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海洋灰平链霉菌HN60在抗细菌方面的应用

2020-10-26 12:18:06

海洋灰平链霉菌HN60在抗细菌方面的应用

　　技术领域

　　本发明属于天然产物开发与利用领域，具体涉及海洋灰平链霉菌HN60在抗细菌方面的应用。

　　背景技术

　　放线菌是产生天然活性物质的重要微生物资源。目前已发现的微生物来源天然产物中约50%来源于放线菌，已发现的天然抗生素中约70%来源于放线菌。随着传统抗生素的广泛使用，细菌的耐药性迅速增加，而从传统的土壤微生物中发现结构新颖的活性化合物却出现了明显的下降趋势。在探索具有生物活性天然产物新来源的过程中，海洋放线菌次级代谢产物的开发和研究成为产生新的抗生素开创新的途径。

　　金黄色葡萄球菌是人类的一种重要的病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌易污染食品，在食品基质中产生肠毒素( 如 SEA、SEB、SEC、SED、SEE）溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶等外毒素，从而引起食物中毒；据卫生局统计2014年，微生物引起食物中毒事件与其他因素所引起的中毒事件相比，中毒人数最多，共3359人，占食物中毒事件总中毒人数的60.4%。金黄色葡萄球菌具有很强的致病性，是人类化脓感染中最常见的病原菌，引起多种感染性疾病，可从皮肤浅表感染，到严重的侵袭性疾病，如肺炎；以及全身感染，如败血症。金黄色葡萄球菌是各种致病菌中最易产生耐药性，而且对多种抗生素都具有抗药性的一种细菌。此外，金黄色葡萄球菌还容易发生变异，使敏感的抗生素也失去敏感性，使治疗无效。

　　产气杆菌广泛分布于自然界以及人和动物肠道中的厌氧芽胞杆菌。是气性坏疽的主要病原菌。产气杆菌致病条件与破伤风梭菌相似。

　　变形杆菌属革兰阴性杆菌，两端钝圆，形态呈明显的多形性，可为杆状、球杆状、球形、丝状等。无荚膜，不形成芽孢。有周身鞭毛，运动活泼。变形菌属于腐败菌，在自然界分布广泛，土壤、污水和动植物中，都可检出，肉制品、水产品和豆制品极易受其感染，而且在一般情况下，被污染的食物感官、性状无明显改变，很容易被人误食。因变形杆菌引起的中毒次数仅少于沙门氏菌属。

　　发明内容

　　为了提供一种新的潜在抗菌物质，本发明提供一种新的灰平链霉菌（Streptomyces griseoplanus），其发酵产物可以较明显地抑制金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌的生长。

　　为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

　　海洋灰平链霉菌HN60在抗细菌方面的应用。

　　进一步地，所述细菌为金黄色葡萄球菌、产气杆菌或变形杆菌。

　　上述两项应用中的靶标菌种选自金黄色葡萄球菌、产气杆菌或变形杆菌。

　　所述海洋放线菌的菌种保藏信息为：

　　保藏时间：2019年11月13日，

　　保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

　　保藏编号：CGMCC No.18948，

　　保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

　　分类命名：Streptomyces griseoplanus。

　　有益效果

　　本发明提供的菌株对于金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌具有明显的抑制作用，抑菌效果显著，具有广阔的应用前景。本发明筛选出的菌株具有旺盛的生长能力，可大批发酵，而且HN60所产抑菌物质在酸性条件下稳定好，具有良好的光照稳定性和遗传稳定性。

　　附图说明

　　图1为菌株HN60的形态图；

　　图2为菌株HN60系统发育分析图；

　　图3为灰平链霉菌HN60对金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌、的抗细菌效果图；HN60对(a)金黄色葡萄球菌的，(b)产气杆菌，(c)变形杆菌的抑菌效果图；

　　图4为灰平链霉菌HN60产抗菌物质物温度稳定性；温度对发酵液抗细菌活性保持率的影响；（a）为温度对发酵液抗金黄色葡萄球菌活性保持率的影响，（b）为温度对发酵液抗产气杆菌活性保持率的影响，（c）为温度对发酵液抗变形杆菌活性保持率的影响；（数据以平均数±标准差呈现，实验进行三次重复，* P＜0.05，** P＜0.01与对照组比较）；

　　图5为灰平链霉菌HN60产抗菌物质物pH稳定性；pH对发酵液抗细菌活性保持率的影响；（a）pH对发酵液抗金黄色葡萄球菌活性保持率的影响，（b）温度对发酵液抗产气杆菌活性保持率的影响，（c）pH对发酵液抗变形杆菌活性保持率的影响；（数据以平均数±标准差呈现，实验进行三次重复，* P＜0.05，** P＜0.01与对照组比较）；

　　图6为灰平链霉菌HN60产抗菌物质物光照稳定性；光照时间对发酵液抗细菌活性保持率的影响；（a）光照时间对发酵液抗金黄色葡萄球菌活性保持率的影响，（b）光照时间对发酵液抗产气杆菌活性保持率的影响，（c）光照时间对发酵液抗变形杆菌活性保持率的影响；（数据以平均数±标准差呈现，实验进行三次重复，* P＜0.05，** P＜0.01与对照组比较）；

　　图7为灰平链霉菌HN60产抗菌物质物遗传稳定性，菌种代数对发酵液抗菌活性保持率的影响，（a）菌种代数对发酵液抗金黄色葡萄球菌活性保持率的影响，（b）菌种代数对发酵液抗产气杆菌活性保持率的影响，（c）菌种代数对发酵液抗变形杆菌活性保持率的影响，（数据以平均数±标准差呈现，实验进行三次重复，* P＜0.05，** P＜0.01与对照组比较）。

　　图8为放线菌素V对金黄色葡萄球菌的影响。

　　图9为放线菌素D对金黄色葡萄球菌的影响。

　　具体实施方式

　　下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

　　实施例1 灰平链霉菌HN60的分离、鉴定

　　1. 目标菌的分离

　　按照以下配方配制培养基，分装、灭菌，备用：

　　高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，琼脂20g，海水1000mL，pH 7.2~7.4；

　　YMG培养基：麦芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，琼脂20g，海水1000mL，pH 7.2~7.4；

　　HVA培养基：腐殖酸 1g，Na2HPO4 0.5g，KCl 1.7g，MgSO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCO3 0.02g，核黄素 0.5mg，硫胺素 0.5mg，维生素B6 0.5mg，烟酸 0.5mg，肌醇 0.5mg，泛酸 0.5mg，生物素 0.25mg，对-氨基苯甲酸0.5mg，琼脂20g，海水1000mL，pH 7.2~7.4；

　　丙酸钠培养基：丙酸钠 4g，酪蛋白 2g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO3 2g，琼脂粉 20g，海水1000mL，pH 7.2~7.4；

　　高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，Mg2SO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，海水1000mL。

　　将取自海南东寨港红树林的土样，称取1 g土样，加入9 mL无菌水中，28℃摇床震荡30 min。取上层土壤悬液进行梯度稀释，分别稀释为10-1~10-3，每一梯度取100 μL分别涂布于高氏一号培养基、YMG培养基、HVA培养基、丙酸钠培养基，所有培养基均在倒制平板前添加25 μg/mL的萘啶酮酸与75 μg/mL的重铬酸钾，以抑制革兰氏阴性细菌和真菌的生长。挑取单菌落做进一步的纯化，分离单菌落所用的培养基为高氏一号培养基；连续进行3次划线以纯化出单一菌落，分离获得75株菌，分别编号为HN1-75。

　　将分离获得的各菌株纯培养，以金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌、大肠杆菌为指示菌采用抑菌圈法进行初筛。初筛结果见表1。

　　表1 放线菌对不同指示菌的抗菌活性

　　选取活性较好的菌株，将纯培养接种于高氏一号液体培养基，28℃、180 r/min摇床培养7d，获得发酵液，将发酵液于10000 r/min离心10min去除菌体，上清液再以金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌、大肠杆菌为指示菌进行复筛，获得对各病原菌效果均较好的菌种HN60。斜面培养基保藏菌株于4℃冰箱中，长期保藏采用甘油管于-20℃冻存。

　　2. 形态鉴定

　　菌株HN60明胶液化、不利用纤维素、水解淀粉、可还原硝酸盐、不可产生 H2S、不可使牛奶凝固或胨化、不产生酪氨酸酶和类黑素。可利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖，不可利用蔗糖、肌醇、甘露醇、果糖。

　　根据菌株HN60菌株形态学（图1）观察。该菌株菌落呈圆形、淡黄色，表面干燥呈凸起状。扫描电镜下观察该菌株菌丝丰富，有分支，无断裂。初步判断菌株HN60属于链霉菌。菌株HN60生理生化实验见表2。

　　表2 菌株 HN60 生理生化实验

　　3. 分子鉴定

　　菌种HN60接种于高氏一号液体培养基，28℃、180 r/min摇床培养7d，获得发酵液，将发酵液于10000 r/min离心10min，获得菌体，使用革兰氏阳性细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取放线菌基因组DNA，采用放线菌16S rDNA 通用引物进行 16S rDNA 序列的扩增。

　　使用以下引物：

　　上游：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO: 2）

　　下游：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’（SEQ ID NO: 3）；

　　以提取的基因组DNA为模板，以上述序列为引物，使用2×Taq PCR Master Mix试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）扩增16S rDNA片段。PCR产物进行测序，其序列如SEQ ID NO: 1所示。经过测序，菌株 HN60 的 16S rDNA 序列长度为 1418 bp，序列通过与 NCBI 的GenBank 比对，选取具有较高同源性的菌株，使用 MEGA 8.0 采用邻接法（neighborjoining，NJ）构建系统发树，结果见图 2。发现菌株 HN60 与灰平链霉菌（Streptomyces griseoplanus）的亲缘关系最为接近，其相似度为 100%，且位于同一族簇。结合形态学分析及生理生化实验，最终确定菌株 HN60为灰平链霉菌。

　　将该灰平链霉菌（Streptomyces griseoplanus）HN60，于2019年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 18948。

　　实施例2 灰平链霉菌HN60的抑菌谱

　　采用牛津杯法测试灰平链霉菌HN60对供试菌株的抗菌活性。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris）、大肠杆菌（Escherichia coli）为供试菌。

　　将灰平链霉菌HN60接种于YMG液体培养基，28℃、180 r/min摇床培养7 d，获得发酵液，将发酵液于10000 r/min离心10min去除菌体，上清液备用。

　　金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、变形杆菌的菌悬液涂布在9cm LB平板上，中央放置无菌牛津杯，吸取200 μL上清液加入牛津杯中。将金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌移至37℃培养箱培养24 h，十字交叉法测定抑菌圈的大小。

　　结果如图3所示，灰平链霉菌HN60发酵液对金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌抑菌圈分别为2.3 cm、2.6 cm、2.5 cm。

　　实施例3 HN60抑菌物质的稳定性研究

　　温度稳定性：发酵液上清液分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中1 h，对照组置于室温下1 h，处理结束后冷却至室温后，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图4，处理温度高于60℃时，处理组与对照组相比出现显著性差异，尤其是发酵液于100℃处理1h后，对金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌的抗菌活性保持率分别为80.36%、85.11%、83.19%。实验结果表明高温可使海洋灰平链霉菌HN60所产抑菌物质活性降低。

　　pH稳定性：将发酵液上清液发别调pH至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13放置于25℃水浴锅中1h，对照组不进行pH调节，置于25℃水浴锅中1h，处理结束后调pH至原发酵液pH，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图5，在pH值极低（2，3）时，处理后的发酵液抗菌活性与对照组相比未出现显著性区别；在pH值极高（11，12，13）时，处理后的发酵液抗菌活性与对照组存在显著区别，对三种指示菌的抗菌活性明显降低。实验结果表明，海洋灰平链霉菌HN60所产抑菌物质在酸性条件下稳定性较好，碱性条件下稳定性较差。

　　光照稳定性：发酵液上清液过0.22 μm过滤除菌，置于光照条件下分别照射1-10天，测定发酵液的抑菌活性，设置3个平行组。通过与对照组比较，确定处理后发酵液抗菌活性是否发生变化。实验结果见图6，随着光照时间的增加，实验组与对照组相比发酵液对金黄色葡萄球菌、产气杆菌、变形杆菌的抗菌活性没有显著性差异，抗菌活性保持率均在90%以上。结果表明，海洋灰平链霉菌HN60所产抗菌物质具有良好的光照稳定性。

　　遗传稳定性：菌株HN60接种于固体YMG培养基上，每隔5 d传代1次，连续培养7代。将每代菌种接种于液体YMG培养基中，30℃、180r/min振荡培养6 d。培养结束发酵上清液测定抑菌活性，设置3个平行组。实验结果见图7，海洋灰平链霉菌HN60的7代菌株经过培养后，发酵液的抗菌效果无显著性差异。结果表明，海洋灰平链霉菌HN60具有良好的遗传稳定性。

　　实施例4 化合物抑菌机理

　　1.最小抑菌浓度测定

　　从发酵液中提取得到化合物放线菌素V、放线菌素D。最小抑菌浓度的测定按照CLSI方法。将活化后的金黄色葡萄球菌接种于LB培养基中，37℃、180 r/min培养4h时使其生长至对数期，并调节菌液使其浓度为106 CFU/mL。每试管中分别加入5 mL菌液，加入放线菌素V、放线菌素D，分别设置药物浓度为50、25、12.5……0.781、0.391、0.195、0.098 μg/mL，37℃培养24h，600nm下测定吸光值，光密度变化值小于0.05的认为是抑制菌体生长的最低浓度，实验结果见表3，结果表明从发酵液中提取得到的化合物放线菌素V、放线菌素D对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.195 μg/mL、0.391 μg/mL。

　　表3 放线菌素V、放线菌素D对金黄色葡萄球菌的MIC值

　　其中，“++”表示菌体明显生长，“+”表示菌体出现生长，“-”表示菌体未生长。

　　2. 对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

　　将活化后的金黄色葡萄球菌接种于LB培养基中，37℃、180 r/min培养4 h时使其生长至对数期，并调节菌液使其浓度为106 CFU/mL。加入药物使其终浓度分别为0、1/4 MIC、1/2MIC、MIC、2 MIC，37℃、180 r/min培养，每隔2h于600 nm下测定吸光值，测24h内数值[49]。设置3组平行实验，实验重复3次。

　　图8为放线菌素V对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，实验结果发现放线菌素V处理的金黄色葡萄球菌的生长和正常情况存在区别，放线菌素V处理组的OD600明显低于对照组，金黄色葡萄球菌生长受抑制程度呈现剂量依赖型。放线菌素V的浓度为1/2MIC时，6 h内可明显抑制金黄色葡萄球菌的生长，浓度为MIC、2MIC时，24 h内完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。实验结果表明，放线菌素V使金黄色葡萄球菌的生长曲线受到抑制。图9为放线菌素D对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，实验结果发现放线菌素D处理的金黄色葡萄球菌的生长和正常情况存在区别。放线菌素D处理组的OD600明显低于对照组，金黄色葡萄球菌生长受抑制程度呈现剂量依赖型。放线菌素D的浓度为1/2MIC时，16 h内可明显抑制金黄色葡萄球菌的生长，浓度为MIC、2MIC时，24 h内金黄色葡萄球菌的生长受到抑制。实验结果表明，放线菌素D使金黄色葡萄球菌的生长曲线受到抑制。

　　<110> 曲阜师范大学

　　<120> 海洋灰平链霉菌HN60在抗细菌方面的应用

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　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

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　　<212> DNA

　　<213> 海洋灰平链霉菌HN60

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