一种透明质酸修饰的载蟾毒灵纳米脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种透明质酸修饰的载蟾毒灵纳米脂质体及 其制备方法和应用。
背景技术
蟾毒灵(BUF)是从中药蟾酥中提取的一种活性较强的蟾蜍二烯内酯类成分，抗癌作 用广泛。Ye M,Guo H,Guo H,et al.(2006)Simultaneous determination ofcytotoxic bufadienolides in the Chinese medicine ChanSu by high-performanceliquid chromatography coupled with photodiode array and mass spectrometrydetections.J Chromatogr B 838(2):86– 95。但是由于BUF的溶解度低，对疾病敏感性弱及对正常组织器官选择性差等缺点，易 导致血管刺激，过敏性休克，热病和窦性心动过缓。这些缺点使其临床应用受到极大挑战。 因此，提高BUF的溶解度与靶向性具有很重要的临床意义。脂质体作为新型药物载体具 有延长药效、降低药物毒性、提高疗效、避免耐药性、改变给药途径等许多优点。此外， 由于实质性肿瘤、炎症组织及高血压血管损伤等部位的毛细血管比正常血管通透性高，这 种特性有利于脂质体进入。Yuan M,QiuY,Zhang L,etal.Targeted delivery oftransferrin and TAT co-modified liposomesencapsulatingbothpaclitaxel and doxorubicin for melanoma[J].Drug Deliv,2015,3:1-13.透明质酸(HA)又名玻璃酸，是一种大分子粘多糖类物质，为水溶性材 料，具有一定的粘度和保水性。Oh EJ,Park K,Kim KS,et al.Target specific and long-actingdelivery of protein,peptide,and nucleotide therapeutics using hyaluronic acidderivatives[J].J Control Release,2010,141(1):2-12.HA可与细胞表面受体CD44特异性结合，Park K,Lee MY,Kim KS,et al.Target specific tumor treatment by VEGFsiRNA complexed with reducible polyethyleneimine-hyaluronic acid conjugate[J].Biomaterials,2010,31(19):5258-5265.因此，表 面经HA修饰的释药系统可靶向递送抗肿瘤药至CD44高表达的肿瘤细胞和组织。Surace C,Arpicco S,
关于本发明一种透明质酸修饰的载蟾毒灵纳米脂质体及其制备方法和应用目前还未见 报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种治疗乳腺癌对DCT耐药的透明质酸 修饰的载蟾毒灵纳米脂质体。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一方面，本发明提供了一种可逆转乳腺癌细胞对多西紫杉醇耐药的透明质酸修饰的载 蟾毒灵纳米脂质体，包括下列重量份比的组分：BUF:HA:LIP＝(1.5-2.5):(0.5-1.5):(45-51)。
优选地，所述的可逆转乳腺癌细胞对多西紫杉醇耐药的透明质酸修饰的载蟾毒灵纳米 脂质体，包括下列重量份比的组分：BUF:HA:LIP＝2:1:48。
另一方面，本发明还提供了一种可逆转乳腺癌细胞对多西紫杉醇耐药的透明质酸修饰 的载蟾毒灵纳米脂质体的制备方法，包括：通过1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC) 和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)制备透明质酸(HA)活化液，将含磷脂酰乙醇胺(DOPE)的 混悬液加至活化液中活化反应，透析除去未反应的DOPE、EDC及其他反应试剂，制备 HA-DOPE。采用薄膜分散法结合超声法制备得到粒径较小，分散均匀的脂质体，通过化学 修饰将透明质酸接入DOPE磷脂中，并采用透析袋法进行纯化，制备得到HA/lip-BUF。 具体地，步骤为：
A.HA-DOPE的制备
称取52mg HA，加入20ml蒸馏水(用0.1mol/L的盐酸溶液调节pH＝4.0)中，在 磁力搅拌器上搅拌过夜，使之充分溶胀并溶解。加入24mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和13.6mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以0.1mol/L盐酸调节pH至4.0，37℃， 500-1000rpm，水浴下活化2-4h。将溶有1mg/mL含磷脂酰乙醇胺(DOPE)乙醇溶液 500-1000μL加入溶胀好的HA溶液中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH为8.6， 37℃，500-1000rpm水浴磁力搅拌24-36h。反应结束后，将反应液加到透析袋中(截留分 子量为2000-3500Da)，以蒸馏水为透析液，室温下于磁力搅拌器上以500-1000rpm的速 率进行搅拌，透析36-48h，每4h换一次透析液，除去多余反应物以及反应副产物。将反 应液冷冻干燥，即得HA-DOPE，-20℃储存备用。
B.HA/lip-BUF的制备
精密称取S10072mg和胆固醇24mg于圆底烧瓶中，加入氯仿10mL和一定量 BUF、HA-DOPE，搅拌10min使之成均匀溶液，30-60℃水浴旋蒸除去氯仿，成均匀透明 薄膜，再加入9mL氯仿和3mL PBS，大力振摇使之混匀，超声5min至形成稳定的W/O 相。30-60℃水浴旋蒸至成絮状，再加入PBS 5mL继续旋转至水化完全(水化1h)，即得 蟾毒灵脂质体。探头超声10-20min，10-30％W，开5-10s，停5s，备用。
本发明是将透明质酸修饰的蟾毒灵用脂质体包封，提高其溶解度及进入血管的通透性， 提高其靶向性，为BUF的临床运用提供可供参考的剂型。
本发明优点在于：
1、本发明采用的载体脂质体，能有延长药效、降低药物毒性、提高疗效、避免耐药性、 增加药物在治疗部位的蓄积量，逆转乳腺癌细胞对DCT的耐药性。
2、本发明采用的载体透明质酸(HA)，HA可与细胞表面受体CD44特异性结合， 增加HA/lip-BUF对肿瘤组织的靶向性。
疗效具体体现在：
(1)通过CCK-8实验检测，结果表明其能明显抑制乳腺癌CD44高表达细胞株的增殖。
(2)通过激光共聚焦实验手段检测，能明显增加BUF在乳腺癌CD44高表达细胞株内的蓄积。
(3)通过Westernblot实验手段检测，表明能明显抑制耐药蛋白ABCB1的表达。
(4)通过流式细胞术检测，能增加乳腺癌耐DCT细胞株对DCT的敏感性，促进其 凋亡，能增加P-gp转运体底物性荧光指示剂Rho-123在乳腺癌耐DCT细胞株内的蓄积。
本发明HA/lip-BUF能逆转乳腺癌耐DCT细胞株的耐药性，增加DCT对乳腺癌耐 DCT裸鼠原位模型的治疗作用。
附图说明
附图1是红外线光谱分析图，其中A为DOPE，B为HA，C为HA-DOPE。
附图2是HA-lip粒径的电镜检测图。
附图3是载药脂质体的包封率测定，其中A为线性回归曲线，B为BUF包封率检测。
附图4是HA-lip/BUF各成分对乳腺癌细胞增殖抑制实验结果，其中A为MDA-MB-231的CCK-8实验结果，B为MDA-MB-468的CCK-8实验结果。
附图5是HA-lip/BUF对MDA-MB-231/DCTR细胞株的耐药蛋白ABCB1表达的影响。
附图6是乳腺癌耐药细胞株MDA-MB-231/DCTR的流式细胞术检测图。
附图7是乳腺癌耐药细胞株MDA-MB-231/DCTR凋亡的定量柱状图。
附图8是Rho-123蓄积实验流式细胞术检测图。
附图9是HA-lip/BUF各成分对乳腺癌耐药细胞株内Rho-123蓄积的影响，其中A为Ctrl组，B为lip组，C为HA/lip组，D为BUF组，E为lip-BUF组，F为HA/lip-BUF 组。
附图10是在HA-lip/BUF干预条件下DCT对乳腺癌耐DCT原位模型的治疗作用。
附图11是乳腺癌耐DCT原位裸鼠模型血液检测指标，其中A为ALP，B为AST， C为BUN，D为ALT。
附图12是乳腺癌耐DCT原位模型心肝脾肺肾切片HE染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
实施例1 HA-DOPE的制备
通过1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)制备透明 质酸(HA)活化液，将含磷脂酰乙醇胺(DOPE)的混悬液加至活化液中活化反应，透析除去未反应的DOPE、EDC及其他反应试剂，制备HA-DOPE。将HA-DOPE冻干粉与 KCl粉按1:100的比例混合研磨均匀，过筛，使其粒度在2.5μm以下，放入锭剂成型器中。 加压(5-10t/cm2)3分钟左右即可得到透明片，上机进行检测。HA、DOPE和HA-DOPE的 红外光谱图如图，在A中1690～1650cm-1的多重峰为HA中C＝O键和酰胺的伸缩振动 峰，B中2910cm-1，1780cm-1，1380.97cm-1为DOPE中长链亚甲基特征吸收峰，1735.44 cm-1为DOPE中酯键的特征吸收峰。C中1690～1650cm-1处为HA-DOPE中酰胺键特征 吸收峰，2940cm-1为DOPE中长链亚甲基特征吸收峰，表明HA-DOPE合成成功。
实施例2 HA/lip-BUF的制备
精密称取S10072mg和胆固醇24mg于圆底烧瓶中，加入氯仿10mL和一定量BUF(和HA-DOPE)，搅拌10min使之成均匀溶液，30-60℃水浴旋蒸除去氯仿，成均匀透明薄膜， 再加入9mL氯仿和3mL PBS，大力振摇使之混匀，超声5min至形成稳定的W/O相。 30-60℃水浴旋蒸至成絮状，再加入PBS 5mL继续旋转至水化完全(水化1h)，既得蟾毒 灵脂质体。探头超声10min，10-30％W，开5-10s，停5s，备用。制备好的脂质体用蒸馏水 稀释至适宜浓度后，用Malvern Zetasizer粒径分析仪来测定脂质体的粒径、PDI。用透射 电镜考察粒子的形貌及大小。结果显示，动态光散射测定得到的lip粒径为159.8nm，HA-lip 粒径为197.2nm，PDI＜0.3，说明粒子分散良好。透射电镜观察显示所制备的脂质体均匀似 球形，脂质膜明显。如图2所示。
实施例3测定载BUF脂质体的包封率
色谱柱：C18 VanGuardPre-column,
首先，取脂质体300μL加入截留分子质量为1×104u的超滤离心管上部，2000-5000r·min-1离心30-40min，使得脂质体被截留在超滤管上部，而未包载的游离药物被离心至超滤管底部。取100μL上部液体加入900μL甲醇，超声破乳，离心取上清，上机测定。 结果如图3所示，以蟾毒灵浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在3.8～ 250.0ng/ml的范围内，BUF浓度(X)与色谱峰面积(Y)线良好，其线性回归方程为： Y＝8.1758X+60.851,r＝0.9994，该曲线可作为BUF定量测定的标准曲线。如图3B所示， 脂质体能够成功将蟾毒灵包裹，其经透明质酸修饰后包封率达85％，能够改善蟾毒灵水溶 性差的缺点。
实施例4检测HA-lip/BUF对乳腺癌细胞株的抑制作用
以CCK-8实验方法检测HA-lip/BUF对乳腺癌细胞株的抑制作用。细胞接种：对数生长期的MCF-7和MD-MB-231细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞密度，以 5000个/孔的密度接种于96孔板中，于37℃，5％CO2的培养箱中孵育过夜。实验分组及 给药：空白对照，细胞Control组，不同浓度游离BUF组，lip/BUF组，HA-lip/BUF组。 继续培养48h后，加入CCK-8溶液，反应1-4h，然后置于多功能酶标仪于450nm处测定 吸光度。实验结果如图4所示：BUF通过制备形成脂质体后，在较低浓度时能够显著提 高药物的细胞杀伤作用，在BUF浓度较低时，HA-lip/BUF对MDA-MB-231细胞的杀伤 作用优于lip/BUF，而对MDA-MB-468细胞抑制作用无显著性差异，以上结果可能与脂质 粒子表面的HA有关，通过HA与CD44受体结合介导其内吞，更多的粒子被摄入到细 胞内，导致其细胞毒性相对增强。
实施例5检测HA-lip/BUF对耐药蛋白ABCB1表达的影响
以Westernblot实验方法检测HA-lip/BUF对耐药蛋白ABCB1表达的影响。
取对数生长的MDA-MB-231和MDA-MB-231耐多西紫杉醇细胞株 (MDA-MB-231/DCTR)种于6孔板中，细胞浓度为10×104个/ml，每孔2ml，24小时 待细胞贴壁后，加入不同浓度的HA-lip/BUF(20nM，50nM)作用48小时后，按全蛋白提取 试剂盒说明书步骤提取总蛋白，在吸光度为562nm处测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后，加 入5×Loading buffer金属水浴锅100℃蛋白质变性10min。凝胶电泳分离总蛋白，每孔 30μg，体积20μl，80V/30min；120V/60min，冰浴条件下将蛋白转膜至活化的NC膜上， 2.5％BSA封闭1h后，置于一抗(1:1000)中4℃孵育过夜。而后用TBST溶液洗膜6min ×3次，用二抗在室温下继续孵育1h，TBST溶液洗膜6min×3次，采用ECL化学发光试 剂盒显色，拍照。实验结果显示MDA-MB-231/DCTRABCB1蛋白的表达量较高，HA/lip-BUF 能抑制MDA-MB-231/DCTR细胞株中ABCB1蛋白的表达量且呈浓度依赖性。如图5所 示。
实施例6
取对数生长的MDA-MB-231/DCTR种于6孔板中，细胞浓度为10×104个/ml，每孔2ml，24小时待细胞贴壁后，按分组不同，加入含HA/lip-BUF(10nM)、DCT(10nM) 的完全培养基，作用48小时后，收集各组的完全培养基，用不含EDTA的胰酶消化细胞， 每孔500ul，待细胞离壁后，加入原培养基，终止消化。细胞离心，1000rmp，5min，弃上 清，用PBS洗两遍，用1×的Binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为10×105个/ml， 吸取100ul的细胞悬液至5ml的流式专用管中，加入5ul的FITC和PI，温和重悬细胞， 室温避光孵育15min，每管加入400ul的1×Binding buffer，通过流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。实验结果显示，安全浓度(10nM)的HA/lip-BUF 能增加MDA-MB-231/DCTR细胞株对DCT的敏感性，在低浓度的DCT(10nM)条件下， 使MDA-MB-231/DCTR细胞株的凋亡率上升，如图6-9所示。
实施例7
Rho-123为P-gp转运体底物性荧光指示剂，其含量的多少反应了DCT在细胞内的聚积。取对数生长的MCF-7、MCF-7/DCTR、MDA-MB-231、MDA-MB-231/DCTR种于6孔 板中，24小时待细胞贴壁后加不同浓度的DCT和维拉帕米(Ver)，Ver作为阳性对照，48小时后消化收集细胞至离心管，离心弃上清液，PBS洗涤后，调整细胞浓度为10×105个/管，加入浓度为10ug/ml的Rho-123溶液500ul，37℃孵育30min，离心弃上清液，PBS 洗涤后，于激发波长488nm处检测各组的平均荧光强度。每组设3个复孔，实验重复3 次。如图10所示，HA/lip-BUF可浓度依赖性地增加Rho-123在耐药乳腺癌细胞、 MDA-MB-231/DCTR内的蓄积(P<0.05)，而对化疗敏感株MDA-MB-231细胞内的Rho-123 的蓄积没有影响。
实施例8
取对数生长MDA-MB-231、MDA-MB-231/DCTR种于共聚焦培养皿中，细胞密度为10×104个/ml，每皿1ml，24小时待细胞贴壁后加入一样浓度(10nM)的lip、HA/lip、BUF、 lip-buf、HA/lip-BUF继续培养48小时后，弃原培养基，用PBS洗两遍，然后用4％多 聚甲醛在37℃固定细胞10分钟，每皿500ul，10min后，用PBS洗涤3次，加入加 入浓度为10ug/ml的Rho-123溶液500ul，37℃孵育30min，后弃上清，PBS洗两遍， 加入DAPI在37℃孵育10分钟，后用PBS洗两遍，通过共聚焦荧光显微镜(LEICADM IRB；Leica，Wetzlar，德国)检测荧光信号。通过共聚焦显微镜观察BUF、lip、lip-BUF、 HA/lip-BUF对MDA-MB-231/DCT中Rho-123蓄积的影响，反映HA/lip-BUF对细胞内 DCT含量的影响。结果显示，在相同的浓度条件下，HA/lip-BUF能更有效的增加 MDA-MB-231/DCTR细胞内DCT的蓄积。如图11所示。
实施例9
先对裸鼠进行造模，取对数期生长的MDA-MB-231/DCTR细胞，消化离心，调整细胞浓度为2×107个/ml，注射量为100μl/只，注射部位为雌鼠第四对乳房颊脂垫，一周后观察肿瘤形成情况，待瘤体体积大致为100mm3时开始给药。将裸鼠分为六组，分别为Ctrl(blank control)、HA/lip-BUF(0.1mg/kg,t,i.v.,q3d×6)；DCT-L(1mg/kg,t,i.v.,q3d×6)；、DCT- M(4mg/kg,t,i.v.,q3d×6)；、DCT-H(8mg/kg,t,i.v.,q3d×6)；、DCT+HA/lip-BUF(1mg/kg,i.p., q3d×6)plusBUF(0.1mg/kg,i.p.,q3d×6)，给药前称量裸鼠体重，并测量瘤体体积，肿瘤体 积的计算公式为：ab2/2，其中a，b分别代表肿瘤的长径和短径。两周后，将裸鼠眼球取 血，脱椎处死，取肿瘤组织以及肝心脾肺肾进行进一步检查。结果表明，HA/lip-BUF能有 效逆转乳腺癌对DCT的耐药性，在低浓度HA/lip-BUF干预下，DCT对乳腺癌耐药模型的 治疗作用明显增强(图12)，且通过检测裸鼠谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)。可知，HA/Lip-Buf对裸鼠肝肾功能影响较少，DCT中高剂量影响明显。通过心肝脾肺肾组织切片进行HE染色，实验结果证明， HA/lip-BUF组心肝脾肺肾未发生组织形态学改变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本 发明的保护范围。
