一种β-1,3-葡聚糖及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术和日化产品领域，具体涉及一种β-1,3-葡聚糖及制备方法和应用。
背景技术
β-葡聚糖，是一类广泛存在于微生物、植物和海藻细胞壁的大分子多糖，主链结构由β-1，3-糖苷键β和/或β-1，4糖苷键连接，通常还含有不同比例β-1，6键连接的支链，主要细胞壁以细胞结构成分的形式存在。含有β-1，3-糖苷键的葡聚糖对异体宿主防御系统具有较强的诱导和活化作用。20世纪40年代，Pillemer和Ecker等发现酵母细胞中存在一种免疫刺激作用的活性物质，直到20世纪60年代，这一活性物质才被证实为β-葡聚糖。
现有技术中，β-葡聚糖主要应用在以下三个方面：
1)、在食品工业中的应用
β-葡聚糖具有很高的粘性、持水性、乳化稳定性等性能，在食品工业中常作为增稠剂、持水剂、粘结剂及乳化稳定剂应用于调味料、甜点等食品。由于β-1，3-葡聚糖在人的消化器官中难以被消化，可以作为非卡路里食品添加剂，提供脂肪样口感，研究表明，用β-葡聚糖在肉制品中替代脂肪，它既可提供低脂肉制品滑润、丰厚的口感，又能改善低脂肉制品的脆度、硬度、胶粘性、咀嚼性等质构以及总的可接受性；将β-葡聚糖作为脂肪取代剂及乳化稳定剂应用于蛋黄酱中，不但有效地保持蛋黄酱的乳化稳定性，而且还延长产品的贮存期。另外，β-葡聚糖是无热能的，且能强化纤维素阻止脂类吸收的效力，促进胆固醇排除，增加肠道蠕动，在食品中既可以作为膳食纤维来发挥作用，又是一种优质保健食品添加剂。
2)、在化妆品中的应用
现代科学技术的飞速发展和广泛应用给化妆品行业带来了全新的发展机遇，化妆品已从洁肤、润肤为目的的基础护肤品向延缓衰老、美化肤色为目的的功效型化妆品方向发展。由于β-葡聚糖特有的生物学功能和理化特性如抗氧化、和吸水性能，可产生保湿、延缓衰老和美化肤色等多种功能。研究表明，水溶性β-葡聚糖可降低皮肤暴露于UVA区域时对辐射的敏感性，起防止皮脂中角鲨烯氧化的作用，且因其具有成膜性，还可发挥它的第二皮肤作用，有助于提供给皮肤细胞许多生化活性，如增加皮肤的保湿性并能减弱表面活性剂对皮肤的损伤，并能提高角质层的更新速度和改善皮肤的紧密度。
3)、动物养殖与饲料工业中的应用
β-葡聚糖是一种很好的天然免疫增强剂，能提高机体的非特异性免疫作用，而开发并使用免疫增强剂以提高疫苗免疫效果，是改善动物健康状况的重要途径，在动物养殖与饲料工业中应用相当广泛。研究表明，对鲤鱼进行腹膜腔内注射可溶性β-葡聚糖可显著提高鲤鱼的特异性与非特异性免疫功能。用β-葡聚糖作为抗生素替代物添加于猪、鸡等畜禽日食粮中，能显著提高这些畜禽的体液免疫和细胞免疫功能，并促进畜禽生长，提高饲料价值。
然而，为了让β-葡聚糖有更广阔的应用空间和应用价值，研究人员一直致力于β-葡聚糖的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-1,3-葡聚糖及制备方法和应用。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
本发明提供的一种β-1,3-葡聚糖，其制备包括下述重量份的组分：磷酸二氢钠15-25份、硝酸钾35-45份、硫酸镁3-5份、氯化钙0.1-0.2份、硫酸亚铁0.2-0.3份、硫酸锰0.04-0.08份、菜籽油35-45份、蔗糖580-620份；水16900-17100份；
其制备还包括土壤杆菌ZX09种子液，所述土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:95-105。
进一步的，各组分的重量份分别为：磷酸二氢钠18-22份、硝酸钾38-42份、硫酸镁3.5-4.5份、氯化钙0.12-0.18份、硫酸亚铁0.22-0.28份、硫酸锰0.05-0.07份、菜籽油38-42份、蔗糖590-610份；水16950-17050份；
所述土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:98-102。
进一步的，各组分的重量份分别为：磷酸二氢钠20份、硝酸钾40份、硫酸镁4份、氯化钙0.14份、硫酸亚铁0.25份、硫酸锰0.06份、菜籽油40份、蔗糖600份；水17000份；
所述土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:100。
进一步的，所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里生长后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水190-210份，蛋白胨1.5-2.5份，酵母粉0.8-1.2份，氯化钠1.5-2.5份。
本发明提供的β-1,3-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：
(1)按配比将水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；
(2)将步骤(1)所得的混合溶液的PH值调整至6.5-7.5，然后进行蒸汽灭菌；
(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；
(4)按配比将土壤杆菌ZX09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，调节通气流量至18-22L/min，搅拌转速250-270rpm，发酵温度设置为28-32℃，培养58-62h，发酵完成后得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于水中，加入氢氧化钠和硅藻土混匀，加热至88-92℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明；保留沉淀和滤液；
(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后；保留沉淀；
(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得β-1,3-葡聚糖成品。
进一步的，所述步骤(2)中，蒸汽灭菌是在温度为121℃灭菌25-35min。
本发明首次公开了β-1,3-葡聚糖具有修复口腔粘膜的作用，可用于治疗口腔粘膜的损伤。
具体的本发明公开了β-1,3-葡聚糖在制备修复口腔粘膜损伤药物中的应用。
本发明公开了β-1,3-葡聚糖在制备口腔粘膜抗炎的药物和日化产品中的应用。
本发明公开了β-1,3-葡聚糖在制备促进口腔粘膜组织再生的药物和日化产品中的应用。
本发明公开了β-1,3-葡聚糖在制备促进口腔粘膜伤口愈合的药物和日化产品中的应用。
进一步，所述药物为口服药物或外用药物；所述口服药物的剂型为片剂或胶囊；所述外用药物的剂型为漱剂、喷剂、药膜、气雾剂、膏剂或糊剂，当然也包括一些特殊剂型，如控释剂、缓释剂和靶向制剂。
进一步，所述日化产品为牙膏或漱口水。
进一步的，所述β-1,3-葡聚糖可以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物中包含治疗有效量的β-1,3-葡聚糖。
本发明制备的β-1,3-葡聚糖的结构式为：
其结构通式为：
聚-3)-β-D-吡喃-(l→3)-[β-D-吡喃-(l→3)-β-D-吡喃-]3-(l→3)-α-D-吡喃-(l→3)-α-D-吡喃-(l→葡萄糖
本发明中的β-1,3-葡聚糖修复口腔粘膜的作用机理为：
一方面，β-1,3-葡聚糖可促进口腔黏膜上皮基底细胞层EGF(表皮细胞生长因子)的分泌，维持口腔黏膜上皮的再生与增殖，使溃疡面积减小，缓解口腔黏膜组织的炎症表现，减少淋巴细胞浸润；另一方面，β-1,3-葡聚糖作为一种免疫调节剂，能使淋巴细胞活性明显升高，促进TNF-α、IL-β、IL-2等细胞因子的分泌剂IgA、IgG、IgM抗体的产生，从而发挥抗炎及显著增强免疫的作用。
基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
本发明提供了一种β-1,3-葡聚糖及其制备方法，所制备的β-1,3-葡聚糖可以引入到修复口腔粘膜损伤的治疗中，本发明公开了β-1,3-葡聚糖的新用途，公开了β-1,3-葡聚糖在制备修复口腔粘膜损伤药物和日化产品中的应用；本发明通过实验证实了β-1,3-葡聚糖具有明显的抗炎、促进组织再生和促进伤口愈合的作用，可以表明β-1,3-葡聚糖对口腔粘膜具有修复作用，β-1,3-葡聚糖可以应用在制备修复口腔粘膜损伤的药物和日化产品中，为同类药物和日化产品的开发奠定了一定的基础。
附图说明
为了更清楚地说明本说明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的抗炎作用表型图；
图2为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的抗炎作用(中性粒细胞个数)；
图3为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的炎症消退率；
图4为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生(箭头标记)典型图；
图5为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生长度(像素)；
图6为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生促进作用；
图7为β-1,3-葡聚糖处理后伤口部位色素募集表型图；
图8为供试品处理后血管新生表型图；
图9为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼伤口部位不透光度总和；
图10为β-1,3-葡聚糖处理后对斑马鱼伤口愈合促进作用；
图11为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼新生血管发生率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一、制备实施例：
制备β-1,3-葡聚糖：
实施例1：
1.1组分：
磷酸二氢钠20份、硝酸钾40份、硫酸镁4份、氯化钙0.14份、硫酸亚铁0.25份、硫酸锰0.06份、菜籽油40份、蔗糖600份；水17000份。
土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:100。
所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里，在温度为30℃生长48h后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水200份，蛋白胨2份，酵母粉1份，氯化钠2份。
1.2：制备方法：
包括下述步骤：
(1)按配比将部分水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；所述水的加入量为其总重量的90％；
(2)将步骤(1)所得的混合溶液的PH值调整至7，然后进行蒸汽灭菌(在温度121℃灭菌30min)；
(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；
(4)按配比将土壤杆菌ZX09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，然后通入无菌空气，并调节通气流量至20L/min，搅拌转速260rpm，发酵温度设置为30℃，培养60h，发酵完成后得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于余下的水中，加入氢氧化钠(氢氧化钠的加入量为现有溶液体积的2％)和硅藻土(硅藻土的加入量为现有溶液体积的0.1％)混匀，加热至90℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明；保留沉淀和滤液；
(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后；保留沉淀；
(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得β-1,3-葡聚糖成品。
实施例2：
2.1组分：
磷酸二氢钠25份、硝酸钾45份、硫酸镁3份、氯化钙0.1份、硫酸亚铁0.3份、硫酸锰0.08份、菜籽油35份、蔗糖620份；水16900份。
土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:95。
所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里，在温度为30℃生长48h后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水195份，蛋白胨2.5份，酵母粉1.2份，氯化钠1.2份。
2.2：制备方法：
包括下述步骤：
(1)按配比将部分水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；所述水的加入量为其总重量的90％；
(2)将步骤(1)所得的混合溶液的PH值调整至6.5，然后进行蒸汽灭菌(在温度121℃灭菌25min)；
(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；
(4)按配比将土壤杆菌ZX09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，然后通入无菌空气，并调节通气流量至22L/min，搅拌转速270rpm，发酵温度设置为32℃，培养58h，发酵完成后得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于余下的水中，加入氢氧化钠(氢氧化钠的加入量为现有溶液体积的2％)和硅藻土(硅藻土的加入量为现有溶液体积的0.1％)混匀，加热至92℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明；保留沉淀和滤液；
(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后；保留沉淀；
(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得β-1,3-葡聚糖成品。
实施例3：
3.1组分：
磷酸二氢钠25份、硝酸钾35份、硫酸镁5份、氯化钙0.2份、硫酸亚铁0.2份、硫酸锰0.04份、菜籽油45份、蔗糖580份；水17100份。
土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:105。
所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里，在温度为30℃生长48h后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水205份，蛋白胨1.5份，酵母粉0.8份，氯化钠0.8份。
3.2：制备方法：
包括下述步骤：
(1)按配比将部分水、磷酸二氢钠、硝酸钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、菜籽油、蔗糖加入发酵罐中，溶解并搅拌均匀，得混合溶液；所述水的加入量为其总重量的90％；
(2)将步骤(1)所得的混合溶液的PH值调整至7.5，然后进行蒸汽灭菌(在温度121℃灭菌35min)；
(3)将经过步骤(2)蒸汽灭菌后的混合溶液冷却至室温；
(4)按配比将土壤杆菌ZX09种子液加入经过步骤(3)冷却后混合溶液中，然后通入无菌空气，并调节通气流量至18L/min，搅拌转速250rpm，发酵温度设置为28℃，培养62h，发酵完成后得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液放入桶中，加入95％乙醇沉淀发酵液，取沉淀压干、溶解于余下的水中，加入氢氧化钠(氢氧化钠的加入量为现有溶液体积的2％)和硅藻土(硅藻土的加入量为现有溶液体积的0.1％)混匀，加热至88℃，得悬浮液，然后将悬浮液用板框压滤机反复过滤至溶液澄清透明；保留沉淀和滤液；
(6)向步骤(5)所得的滤液中加入95％乙醇沉淀滤液，再次过滤后；保留沉淀；
(7)将步骤(5)和步骤(6)中所得的沉淀混合并依次进行压干、干燥、粉碎，得β-1,3-葡聚糖成品。
实施例4：
4.1组分：
磷酸二氢钠22份、硝酸钾38份、硫酸镁4.5份、氯化钙0.18份、硫酸亚铁0.22份、硫酸锰0.07份、菜籽油38份、蔗糖610份；水16950份。
土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:98。
所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里，在温度为30℃生长48h后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水198份，蛋白胨2.2份，酵母粉1.1份，氯化钠1.1份。
4.2：制备方法：同实施例1。
实施例5：
5.1组分：
磷酸二氢钠18份、硝酸钾42份、硫酸镁3.5份、氯化钙0.12份、硫酸亚铁0.28份、硫酸锰0.05份、菜籽油42份、蔗糖610份；水17050份。
土壤杆菌ZX09种子液与所述组分总体积的体积比为1:102。
所述土壤杆菌ZX09种子液为土壤杆菌ZX09在培养基里，在温度为30℃生长48h后形成的混合物，所述培养基包括下述重量份的组分：水202份，蛋白胨1.8份，酵母粉0.9份，氯化钠0.9份。
5.2：制备方法：同实施例1。
二、实验例：
(一)、应用实施例1-5中制备的β-1,3-葡聚糖进行水溶性实验，同时与燕麦葡聚糖、酵母葡聚糖和香菇多糖的水溶性进行对比。
实验方法：将实施例1-5中制备的β-1,3-葡聚糖以及燕麦葡聚糖、酵母葡聚糖和香菇多糖分别按重量百分比5％溶于常温的去离子水中搅拌充分溶解，观察溶解结果，比较其水溶性。
实验结果，如下表1所示：
表1水溶性实验结果
由表1可以看出，本发明实施例1-5中制备的β-1,3-葡聚糖的水溶性要明显优于燕麦葡聚糖、酵母葡聚糖和香菇多糖，且杂质含量少。
(二)、应用实施例1中制备的β-1,3-葡聚糖进行实验
实验药物
β-1,3-葡聚糖，白色粉末；临用时用养鱼用水配制成浓度为1mg/mL的母液，现用现配。
吲哚美辛，白色粉末，批号为1108939，厂家：上海晶纯实业有限公司。用100％二甲基亚砜配制浓度为80mM母液，-20℃避光保存。
冰醋酸，无色液体，批号L1712010，厂家：阿拉丁试剂(上海)有限公司。临用时用氯化钠注射液配制成5％的工作液，现配现用。
仪器和试剂
解剖显微镜(Szx7,Olympus,Japan)；CCD相机(VertA1)；显微注射仪(IM-300，Narishige，Japan)；拉针仪(PC-10，Narishige，Japan)；六孔板(Nest Biotech，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon,Japan)；甲基纤维素(Aladdin,China)；二甲基亚砜(批号BCBN0845V，Sigma，France)；五水合硫酸铜(批号L1923177，Aladdin,China)；氯化钠注射液(批号D18090505，贵州科伦药业有限公司)。
1、β-1,3-葡聚糖具有抗炎作用的实验研究。
1.1、实验动物
转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共390尾，每实验组为30尾，年龄为受精后3天，用于抗炎作用评价。
饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
1.2、实验浓度组别
1.2.1、确定β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
实验1组正常对照组
实验2组模型对照组
实验3组β-1,3-葡聚糖62.5μg/mL
实验4组β-1,3-葡聚糖125μg/mL
实验5组β-1,3-葡聚糖250μg/mL
实验6组β-1,3-葡聚糖500μg/mL
实验7组β-1,3-葡聚糖1000μg/mL
1.2.2、评价β-1,3-葡聚糖的抗炎作用
实验1组正常对照组
实验2组模型对照组
实验3组阳性对照药吲哚美辛80μM
实验4组β-1,3-葡聚糖111μg/mL
实验5组β-1,3-葡聚糖333μg/mL
实验6组β-1,3-葡聚糖1000μg/mL
1.3、模型制作
用10μM硫酸铜经水溶方式处理转基因中性粒细胞荧光斑马鱼诱导2h，建立斑马鱼炎症模型。
1.4、浓度确定依据
根据浓度摸索结果，β-1,3-葡聚糖抗炎作用评价MTC为1000μg/mL。根据项目建议书要求，抗炎作用评价浓度设为111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL。
1.5、实验方法
1.5.1、确定β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
随机选取3dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，硫酸铜诱发斑马鱼炎症模型，分别水溶给予β-1,3-葡聚糖62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL浓度；每孔3mL药液，同时设置正常对照组和模型对照组；28℃培养箱孵育3h后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量与毒性情况，确定供试品的MTC。
1.5.2、评价β-1,3-葡聚糖的抗炎作用
随机选取3dpf转基因中性粒细胞荧光斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，硫酸铜诱发斑马鱼炎症模型，分别水溶给予β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度；阳性对照药吲哚美辛浓度为80μM；同时设置正常对照组和模型对照组；28℃培养箱孵育3h后，每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下观察、拍照并保存图片；用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼炎症中性粒细胞个数(N)，进行定量分析，供试品炎症消退率计算公式如下：
统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验，p<0.05表明具有显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。
1.6、实验结果
1.6.1、β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
β-1,3-葡聚糖在62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL(最大溶解度)浓度时30尾斑马鱼均未见斑马鱼死亡和明显毒性表型。因此，β-1,3-葡聚糖抗炎作用评价的MTC为1000μg/mL。详见表2。
表2β-1,3-葡聚糖在检测浓度下斑马鱼死亡数量统计(n＝30)
1.6.2、β-1,3-葡聚糖的抗炎作用
模型对照组炎症部位中性粒细胞个数(20.6)与正常对照组(2.7)相比p<0.001，说明模型建立成功；吲哚美辛组中性粒细胞个数(12.5)与模型对照组相比p<0.001，其炎症消退率为38％，表明吲哚美辛有抗炎作用。
β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度炎症部位中性粒细胞个数分别为20.3、16.0和12.3，与模型对照组相比分别为p>0.05&p<0.05&p<0.001，其炎症消退率分别为5％、24％和43％，表明β-1,3-葡聚糖在本实验浓度条件下对硫酸铜诱发的斑马鱼炎症具有显著的抗炎作用，且呈现剂量依赖趋势。详见表3、图1、图2和图3。
图1为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的抗炎作用表型图，图1中箭头所指为炎症部位中性粒细胞；
图2.为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的抗炎作用(中性粒细胞个数)，与模型对照组相比，*p<0.05，***p<0.001；
图3为β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的炎症消退率，与模型对照组相比，*p<0.05，***p<0.001。
表3β-1,3-葡聚糖对斑马鱼炎症的抗炎作用定量结果(n＝10)
与模型对照组相比，*p<0.05，***p<0.001
2、β-1,3-葡聚糖具有组织再生作用的实验研究。
2.1、实验动物
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共330尾，每实验组为30尾，年龄为受精后3天，用于组织再生作用评价。
饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
2.2、浓度组别
2.2.1、确定β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
实验1组正常对照组
实验2组β-1,3-葡聚糖62.5μg/mL
实验3组β-1,3-葡聚糖125μg/mL
实验4组β-1,3-葡聚糖250μg/mL
实验5组β-1,3-葡聚糖500μg/mL
实验6组β-1,3-葡聚糖1000μg/mL
2.2.2、评价β-1,3-葡聚糖的组织再生作用
实验1组正常对照组
实验2组模型对照组
实验3组β-1,3-葡聚糖111μg/mL
实验4组β-1,3-葡聚糖333μg/mL
实验5组β-1,3-葡聚糖1000μg/mL
2.3、模型制作
切除斑马鱼的尾鳍建立斑马鱼组织再生模型。
2.4、浓度确定依据
根据浓度摸索结果，β-1,3-葡聚糖抗炎作用评价MTC为1000μg/mL。根据项目建议书要求，组织再生促进作用评价浓度设为111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL。
2.5、实验方法
2.5.1、确定β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔30尾，分别水溶给予β-1,3-葡聚糖62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL浓度；每孔3mL药液，同时设置正常对照组；28℃培养箱孵育3天后，统计各实验组的斑马鱼死亡数量与毒性情况，确定供试品的MTC。
2.5.2、评价β-1,3-葡聚糖的组织再生作用
随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼，采用手术切断尾鳍的方法建立斑马鱼促组织再生模型。分别水溶给予β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度；同时设置正常对照组和模型对照组。28℃培养箱孵育3天后，每组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并保存图片，分析统计斑马鱼组织再生长度，统计学处理结果用mean±SE表示；供试品对组织再生促进作用计算公式如下：
统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验，p<0.05表明具有显著性差异。
2.6实验结果
2.6.1、β-1,3-葡聚糖的最大耐受浓度(MTC)
β-1,3-葡聚糖在62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL(最大溶解度)浓度时30尾斑马鱼均未见斑马鱼死亡和明显毒性表型。因此，β-1,3-葡聚糖抗炎作用评价的MTC为1000μg/mL。详见表4。
表4β-1,3-葡聚糖在检测浓度下斑马鱼死亡数量统计(n＝30)
2.6.2、评价β-1,3-葡聚糖的组织再生作用
模型对照组斑马鱼尾鳍长度(198像素)与正常对照组(352像素)比较p<0.001，表明模型建立成功。
β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度尾鳍长度分别为219、268和273像素，与模型对照组比较分别为p>0.05&p<0.001&p<0.001，组织再生促进作用为11％、35％和38％。提示在本实验浓度条件下，β-1,3-葡聚糖具有促进斑马鱼组织再生作用。详见表5、图4、图5和图6。
图4为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生(箭头标记)典型图；
图5为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生长度(像素)，与模型对照组比较，***p<0.001；
图6为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼组织再生促进作用，与模型对照组比较，***p<0.001。
表5β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼尾鳍长度分析结果(n＝10)
与模型对照组比较，***p<0.001
3、β-1,3-葡聚糖对于伤口愈合具有促进作用的实验研究。
3.1、实验动物
转基因血管荧光斑马鱼Fli-1品系，以自然成对交配繁殖方式进行。共150尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天，用于伤口愈合促进作用评价。
饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
3.2、浓度组别
实验1组正常对照组
实验2组模型对照组
实验3组β-1,3-葡聚糖111μg/mL
实验4组β-1,3-葡聚糖333μg/mL
实验5组β-1,3-葡聚糖1000μg/mL
3.3、模型制作
冰乙酸以注射给药方式处理正常斑马鱼，建立伤口愈合模型。
3.4、浓度确定依据
根据实验二浓度摸索结果，β-1,3-葡聚糖MTC为1000μg/mL。根据项目建议书要求，伤口愈合促进作用评价浓度设为111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL。
3.5、实验方法
选取2dpf转基因血管荧光斑马鱼Fli-1品系，在斑马鱼的躯干(脊索与泄殖孔十字交叉处)注射冰醋酸建立斑马鱼伤口愈合模型，挑选伤口损伤程度一致的斑马鱼随机分组。分别给予β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度进行处理，同时设置正常对照组(用养鱼用水处理斑马鱼)和模型对照组，每组(孔)均处理30尾斑马鱼，每组(孔)容量为3mL。28℃培养箱孵育2天后，每组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片，用图像处理软件进行图像分析，计算(1)伤口部位的新生血管发生率，(2)伤口部位色素的不透光度总和(S)，统计学处理结果以mean±SE表示；供试品伤口愈合促进作用计算公式如下：
统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验，p<0.05表明具有显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。
3.6实验结果
模型对照组斑马鱼伤口部位的不透光度总和为118112像素，与正常对照组(73542像素)比较p<0.001；模型对照组在造模时出现了明显的血管损伤，2天后，模型对照组出现了50％的新生血管，表明斑马鱼伤口愈合模型建立成功。
β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度时，斑马鱼伤口部位不透光度总和分别为103362、101383和91772像素，与模型对照组(118112像素)比较p<0.05&p<0.01&p<0.001，对斑马鱼伤口愈合的促进作用分别为12％、14％和22％；斑马鱼伤口部位新生血管发生率分别为60％、65％和80％，与模型对照组(50％)比较均p>0.05，表明β-1,3-葡聚糖111μg/mL、333μg/mL和1000μg/mL浓度对斑马鱼伤口愈合有明显的促进作用。
详见表6、图7、图8、图9、图10和图11。
图7为β-1,3-葡聚糖处理后伤口部位色素募集表型图；
图8为供试品处理后血管新生表型图，白色箭头所指为新生血管；
图9为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼伤口部位不透光度总和，与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图10为β-1,3-葡聚糖处理后对斑马鱼伤口愈合促进作用，与模型对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图11为β-1,3-葡聚糖处理后斑马鱼新生血管发生率。
表6β-1,3-葡聚糖对斑马鱼伤口愈合的促进作用(n＝10)
综上，在本实验浓度条件下，由实施例1制备的β-1,3-葡聚糖具有明显的抗炎、促进组织再生和促进伤口愈合的作用，表明β-1,3-葡聚糖对口腔粘膜具有修复作用。
(三)、应用实施例2-5中制备的β-1,3-葡聚糖进行实验，得到与实施例1制备的β-1,3-葡聚糖进行实验的相同实验结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
