，置于冰上封闭20min。
(3)胞外染色：配置胞外染色抗体混合液，加入到含有Fc受体封闭液的细胞样本中，混匀、冰上染色30min后，使用染色缓冲液重悬细胞，离心弃上清后，重复洗涤操作一次。
(4)DNA染色：用固定破膜缓冲液配置DNA染液，重悬细胞，4℃孵育过夜。
(5)胞内染色：样本中加入破膜缓冲液清洗细胞，离心后弃上清，加入固定液，室温固定30分钟后，用破膜缓冲液清洗细胞，使用预先配置的胞内染色抗体混合液重悬细胞，置于冰上染色30min。
(6)样本编码标记：染色缓冲液清洗细胞，离心后弃上清，使用预先配置的编码标记试剂(Barcode)重悬细胞，置于冰上标记20min。
(7)上机前清洗细胞：用染色缓冲液清洗细胞，离心后弃上清，加入去离子水重悬细胞并过滤到流式管中，进行细胞计数。
3.2.3质谱流式细胞仪上机检测
(1)打开Helios质谱流式细胞仪，预热30分钟，然后进入开机程序。
(2)开始调试仪器及质量标准控制。
(3)质控通过后，每个样本取相同细胞数(1×106)混合，并向待测样本加入校准小球。
(4)将各检测通道名称按抗体名称和相耦联的金属同位素名称命名，根据组别的不同给数据命名，设置收集速度(300-500evens/s)及总细胞数(3×105个)，全部设置完毕后，上机收集原始数据，从而进一步分析数据。
3.2.4原始数据的生物信息学分析方法
(1)原始数据预处理及质量控制：采用标准化的方法，对原始数据进行标准化预处理，消除批次效应，从而得到存活的单个免疫细胞数据作下一步分析。
(2)聚类分析：选择上机方案(panel)中指定的信号标记(marker)，采用Xshift聚类算法分析数据，如果数据量过大，可以对数据进行随机降采样的方法处理，这样仍然可以得到真实有效的数据。然后以数据驱动进行聚类分析，从而得到样本的免疫细胞亚群(cluster)的分类。
(3)聚类结果统计学分析及可视化展示：采用基于t分布随机领域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE)的可视化方法，对聚类结果进行降维可视化。最后，根据上述得到的聚类亚群和t-SNE坐标，绘制相应的可视化随机网络嵌入图(visual stochastic network embedding，viSNE)和热图(heatmap)。然后分析各样本中各亚群的百分比(frequency)差异，利用双边t检验的方法分析不同组别间各免疫细胞亚群表达的差异。
3.3实验结果
3.3.1利用质谱流式细胞技术构建MRL/lpr小鼠肾脏的免疫细胞亚群图谱
利用质谱流式细胞技术建立了MRL/lpr小鼠肾脏的免疫细胞亚群图谱，利用42个免疫细胞marker(表5)，将MRL/lpr小鼠肾脏中的免疫细胞聚类分为22个亚群(图8A-图8C、图9A-图9C)，亚群的具体定义见表6。
表5选取的42个免疫细胞marker
表6MRL/lpr小鼠肾脏组织中的免疫细胞亚群及定义
3.3.2干细胞治疗后，22个免疫细胞亚群的占比改变
比较了干细胞治疗后，22个免疫细胞亚群的占比改变(图10)，发现羊水干细胞治疗组与模型对照组之间有7有个差异显著的亚群(图11)，即亚群1、3、4、5、6、9、16。本发明根据这7个亚群的表面marker将其分别定义并分析(表7)。比较了干细胞治疗后，三组主要免疫细胞亚群的改变，发现干细胞治疗后，CD4+T细胞、CD8+T细胞占比增多，树突状细胞、单核巨噬细胞、MDSC、嗜酸性粒细胞占比下降。在这些变化中，CD4+T细胞在羊水干细胞组与在模型对照组相比显著升高，其余变化无显著性(图12A-图12D)。
表7羊水干细胞组与模型对照组之间有差异的7个亚群
本发明利用42个marker将MRL小鼠肾脏免疫细胞分为22个亚群；从22个免疫细胞亚群变化来看，羊水干细胞组和模型对照组差异显著的亚群有7个。与模型对照组相比，羊水干细胞组促炎性的M1型巨噬细胞(亚群3)占比下降，起到抗原递呈作用的树突状细胞(亚群6)占比下降，反映炎症状态的嗜酸性粒细胞(亚群9)占比下降，抑炎性Th2细胞(亚群16)占比升高。结果表明羊水干细胞治疗后，狼疮小鼠肾脏的炎症状态有所改善；从主要免疫细胞类型占比变化来看，在干细胞治疗后，CD4+T细胞、CD8+T细胞均有升高趋势，各髓系细胞(包括DC、单核巨噬细胞、MDSC及嗜酸性粒细胞)均呈下降趋势。在这些变化中，CD4+T细胞在羊水干细胞组与在模型对照组相比显著升高，其余变化无显著性。
