用于肌肉修复和再生的组合物和方法
本申请是申请日为2011年08月31日、发明名称为“用于肌肉修复和再生的组合物和方法”的申请号为201180052926.X的专利申请的分案申请。
相关申请
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年9月1日提交的美国临时专利申请No.61/378,996的优先权，以引用的方式将其整体内容并入本文。
政府支持
本发明是在美国陆军(United States Army)授予的基金号No.W81XWH-07-1-0212的政府支持下完成的。美国政府对本发明拥有一定权利。
技术领域
本发明涉及用于肌肉修复和再生的方法和组合物。
背景技术
对肌肉的损伤包括对骨骼肌的急性损伤，例如挫伤(contusions)(擦伤(bruises))、撕裂(lacerations)、局部缺血、劳损(strains)、以及完全破裂(ruptures)。这些损伤可引起剧烈的疼痛并且可以使受影响的人丧失能力，妨碍他们工作的能力乃至参与正常日常活动的能力。
骨骼肌可能因各种原因造成损伤，所述原因包括过度使用、外伤、感染以及丧失血液循环(loss of blood circulation)。通常，特别是在年轻人中，肌肉具有足够修复能力；但是在年长者中或在反复过度使用、严重外伤或其它过程之后，该修复过程可变得无效。在此种情况下，肌肉丧失功能和收缩力，被缺乏收缩性的瘢痕组织(结缔组织)取代，导致肌肉功能丧失。目前的治疗包括：按摩、超声波、高压(hyperbaric)氧递送、以及例如非诺特罗(fenoterol)和胰岛素样生长因子-1的药物治疗。这些治疗可以提供一些有益的结果，但是效果与效率远不理想。此外，目前的治疗没有特异性地针对肌细胞修复和再生的基本机理。
因此，仍需要能够迅速有效地诱导肌肉修复和再生的方法和组合物。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种使受试者肌肉修复或再生的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的视黄酸受体(retinoic acid receptor，RAR)激动剂，所述受试者具有损伤的肌肉组织。在一些实施方式中，RAR激动剂为RARγ激动剂。
本发明的一个方面涉及一种使受试者肌肉修复或再生的方法，所述方法包括给予具有损伤肌肉组织的受试者治疗有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂，从而修复或再生所述损伤肌肉组织。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予是指局部或全身给予。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于遭受肌肉组织损伤的受试者中内源性类视黄醇(retinoid)信号增强的时间段内。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受所述肌肉组织损伤3天后。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受肌肉组织损伤约4天后。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受肌肉组织损伤约5天后。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受肌肉组织损伤约6天后。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受肌肉组织损伤约7天后。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予开始于受试者遭受肌肉组织损伤约5天后，并且持续至至少第7天。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予持续至受试者遭受肌肉组织损伤后的至少第9天。在本文所述的方法的一个实施方式中，RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(palovarotene)(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基(prop-2-ynyloxy))苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐。在本文所述的方法的一个实施方式中，损伤肌肉组织是由物理损伤或事故、疾病、感染、过度使用、丧失血液循环、或肌肉萎缩或损耗造成。在本文所述的方法的一个实施方式中，损伤肌肉组织为营养不良的肌肉或老化肌肉。在本文所述的方法的一个实施方式中，损伤肌肉组织是由肌肉萎缩和/或损耗造成。在本文所述的方法的一个实施方式中，受试者为哺乳动物。在本文所述的方法的一个实施方式中，受试者为小鼠。在本文所述的方法的一个实施方式中，受试者为人。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述方法进一步包括给予受试者抗炎剂。
本发明的另一个方面涉及一种使受试者肌肉修复或再生的方法，所述方法包括在受试者肌肉损伤部位给予已经由RARγ激动剂预处理的多能(pluripotent)干细胞或专能(multipotent)干细胞，从而在该部位使肌肉修复或再生。在本文所述的方法的一个实施方式中，肌肉损伤为复合组织损伤。在本文所述的方法的一个实施方式中，复合组织损伤包含对肌肉和骨的损伤。在本文所述的方法的一个实施方式中，将预处理的干细胞和未处理的干细胞联合给予。在本文所述的方法的一个实施方式中，将预处理的干细胞和未处理的干细胞以1:1的比例给予。在本文所述的方法的一个实施方式中，该预处理干细胞已利用RARγ激动剂预处理约3天的时间。在本文所述的方法的一个实施方式中，该多能干细胞为诱导多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，该多能干细胞为间充质干细胞(mesenchymal stem cells)。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予是局部给予。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述给予是通过将细胞移植入所述受试者中而进行。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为受试者自体的(autologous)或异源的(heterologous)。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为哺乳动物多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为啮齿动物多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为人多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述方法进一步包括给予所述受试者抗炎剂。在本文所述的方法的一个实施方式中，RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(palovarotene)(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐；以及它们的组合。在本文所述的方法的一个实施方式中，损伤肌肉组织是由物理损伤或事故、疾病、感染、过度使用、丧失血液循环、或肌肉萎缩或损耗造成。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述损伤肌肉组织为营养不良的肌肉或老化肌肉。在本文所述的方法的一个实施方式中，损伤肌肉组织是由肌肉萎缩和/或损耗造成。
本发明的另一个方面涉及一种诱导或刺激分离的间充质干细胞在体外成肌分化(myogenic differentiation)的方法，所述方法包括使该间充质干细胞同有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂接触。在本文所述的方法的一个实施方式中，接触时间选自于由以下时间所组成的组：约12小时、约1天、约2天、以及约3天。
本发明的另一个方面涉及一种诱导或刺激多能干细胞谱系-定向分化(lineage-directed differentiation)成为间充质谱系(lineage)的方法，该方法包括使所述多能干细胞与有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂接触。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为诱导多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，多能干细胞为间充质干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，间充质谱系选自于由以下谱系所组成的组：成肌性、成骨性(osteogenic)、成软骨性(chodrogenic)、成腱性(tendonogenic)、成韧带性(ligamentogenic)、成骨髓基质性(marrow stromagenic)、成脂肪性(adipogenic)、以及成真皮性(dermogenic)的谱系。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述多能干细胞为哺乳动物多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述多能干细胞为啮齿动物多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，所述多能干细胞为人多能干细胞。在本文所述的方法的一个实施方式中，RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(palovarotene)(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐；以及它们的组合。
本发明的另一个方面涉及一种包含间充质干细胞的组合物，其中间充质干细胞的一部分已经通过与RARγ激动剂接触而进行预处理，从而生成预处理的间充质干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，经预处理的所述间充质干细胞的一部分选自于由以下比例所组成的组：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、以及90％。
本发明的另一个方面涉及一种包含多能干细胞群(population)的组合物，其中该群中的至少一个细胞与RARγ激动剂接触，从而生成预处理的多能干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述多能干细胞为间充质干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述干细胞为分离的干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述干细胞为哺乳动物干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述干细胞为鼠科动物干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，所述干细胞为人干细胞。在本文所述的组合物的一个实施方式中，RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐；以及它们的组合。
本发明的另一个方面涉及一种包含组合物的药物组合物，所述组合物包含本文所述的多能干细胞群以及药学上可接受的载体。
本发明的另一个方面涉及一种使肌肉修复或再生的试剂盒，所述试剂盒包含本文如下所述的至少一种：RARγ激动剂、RARγ激动剂和干细胞、或包含干细胞的组合物。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为诱导多能干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为间充质干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述RARγ激动剂被制剂在药物组合物中。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述RARγ激动剂被制剂用于局部施用。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为分离的干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为哺乳动物干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为啮齿动物干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，所述干细胞为人干细胞。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐；以及它们的组合。在本文所述的试剂盒的一个实施方式中，试剂盒进一步包含使用说明书。
附图说明
图1是骨骼肌组织损伤4周后组织学分析获得的数据的柱状图。为了评价和量化骨骼肌组织结构的变化，通过ImagePro软件，在多个限定的区域中，获取经三色染色的连续切片的图像并用于确定肌纤维、脂肪和纤维组织的相对量。分析区域各自为9×9格(约3×3mm)，该区域包含原损伤部位(2×2mm)。注意到肌肉损伤造成总肌纤维面积下降；同时纤维组织和脂肪组织面积增加。相比之下，CD1530治疗在很大程度上修复了组织的组成。
图2是从损伤肌肉组成的组织-形态计量学分析获得的数据的图解表示。
图3是一些示例性的RARγ激动剂的名称和化学结构。
图4是实验结果数据的一系列柱状图，表明局部RA浓度首先下降、然后在肌肉损伤后短暂地上升。
图5是实验结果数据的一系列折线图，表明局部RA浓度首先下降、然后在肌肉损伤后短暂地上升。
图6是基于所标示的RARγ激动剂的治疗时间，骨骼肌组织损伤4周后的组织学分析获得的数据的柱状图。在图中，左边填充的区段表示肌肉；紧随其右的区段显示为空的(白色)，表示脂肪；最右边填充的区段表示纤维组织。
具体实施方式
本发明的方面涉及如下发现：通过急性或慢性暴露至视黄酸受体γ(RARγ)激动剂，可诱导祖干细胞(progenitor stem cells)进行肌肉分化。因此，在一个方面，本发明提供一种使受试者损伤肌肉组织修复或再生的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的视黄酸受体(RAR)激动剂，所述受试者具有损伤的肌肉组织。
本文使用的术语“损伤的肌肉组织”表示肌肉组织，例如经物理损伤或事故、疾病、感染、过度使用、丧失血液循环、或经基因或环境因素改变的骨胳肌或心肌。损伤的肌肉组织可以是营养不良的肌肉或老化肌肉。肌肉损伤的示例性症状包括但是不局限于：肿胀(swelling)、擦伤或红肿(redness)、作为损伤后果的开放性切口、静止状态时疼痛、当使用特定肌肉或与该肌肉相关的关节时疼痛、肌肉或腱脆弱、以及完全不能使用肌肉。
在本发明这个方面及其它方面的一些实施方式中，损伤的肌肉组织是由肌肉萎缩和/或损耗造成的结果。在本发明这个方面及其它方面的一些实施方式中，损伤的肌肉组织是由物理损伤造成的结果。
在本发明这个方面及其它方面的一些实施方式中，损伤肌肉为骨骼肌。
在本发明这个方面及其它方面的一些实施方式中，将导致肌肉组织损伤的疾病称为肌病(myopathy)。不受限制地，肌病可以是先天性肌病或获得性肌病。示例性的肌病包括但是不局限于：肌营养不良(dystrophies)、肌强直(myotonia)(神经性肌强直(neuromytonia))、先天肌病(例如：杆状体肌病(nemaline myopathy)、多/微小轴空肌病(multi/minicore myopathy)，中央核肌病(centronuclear myopathy)(或肌管性肌病(myotubular myopathy))、线粒体肌病、家族性周期性麻痹(familial periodicparalysis)、炎性肌病、代谢肌病(例如：糖原贮积病和脂贮积障碍)、皮肌炎(dermatomyositis)、多发性肌炎(polymyositis)、包涵体肌炎(inclusion bodymyositis)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、横纹肌溶解症(rhabdomyolysis)以及肌红蛋白尿症(myoglobinuirias)。
在本发明这个方面及其它方面的一些实施方式中，肌病是选自于由以下营养不良症所组成的组中的营养不良症：肌肉营养不良症、Duchenne肌肉营养不良症、Berker肌肉营养不良症、反射性交感神经营养不良症(Reflex sympathetic dystrophy)、视网膜营养不良症(Retinal dystrophy)、Conal营养不良症、强直性肌营养不良症(Myotonicdystrophy)、角膜营养不良症(Coneal dystrophy)，以及它们的任意组合。
不希望受理论束缚，本文所述方法减少和/或抑制损伤肌肉组织中瘢痕样组织(scar-like tissue)的形成。因此，在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中瘢痕样组织的形成减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％(完全减少)。
在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中脂肪组织和/或结缔组织的量减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％(完全减少)。
再次，不希望受理论束缚，本文所述方法导致在损伤肌肉组织中肌球蛋白重链(MHC)的量增加。因此，在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中肌球蛋白重链(MHC)的量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍以上。
此外，本文所述方法增加了MHC阳性的细长肌肉样细胞(elongated muscle-likecells)的量。因此，在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中MHC阳性的细长肌肉样细胞的量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍以上。
如本文所述，通过急性或慢性暴露至视黄酸受体γ(RARγ)激动剂，祖干细胞可以被诱导或刺激而进行肌肉分化。因此，观察到成肌调节因子增加。成肌调节因子是调节肌形成的碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。参见例如Perry,R.和Rudnick,M.(2000)。“Molecular mechanisms regulating myogenic determination and differentiation”，Front Biosci 5：D750-67(2000)，通过引用将其内容并入本文。示例性的成肌调节因子包括但是不局限于：MyoD(Myf3)、Myf5、肌细胞生成素(myogenin)、以及MRF4(Myf6)。MyoD是成肌定型(myogenic commitment)的最早标记物之一。MyoD在活化的卫星细胞中表达，而不在静息的卫星细胞中表达。尽管MyoD标记成肌细胞(myoblast)定型，但是缺乏MyoD基因的小鼠突变体中的肌肉发育并不显著削弱。这很可能是由于Myf5的功能冗余。
因此，在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中至少一种成肌调节因子的水平增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍以上。
在一些实施方式中，相对于参比水平而言，损伤肌肉组织中至少一种层粘连蛋白(laminin)的量增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍以上。
视黄酸受体(RAR)激动剂
本文使用的术语“RAR激动剂”是能够以如下ED50反式激活任何视黄酸受体的任何化合物：小于1000nM、小于500nM、小于250nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于25nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于0.1nM、小于0.01nM、或小于0.001nM。
类视黄醇受体分为两个家族：视黄酸受体(RAR)和类视黄醇X受体(RXR)，其各自包括三种不同的亚型α、β以及γ。由于对两个初级RNA转录本进行不同剪切，RAR基因家族的每个亚型编码不同数量的同种型。所有反式视黄酸(ATRA)及其其它天然存在的类视黄醇类似物(9-顺式视黄酸、全反式3-4双脱氢视黄酸、4-氧代视黄酸以及视黄醇)是与类视黄醇受体结合的多效调节化合物。例如，ATRA以近似相等的亲合力与全部三种RAR亚型结合，但是不与RXR受体结合。相反，对于这些受体，9-顺式视黄酸是天然配体。
本文使用的术语“反式激活”是指RAR激动剂活化基因转录的能力，所述基因转录通过配体结合至特定的待测试视黄酸受体(即：RARα、RARβ、或RARγ)而起始。化合物反式激活视黄酸受体的能力的测定可通过本领域技术人员已知的方法来进行。所述方法的实例参见Bernard等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，186：977-983(1992)以及Apfel等，Proc.Nat.Sci.Acad.(USA)，89：7129-7133(1992)，通过引用的方式将其两者的内容并入本文。
在本文所述的方面的一些实施方式中，RAR激动剂是RARγ选择性激动剂。本文使用的术语“RARγ选择性激动剂”是指能选择性地与RARγ受体相结合并且促进RARγ活化的化合物。通常，与RARα和RARβ受体相比，RARγ选择性激动剂将在显著较低的浓度下与RARγ受体结合。例如，与RARα和RARβ受体相比，RARγ选择性激动剂将以超过5倍、超过10倍、超过20倍、超过30倍、超过40倍、超过50倍、超过60倍、超过70倍、超过80倍、超过90倍或更高的选择性与RARγ受体结合。
化合物的RARγ激动剂选择性可以由本领域技术人员已知的常规配体结合分析确定，例如在Apfel等，Proc.Nat.Sci.Acad.(USA)，89：7129-7133(1992)；M.Teng等，J.Med.Chem，40：2445-2451(1997)；以及PCT公布号WO1996/30009中有所描述的方法，通过引用将其所有内容并入本文。
在本文所述的方面的一些实施方式中，RAR激动剂是RARγ/β选择性激动剂。本文使用的术语“RARγ/β选择性激动剂”是指选择性地与RARγ和RARβ受体结合、促进RARγ和RARβ两者活化并损害(sparing)RARα受体活化的化合物。
在本文所述的方面的一些实施方式中，RAR激动剂是至少为RARγ选择性且为RARα损害性的RAR激动剂。本文使用的术语“至少为RARγ选择性且为RARα损害性的RAR激动剂”是指RARγ选择性的或RARγ/β选择性的化合物。
在本文所述的方面的一些实施方式中，RAR激动剂是RAR泛激动剂(pan agonist)。本文使用的术语“RAR泛激动剂”是指能够以类似的亲合力与RARα、RARβ、以及RARγ受体结合并促进RARα、RARβ和RARγ活化的化合物。
示例性地，RAR激动剂包括但不限于：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药、和药学上可接受的盐。
其它能够用于本发明的RAR激动剂记载于例如：美国专利No.5,624,957；No.5,760,084；No.6,331,570；No.6,300,350；No.5,700,836；No.5,726,191；No.5,498,795；No.5,130,335；国际专利申请公开号WO1997/037648；WO2007/068579以及WO2007/068580；公开于1997年4月11日的法国专利申请No.FR2739557；以及日本专利公开号No.62/053981，通过引用将其所有内容整体并入本文。其它能用于本发明的RAR激动剂包括在Biochem.Biophys.Res.Commun.179：1554-1561(1992)、Biochem.Biophys.Res.Commun.186：977-984(1992)、Int.J.Cancer 71：497(1997)、SkinPharmacol.8：292-299(1995)、J.Med.Chem.39：2411-2421(1996)、Cancer Res.55：4446-4451(1995)、Cancer Letters 115：1-7(1997)、J.Med.Chem.32：834-840(1989)中有所描述的RAR激动剂，通过引用将其内容全部并入本文。
药学上可接受的盐
本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指RAR激动剂的传统的无毒盐类或季铵盐类(例如，来自无毒有机酸或无机酸)。这些盐类可在给药辅料或剂型制造过程中原位制备、或通过单独将处于其游离碱或酸形式的纯化的RAR激动剂与合适的有机酸/无机酸或有机碱/无机碱反应并在后续纯化时分离所形成的盐而制备。传统的无毒盐类包括由例如以下无机酸衍生的盐：硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由例如以下有机酸制备而来的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲基苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic)等。参见例如：Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66:1-19(1977)，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在本文所述的方面的某些实施方式中，代表性的盐类包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)和十二烷基磺酸盐等。
前药
本文所述的“前药”是指可经某些化学或生理学过程(例如，酶促过程和代谢水解)而转化为RAR激动剂的化合物。因此，术语“前药”还指药学上可接受的生物活性化合物的前体。前药在给予受试者时可以是非活性的，即酯，但在体内转化为活性化合物，例如，通过水解为游离羧酸或游离羟基。所述前药化合物经常提供生物体内的缓释作用、组织相容性或可溶性的优点。术语“前药”也意在包括任何共价结合的载体，当将该前药给予受试者时，所述载体在体内释放活性化合物。活性化合物的前药可通过以如下方式修饰活性化合物中存在的官能团而制备：通过常规操作或体内方式将所述修饰物裂解为母体活性化合物。前药包括其中的羟基、氨基或巯基与任意基团结合的化合物，以使得当将所述活性化合物的前药给予受试者时，其裂解并各自形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括但不仅限于：活性化合物中醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物，或活性化合物中胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。参见：Jucker编著，Progress in Drug Research4:221-294(1962)中的Harper，“Drug Latentiation”；E.B.Roche编著，Design ofBiopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs，APHAAcad.Pharm.Sci.40(1977)的Morozowich等，“Application of Physical OrganicPrinciples to Prodrug Design”；Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design，Theory and Application，E.B.Roche编著，APHA Acad.Pharm.Sci.(1987)；Design ofProdrugs，H.Bundgaard，Elsevier(1985)；Wang等“Prodrug approaches to the improveddelivery of peptide drug”in Curr.Pharm.Design.5(4):265-287(1999)；Pauletti等(1997)Improvement in peptide bioavailability：Peptidomimetics and ProdrugStrategies，Adv.Drug.Delivery Rev.27:235-256；Mizen等(1998)“The Use of Estersas Prodrugs for Oral Delivery of(3-Lactam)antibiotics,”Pharm.Biotech.ll,:345-365；Gaignault等(1996)“Designing Prodrugs and Bioprecursors I.CarrierProdrugs,”Pract.Med.Chem.671-696；Asgharnejad，“Improving Oral Drug Transport”，in Transport Processes in Pharmaceutical Systems，G.L.Amidon，P.I.Lee与E.M.Topp，Eds.，Marcell Dekker，185-218页(2000)；Balant等，“Prodrugs for theimprovement of drug absorption via different routes of administration”，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.，15(2)：143-53(1990)；Balimane与Sinko，“Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleosideanalogues”，Adv.Drug Delivery Rev.，39(1-3)：183-209(1999)；Browne，“Fosphenytoin(Cerebyx)”，Clin.Neuropharmacol.20(1)：1-12(1997)；Bundgaard，“Bioreversiblederivatization of drugs—principle and applicability to improve thetherapeutic effects of drugs”，Arch.Pharm.Chemi 86(1)：1-39(1979)；Bundgaard H.“Improved drug delivery by the prodrug approach”，Controlled Drug Delivery 17：179-96(1987)；Bundgaard H.“Prodrugs as a means to improve the delivery ofpeptide drugs”,Arfv.Drug Delivery Rev.8(1)：1-38(1992)；Fleisher等“Improvedoral drug delivery：solubility limitations overcome by the use of prodrugs”，Drug Delivery Rev.19(2)：115-130(1996)；Fleisher等“Design of prodrugs forimproved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting”，MethodsEnzymol.112(Drug Enzyme Targeting，Pt.A)：360-81，(1985)；Farquhar D等，“Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups”，Pharm.Sci.，72(3)：324-325(1983)；Freeman S等，“Bioreversible Protection for the Phospho Group：Chemical Stability and Bioactivation of Di(4-acetoxy-benzyl)Methylphosphonatewith Carboxyesterase,”Chem.Soc.，Chem.Commun.，875-877(1991)；Friis andBundgaard，“Prodrugs of phosphates and phosphonates：Novel lipophilicalphaacyloxyalkyl ester derivatives of phosphate-or phosphonate containingdrugs masking the negative charges of these groups”，Eur.J.Pharm.Sci.4：49-59(1996)；Gangwar等，“Pro-drug，molecular structure and percutaneous delivery”，Des.Biopharm.Prop.Prodrugs Analogs，[Symp.]Meeting Date 1976，409-21.(1977)；Nathwani与Wood，“Penicillins：a current review of their clinical pharmacologyand therapeutic use”，Drugs 45(6)：866-94(1993)；Sinhababu与Thakker，“Prodrugs ofanticancer agents”，Adv.Drug Delivery Rev.19(2)：241-273(1996)；Stella等，“Prodrugs.Do they have advantages in clinical practice？”，Drugs 29(5)：455-73(1985)；Tan等“Development and optimization of anti-HIV nucleoside analogs andprodrugs：A review of their cellular pharmacology，structure-activityrelationships and pharmacokinetics”，Adv.Drug Delivery Rev.39(1-3)：117-151(1999)；Taylor，“Improved passive oral drug delivery via prodrugs”，Adv.DrugDelivery Rev.，19(2)：131-148(1996)；Valentino与Borchardt，“Prodrug strategies toenhance the intestinal absorption of peptides”，Drug Discovery Today 2(4)：148-155(1997)；Wiebe与Knaus，“Concepts for the design of anti-HIV nucleosideprodrugs for treating cephalic HIV infection”，Adv.Drug Delivery Rev.：39(l-3):63-80(1999)；Waller等，“Prodrugs”，Br.J.Clin.Pharmac.28：497-507(1989)，以引用的方式将上述文献的全部内容整体并入本文。
药物组合物
为了向受试者给药，可以药学上可接受的组合物的形式来提供RAR激动剂。这些药学上可接受的组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂共同配制而成的治疗有效量的一种或多种RAR激动剂。如下详述，本发明的药物组合物可被具体配制用于以固体或液体形式给药，包括适宜于下列给药的形式：(1)口服给药，例如顿服药(drenches，水性或非水性的溶液或悬浮液)、灌服药(gavage)、锭剂(lozenge)、糖衣剂(dragee)、胶囊剂、丸剂、片剂(例如，目标是用于口含吸收、舌下吸收和全身吸收的片剂)、大丸剂(boluse)、散剂、颗粒剂、应用于舌部的膏剂；(2)胃肠道外给药，例如，作为如无菌溶液或悬浮液或缓释制剂经皮下注射(subcutaneous)、肌内注射(intramuscular)、静脉注射(intravenous)或硬膜外注射(epidural injection)给药；(3)局部施用，例如，作为霜剂、软膏剂、或控释贴剂或喷雾剂施用于皮肤；(4)阴道内给药或直肠内给药，例如作为阴道栓剂(pessary)、霜剂或泡沫剂；(5)舌下给药(sublingually)；(6)眼部给药(ocularly)；(7)经皮给药(transdermally)；(8)经粘膜给药(transmucosally)；或(9)鼻部给药(nasally)。此外，可使用药物递送系统将化合物注射入或植入患者体内。参见例如，Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24：199-236(1984)；Lewis编著，“Controlled Release ofPesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press，New York，1981)；美国专利No.3,773,919；以及美国专利No.35 3,270,960，以引用的方式将上述文献内容全部并入本文。
本文所使用的术语“药学上可接受的”是指在健全的(sound)医学判断范围内，适合用于与人类和动物组织相接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症(complication)，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意味着参与将主题化合物从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料(vehicle)，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(manufacturing aid，如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料。从与制剂的其它成分相容以及对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。一些可作为药学上可接受的载体的材料的实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶(tragacanth)粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原(pyrogen-free)的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；以及(25)其它可用于药物制剂中的无毒相容物质。湿润剂、着色剂、隔离剂(release agent)、包衣剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。本文所使用的术语如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等可互换使用。
本文所使用的短语“有效量”是指足以产生所期望的变化或效果(例如，在体外引发(priming)间充质干细胞发生成肌分化)的活性剂(例如，RARγ激动剂)的量。
本文所使用的短语“治疗有效量”意味着以合理的收益/风险比可应用至任何医学治疗，至少在动物体内的细胞亚群中有效产生某些所需的治疗效果的含有RAR激动剂的组合物、材料或化合物的量。例如，向受试者给予的RAR激动剂的量足以产生统计学上显著的可测量的肌肉修复或再生。
本文所使用的术语“修复”是指肌肉组织的损伤减轻或完全消除的过程。在一些实施方式中，肌肉组织损伤的至少一种症状减轻至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％。肌肉损伤的症状例如在“Skeletal Muscle Damage and Repair”Tiidus,P.M主编，Human Kinetics(2008)中有所描述，以引用的方式将其内容并入本文。
本领域技术人员完全有能力对治疗有效量进行确定。一般而言，治疗有效量可随受试者的病史、年龄、状况、性别和受试者医学状况的严重程度与类型以及其它药物活性剂的给药而变化。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将组合物放置入受试者体内。适于本发明方法的给药途径包括局部和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多RAR激动剂(或RAR激动剂处理的细胞)递送至特定位点；而全身给药导致将RAR激动剂(或RAR激动剂处理的细胞)递送至受试者的基本整个身体。局部给药的方法之一是通过肌肉内注射。
在给予RAR激动剂处理的细胞的情况下，术语“给药/给予”也包括将该细胞移植至受试者体内。本文使用的术语“移植”是指植入或转移至少一个细胞至受试者体内的过程。术语“移植”包括例如，自体移植(从患者的一个部位移除并转移细胞至同一患者的相同或其它部位)、同种异体移植(同一物种的成员之间的移植)、和异种移植(不同物种成员之间的移植)。本领域技术人员清楚了解植入或移植间充质干细胞以使肌肉修复和再生的方法，这些方法可用于本发明。参见例如，美国专利No.7,592,174和美国专利公开No.2005/0249731，以引用的方式将两者的内容并入本文。
此外，RAR激动剂可以制剂为软膏剂、霜剂、散剂、或其它适合于局部制剂的制剂形式。由于RAR激动剂的分子量通常小于500道尔顿，这些制剂可将激动剂从皮肤递送至更深的肌肉组织中。因此，这样的制剂可以包括提高活性成分渗透穿过皮肤的一种或多种试剂。对于局部应用，RAR激动剂可包含于伤口敷料和/或皮肤涂料组合物中。
本文所述的化合物或组合物可通过本领域已知的任何合适途径进行给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。
示例性的给药模式包括但不仅限于：注射、输液、滴注、吸入或摄食。“注射”不受限制地包括：静脉注射和输液、肌内注射和输液、动脉内注射和输液、鞘内注射和输液、室内注射和输液、囊内注射和输液、眼内注射和输液、心内注射和输液、真皮内注射和输液、腹膜内注射和输液、经气管注射和输液、皮下注射和输液、表皮下注射和输液、关节内注射和输液、囊下注射和输液、蛛网膜下注射和输液、脊髓内注射和输液、脑脊髓内注射和输液以及胸骨内注射和输液。在本文描述的方面的优选实施方式中，组合物通过静脉内输液或注射给药。
本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前面所述的任何子集，例如，一个或多个组或物种(如人类、灵长类动物或啮齿动物)的上述所有。在本文描述的方面的特定的实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物、如人类。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以为雄性或雌性。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不仅限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表与自身免疫病或炎症相关的障碍的动物模型的受试者。此外，本文描述的方法和组合物可用于治疗家畜和/或宠物。
受试者可为在先前已经诊断有或鉴定为遭受或患有以肌肉损伤或肌肉萎缩和/或损耗为特征的障碍的受试者。
受试者可以是目前没有进行RAR激动剂治疗的个体。
受试者可为在先前已诊断有某种疾病、正在接受利用包含RAR激动剂的治疗方案进行治疗的个体，其中所述疾病不是以肌肉损伤或肌肉萎缩和/或损耗为特征的疾病。
因此，在一些实施方式中，治疗方法包括调整受试者的治疗方案，使得肌肉损伤的至少一种症状减少。不受限制地，治疗方案可以通过调整RAR给药频率和/或通过改变给药部位和方式进行调整。
在本文所述的方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括在对受试者进行肌肉修复或再生治疗之前，对受试者的肌肉损伤或肌肉萎缩和/或损耗进行诊断。
在本文所述的方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括在对受试者进行肌肉修复或再生治疗之前，对患有肌肉损伤或肌肉萎缩和/或损耗的受试者进行选择。
联合治疗
在本文所述的方面的一些实施方式中，伴随选自于按摩、超声波、高压氧递送中的治疗，将RAR激动剂给予受试者。额外地、和/或可选地，RAR激动剂可以与药物活性剂联合给药于受试者。示例性的药物活性化合物包括但不限于：记载于Harrison’s Principles ofInternal Medicine，13th版，T.R.Harrison等主编，McGraw-Hill N.Y.，NY；PhysiciansDesk Reference，50th版，1997，Oradell New Jersey，Medical Economics Co.；Pharmacological Basis of Therapeutics，8th版，Goodman和Gilman，1990；UnitedStates Pharmacopeia，The National Formulary，USP XII NF XVII，1990；Goodman和Oilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics的现行版；以及The Merck Index的现行版，通过引用将其所有内容全部并入本文。
在本文所述的方面的一些实施方式中，药物活性剂包括那些本领域中已知的、用于治疗炎症或与炎症相关的障碍或感染的试剂。示例性的抗炎剂包括但不限于：非甾体类抗炎药物(NSAID，如阿斯匹林、布洛芬或萘普生)、皮质类固醇(corticosteroid)(如泼尼松(presnisone))、抗疟疾药物(如羟氯喹(hydrochloroquine))、甲氨蝶呤(methotrexate)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药物、环磷酰胺(cyclophosphamide)、麦考酚酯(mycophenolate)。
在本文所述的方面的一些实施方式中，药物活性剂为生长因子。示例性的生长因子包括但不限于：成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF-1、FGF-2、FGF-4、胸腺素(thymosins)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素结合生长因子(IGF)、IGF-1、IGF-2、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、软骨诱导因子A和B、类骨诱导因子(osteoid-inducing factor)、成骨素(osteogenin)、骨形态发生蛋白、以及其它骨生长因子、胶原生长因子、肝素结合生长因子1或肝素结合生长因子2，以及它们的生物活性衍生物。
在本文所述的方面的一些实施方式中，药物活性剂为抗干扰素剂。不受限制地，抗干扰素剂包括抗干扰素抗体或其片段或衍生物。示例性的抗干扰素抗体包括但不限于：记载于Ronnblom,L.和Elkon,K.B.Cytokines as therapeutic targets in SLE.Nat RevRheumatol 6，339-647；Yao,Y.等，Neutralization of interferon-alpha/beta-inducible genes and downstream effect in a phase I trial of an anti-interferon-alpha monoclonal antibody in systemic lupuserythematosus.Arthritis Rheum 60，1785-96(2009)；以及Zagury,D.等，IFNalphakinoid vaccine-induced neutralizing antibodies prevent clinicalmanifestations in a lupus flare murine model.Proc Natl Acad Sci U S A 106，5294-9(2009)中的抗干扰素抗体；记载于美国专利No.4,902,618；No.5,055,289；No.7,087,726和No.7,741,449中的抗干扰素抗体；以及记载于美国专利申请公开号No.10/440,202；No.11/342/020和No.12/517,334的中的抗干扰素抗体，通过引用将其内容全部并入本文。
在本文所述的方面的一些实施方式中，药物活性剂为非诺特罗或胰岛素样生长因子-1。
RAR激动剂和药物活性剂可以在同一药物组合物或不同药物组合物(在同一时间或在不同时间)给予受试者。当在不同时间给药时，RARγ激动剂和药物活性剂可以在给予另一种药物的5分钟、10分钟、20分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、8小时、12小时、24小时内给药。当RAR激动剂和药物活性剂在不同药物组合物中给药时，给药途径可以是不同的。
剂量
能与载体材料联用以制成单一剂型的RAR激动剂的量通常是产生治疗效果的RAR激动剂的量。通常以百分制表示，RAR激动剂的量的范围从约0.01％至99％，优选从约5％至约70％，最优选从10％至约30％。
可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体在治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以用LD50/ED50的比值来表示。优选显示出治疗指数大的组合物。
本文所使用的术语ED表示有效剂量，并与动物模型相联系使用。术语EC表示有效浓度，并与体外模型相联系使用。
可将由细胞培养分析和动物研究得到的数据用于得出人用剂量的范围。该化合物的剂量优选处于包括ED50并几乎没有毒性或没有毒性的循环浓度范围内。该剂量可在这一范围内根据所使用的剂型和所利用的给药途径而变化。
可由细胞培养分析初步评估所述治疗有效剂量。可在动物模型中得出达到循环血浆浓度范围的剂量，所述范围包括在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半最大抑制(half-maximum inhibition)的治疗剂浓度)。可通过例如高效液相色谱测定血浆中的水平。可通过合适的生物分析监测任何特定剂量的效果。
可由医师确定剂量，如果有必要的话，可将剂量调整至适合所观察到的治疗效果。一般而言，给予组合物以使得给予的RARγ激动剂的剂量为1μg/kg至150mg/kg、1μg/kg至100mg/kg、1μg/kg至50mg/kg、1μg/kg至20mg/kg、1μg/kg至10mg/kg、1μg/kg至1mg/kg、100μg/kg至100mg/kg、100μg/kg至50mg/kg、100μg/kg至20mg/kg、100μg/kg至10mg/kg、100μg/kg至1mg/kg、1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、10mg/kg至100mg/kg、10mg/kg至50mg/kg、或10mg/kg至20mg/kg。将会理解的是，这里给出的范围包含了所有的中间范围，例如：1mg/kg至10mg/kg的范围包括1mg/kg至2mg/kg、1mg/kg至3mg/kg、1mg/kg至4mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、1mg/kg至6mg/kg、1mg/kg至7mg/kg、1mg/kg至8mg/kg、1mg/kg至9mg/kg、2mg/kg至10mg/kg、3mg/kg至10mg/kg、4mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至10mg/kg、6mg/kg至10mg/kg、7mg/kg至10mg/kg、8mg/kg至10mg/kg、9mg/kg至10mg/kg等。将进一步理解的是，上述给定范围中间的范围也在本发明的范围内，例如，在1mg/kg至10mg/kg的范围内包含了例如2mg/kg至8mg/kg、3mg/kg至7mg/kg、4mg/kg至6mg/kg等范围。
在某些实施方式中，以某一剂量给予所述组合物以使在给药后15min、30min、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时或以上之后，RAR激动剂或其代谢物具有以下体内浓度：低于500nM、低于400nM、低于300nM、低于250nM、低于200nM、低于150nM、低于100nM、低于50nM、低于25nM、低于20nM、低于10nM、低于5nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.1nM、低于0.05nM、低于0.01nM、低于0.005nM、低于0.001nM。
关于治疗持续时间和频率，对熟练的临床医师而言，一般对受试者进行监测以确定所述治疗何时提供治疗效益，并确定是否增加或减少剂量、是否增加或减少给药频率、是否中止治疗、是否恢复治疗或是否对治疗方案进行其它改变。给药计划可根据多个临床因素(如，受试者对RAR激动剂的敏感性)在一周一次至一天一次的范围内变动。可每天或每三天、四天、五天、或六天给予所需的剂量。可一次给予期望的剂量，或分成亚剂量(subdose，例如，2-4份亚剂量)并在一段时间内(例如，以一天中的合适间隔或其它合适的计划)给予期望的剂量。这样的亚剂量可以采用单位剂型进行给药。在本文描述的方面的某些实施方式中，给药是长期的，例如，在数周或数月的时间段内每天给予一份或多份剂量。给药计划的实例为：在1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或以上的时间段内每日给予1次、每日给予2次、每日给予3次或每日给予4次以上。
在一个实施方式中，本文所述的方法中RAR激动剂给予受试者一或多次。在一个实施方式中，一次给药或次数给药是在如下时间段内进行：对肌肉组织损伤(例如，遭受外伤或生理上的变化导致肌肉损伤)进行响应而在体内自然发生的可监测的内源性类视黄醇信号增强的时间段内(例如，在遭受损伤后的4天或5天)。在一个实施方式中，给药包括该时间段开始时的一个时间。在一个实施方式中，给药包括该时间段中的多个时间。在一个实施方式中，给药处于遭受损伤超过3天后的时间段后的一个时间或包括遭受损伤超过3天后的时间段后的一个时间。在一个实施方式中，给药处于遭受损伤后约4天的一个时间或包括遭受损伤后约4天的一个时间。在一个实施方式中，给药处于遭受损伤后约5天的一个时间或包括遭受损伤后约5天的一个时间。在一个实施方式中，给药处于遭受损伤后约6天的一个时间或包括遭受损伤后约6天的一个时间。在一个实施方式中，给药处于遭受损伤后约7天或约8天的一个时间、或包括遭受损伤后约7天或约8天的一个时间。这些给药时间的组合同样是可以想到的。例如，在约4天给药，然后在5、6、7和8天再一次或多次给药。在一个实施方式中，给药是在约5天和第7天。也可以在延长的一段时间内进行持续给药(例如，直到获得满意的恢复)。
在一个实施方式中，给药与内源性类视黄醇信号增强的时间段重叠或包含该时间段(例如，内源性类视黄醇信号增强之前开始给药，并延伸到该时间段中和/或贯穿整个该时间段)。在一个实施方式中，直至响应对肌肉组织的损伤的内源性类视黄醇信号增强才开始给药(例如，从第3天以后开始给药，或第4、5、6、7、8、9天或以后)。在一个实施方式中，给药从第3天以后开始(例如，第4或5天)，并持续至至少第9天(例如，至第11天)。在一个实施方式中，在所述给药时间段内，每天或每隔一天给药。在一个实施方式中，给药至少在第5天、第7天和第9天进行。
预处理干细胞
在另一个方面，本发明提供干细胞群，其中所述群是通过将至少一个干细胞与有效量的RAR激动剂相接触产生的。本文使用的术语“干细胞群”是指一个或多个干细胞。该干细胞可被分离(例如，用于在体外或离体接触)。该接触使细胞再生肌肉组织，也促进其它细胞的成肌分化(例如，被给予预处理细胞的宿主中的细胞)。在一个实施方式中，接触是指以RARγ激动剂接触分离的间充质干细胞以实现这种能力。在一个实施方式中，预处理是在体外进行并持续至少约3天。尽管更短的预处理时间(例如2.5天、2天、1.5天、1天、12小时)也能产生类似的能力。这样经预处理并由此被诱导的细胞在本文被称为“预处理的”。本发明包含本文所述的所有预处理细胞。
本文使用的术语“接触(contacting/contact)”与接触干细胞有关，包括将干细胞施加至含有RAR激动剂的适当培养基中。干细胞可以与细胞培养中的RAR激动剂接触，例如，体外或离体。本文使用的术语“离体”是指从活体移除并在生物体以外(例如，在试管内)培养的细胞。然后，离体细胞可以在对供体修饰后进行给药。
在本发明的方面的一些实施方式中，干细胞为人干细胞。在一些实施方式中，干细胞为多能干细胞或专能干细胞。在一些实施方式中，干细胞为诱导多能干(iPS)细胞、或稳定重编程细胞(多能干细胞中间体，并可以进一步重编程为iPS细胞)，例如，部分诱导的多能干细胞(也称为“piPS细胞”)。在一些实施方式中，多能干细胞、iPSC或piPSC是基因修饰的多能干细胞。在一些实施方式中，干细胞为间充质干细胞。
通常，在方法、分析、系统、试剂盒中使用并生成记分卡的干细胞可由任意可用来源获得或衍生而来。因此，干细胞可以由脊椎动物或无脊椎动物获得或衍生而来。在本发明这个方面和其它方面的一些实施方式中，干细胞是哺乳动物干细胞。
在本发明这个方面和其它方面的一些实施方式中，干细胞是灵长类动物干细胞或啮齿动物干细胞。
在本发明的方面的一些实施方式中，干细胞选自于由以下干细胞所组成的组：黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴、猕猴(如恒河猴)、小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔、仓鼠、牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)干细胞。
本文使用的术语“分化”是指一个细胞从原始(primitive)阶段朝着更成熟的细胞(即非原始)的细胞发展。
本文使用的术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”或“iPS细胞”是指衍生自分化细胞(例如，体细胞)的分化状态重编程或完全回逆(reversion)的细胞。本文所用的iPSC是完全重编程的、并且是经历了完整的表观遗传重编程的细胞。
本文使用的术语“重编程”是指改变或回逆分化细胞(例如，体细胞)的分化状态的过程。换句话说，重编程是指驱使已分化的细胞反向成为较不分化或更原始类型的细胞的过程。完全重编程包括如下至少某些遗传模式的彻底回逆：核酸修饰(如甲基化)、染色质浓缩、表观遗传变化、基因组印记等，这些发生在由受精卵发育为成人的细胞分化过程中。重编程不同于简单的维持现有的已经是多能细胞的未分化状态或维持现有的已经是专能细胞的不完全分化状态(如造血干细胞)。重编程也不同于促进已经是多能细胞或专能细胞的自我更新或增殖，尽管本发明的组合物和方法也可以用于上述目的。
本文使用的术语“稳定重编程细胞”是指从分化细胞(例如，体细胞)的部分(partial)重编程或不完全(incomplete)重编程产生的细胞。稳定重编程细胞在本文中可以与“piPSC”互换使用。稳定重编程细胞没有经过完全重编程，从而细胞表观基因组(epigenome)没有总体重塑(global remodeling)。稳定重编程细胞是多能干细胞，并能进一步重编程为iPSC(如本文对该术语的定义)，或者可分化为不同的谱系。在一些实施方式中，部分重编程的细胞表达来自于所有三个胚层(即内胚层、中胚层或外胚层这三个胚层)的标记物。内胚层细胞的标记物包括：Gata4、FoxA2、PDX1、Noda1、Sox7和Sox17。中胚层细胞的标记物包括：Brachycury、GSC、LEF1、Mox1和Tie1。外胚层细胞标记物包括：cripto1、EN1、GFAP、Islet 1、LIM1和Nestin。在一些实施方式中，部分重编程的细胞为未分化细胞。
术语“表观基因组重塑”是指基因组的化学修饰不改变细胞中基因组序列或基因的碱基对的序列，但改变表达。
术语“表观基因组总体重塑”是指基因组的化学修饰已经发生，其中并没有来自分化细胞的先前基因表达的记忆(从中衍生出重编程细胞或iPSC)。
术语“表观基因组不完全重塑”是指基因组的化学修饰已经发生，其中存在来自分化细胞的先前基因表达的记忆(从中衍生出稳定重编程细胞或piPSC)。
本文使用的术语“表观遗传重编程(epigenetic reprogramming)”是指在细胞中通过不改变基因组序列或基因碱基对序列的化学修饰而改变基因的表达模式。
本文所用的术语“表观遗传”是指“基因组上(upon genome)”。不改变基因序列、但影响基因表达的DNA的化学修饰也可以被遗传。表观遗传也称为翻译后修饰或“PTM”，对DNA是很重要的，例如，在印记和细胞重编程中。这些修饰包括，例如，DNA甲基化、泛素化(ubiquitination)、磷酸化、糖基化、SUMO化(sumoylation)、乙酰化、S-亚硝基化或亚硝基化、瓜氨酸化(citrullination)或去亚胺基化(deimination)、类泛素化(neddylation)、OClcNAc、ADP-核糖基化、羟基化、fattenylation、ufmylation、异戊烯基化、豆蔻酰化(myristoylation)、S-棕榈酰化(S-palmitoylation)、酪氨酸硫酸盐化(tyrosinesulfation)、甲酰化和羧化。
本文使用的术语“多能(pluripotent)”是指具有在不同的条件下分化为所有三种胚层细胞层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞类型特征的能力的细胞。使用例如裸鼠畸胎瘤形成试验，通过它们能分化为所有三种胚层的能力初步表征多能细胞。多能性还可以通过胚胎干(ES)细胞标记物的表达来证明，尽管优选的多能性的测试是证明分化成三个胚层中每一胚层的细胞的能力。在一些实施方式中，多能干细胞为未分化的细胞。
本文使用术语“多能性”或“多能状态”是指满足下述条件的细胞：具有分化为所有三种胚层——内胚层(肠组织)、中胚层(包括血、肌肉和血管)、外胚层(如皮肤和神经)——的能力，并且通常在相当长的一段时间内具有在体外分化的潜能，例如，大于1年或超过30代。
“专能细胞”中使用的术语“专能(multipotent)”是指能够分化成一些但并非全部来自所有三种胚层的细胞。因此，专能细胞是部分分化的细胞。专能细胞在本领域是公知的，专能细胞的例子包括：成体干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。专能意味着干细胞可能在给定的谱系中会形成许多类型的细胞，但不形成其它谱系的细胞。例如，专能造血干细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但它不能形成神经元。
术语“专能性”是指发育多功能性的程度小于全能和多能的细胞。
术语“全能性(totipotency)”是指具有分化程度描述为能制造成年体内以及包括胎盘的胚外组织中所有细胞的细胞。受精卵(合子)在早期的核裂细胞(卵裂球)阶段是全能的。
术语“分化的细胞”意味着其原生形式并非多能(该术语如本文所定义)的任何初级细胞。术语“分化的细胞”也包括部分分化的细胞，如专能细胞、或者是稳定的非多能、部分重编程的细胞。需要注意的是，将许多初级细胞置于培养基可导致部分细胞丧失全部分化特征。因此，该细胞的简单培养包含在分化的细胞这一术语中，并且并没有使得这些细胞成为非分化细胞(例如，未分化的细胞)或多能细胞。分化的细胞转变为多能性需要在培养基中部分丧失分化特征刺激以外的重编程刺激。重编程的细胞也具有能够扩展传代而没有丧失生长潜能的特征，而与之相比的初级细胞母体一般在培养基中只有有限数量的部分具有该能力。在一些实施方式中，术语“分化的细胞”也指由较少特化细胞类型(例如，未分化的细胞或重编程的细胞)衍生出的更多特化细胞类型的细胞，其中细胞已经历了细胞分化过程。
本文使用的术语“体细胞”是指除了生殖细胞、存在于或从植入前胚胎获得的细胞、以及该细胞在体外增殖获得的细胞以外的任何细胞。换句话说，体细胞是指相对于生殖细胞的、构成有机体的任何细胞。在哺乳动物中，生殖细胞(也被称为“配子”)是精子和卵子在受精过程中融合产生的称为合子的细胞，从中发育成整个哺乳动物胚胎。在哺乳动物体中，除了精子和卵子、由它们获得的细胞(配子)和未分化的干细胞外的其它细胞类型均为体细胞：内脏、皮肤、骨、血液、和结缔组织均由体细胞构成。在一些实施方式中，体细胞是“非胚胎体细胞”，是指不存在于胚胎或不从胚胎获得的细胞、以及不会从该细胞在体外增殖得到的体细胞。在一些实施方式中，体细胞是“成体体细胞”，是指存在于或从除了胚胎或胎儿以外的生物体的细胞、或从该细胞在体外增殖得到的细胞。除另有指明外，对分化的细胞重编程的方法可以在体外和体内实施(当分化的细胞存在于受试者体内时在体内实施，当分离后的分化的细胞保留在培养基内时在体外实施)。在一些实施方式中，当分化的细胞或分化的细胞群在体外培养时，分化的细胞可以培养在组织切片培养基中，例如Meneghel-Rozzo等人，(2004)，Cell Tissue Res，316(3)：295-303中的描述，其全部内容通过引用并入本文中。
本文使用的术语“成体细胞”是指在胚胎发育之后遍布整个机体的细胞。
在细胞个体发育过程的背景下，术语“分化”是相对的概念，“分化的细胞”是比其前体细胞的发育途径进展更深远的细胞。因此，在一些实施方式中，本文所定义的重编程的细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(如中胚层的干细胞)，其可依次进一步向深远的途径分化为其它前体细胞类型(如组织特异性前体，例如，心肌细胞的前体)，然后成为终末期分化的细胞，其在特定组织类型中起特征性作用，并可能会或可能不会保留进一步增殖的能力。
所使用的术语“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚的内细胞团的多能干细胞(见美国专利5,843,780、6,200,806，通过引用的方式并入本文)。该细胞可类似地从来源于体细胞核转移的胚泡的内细胞团中获得(参见例如，美国专利号5,945,577、5,994,619、6,235,970，通过引用的方式并入本文)。胚胎干细胞的区别技术特征决定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有一个或多个胚胎干细胞的独特特征，使得该细胞可以区别于其它细胞，那么该细胞具有胚胎干细胞的表型。示例性的胚胎干细胞区别特征包括但不限于：基因表达谱、增殖能力、分化能力、染色体核型(karyotype)、对特定培养条件的响应等。
术语“表型”是指不管实际的基因型，将细胞或有机体限定于一组特定的环境条件和因素的一个或若干总的生物学特征。
本文使用的术语“分离的细胞”是指从最初被发现时的有机体中移除的细胞、或该细胞的后代。任选地，细胞已在体外培养，例如在其它细胞的存在下培养。任选地，该细胞随后被引入第二有机体，或将该细胞(或它的后代)重新引入到它被分离的有机体中。
对于分离的细胞群，本文使用的术语“分离的群”是指已经被移除的、从混合或非均质细胞群分离的细胞群。在一些实施方式中，分离的群与非均质细胞群(分离的群从中分离或富集)相比是基本上纯净的。
对于特定的细胞群，术语“基本上纯净”是指相对于构成总细胞群的细胞，至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％、最优选至少约95％纯净的细胞群。另外，对于细胞群，术语“基本上纯净”或“实质上纯化”是指包含少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％、或少于1％的细胞不是本文对术语的定义所指定的细胞或它们的后代。
术语“富集”或“富集的”在本文中可互换使用，并表示一类细胞的产率(分数)比在起始的培养或制备中该类细胞的分数增加至少10％。
术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中可互换使用，是指细胞复制多个其自身复制品(例如，倍增)的过程。在一些实施方式中，重新编程的细胞在很长的期间和/或数月至数年，仍能够通过分裂为相同的未分化的细胞而自我更新(例如，多能或非特化的细胞类型)。在某些情况下，细胞增殖是指通过单个细胞的重复分裂成两个相同的子细胞的过程实现的重编程的细胞的扩张。
本文使用的术语“细胞培养基”(在本文中也称为“培养基”或“介质”)是指含有维持细胞生存力并支持增殖的营养素的用于培养细胞的介质。细胞培养基可以含有适当组合的任意下列物质：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其它糖、抗生素、血清或血清替代品、以及诸如肽生长因子的其它组分。通常用于特定细胞类型的细胞培养基为本领域的技术人员所知。
本文使用的术语“谱系”是指具有共同的祖先或具有共同的发育命运的细胞。仅作为举例，内胚层起源的细胞或“内胚层谱系”意味着由内胚层细胞衍生的、并可按内胚层谱系限定的途径分化的细胞，例如一个或多个发育谱系途径产生最终的内胚层细胞，随后可以分化为肝细胞、胸腺、胰腺、肺、肠。
干细胞(例如分离的干细胞，如从受试者分离的胚胎干细胞)可与RAR激动剂接触任意的时间。例如，干细胞可与RAR激动剂接触12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周或更久。在一个非限制性的例子中，RAR激动剂(溶解于乙醇或DMSO)加入到最终浓度为10nM至3nM的MSC培养基中，加入到培养基中的RAR激动剂溶液的体积是0.1％。
不希望束缚于理论，将干细胞与RAR激动剂接触诱导或刺激干细胞以谱系定向的方式分化为特定谱系。例如，将干细胞与RAR激动剂接触可以诱导或刺激干细胞分化为选自于由以下谱系所组成的组：中胚层谱系、内胚层谱系、外胚层谱系、神经元谱系、间充质谱系和造血谱系。
在本发明这个和其它方面的一些实施方式中，诱导/刺激的谱系为间充质谱系。
在一些实施方式中，诱导的间充质谱系选自于由以下谱系所组成的组：成肌性(myogenic)、成骨性(osteogenic)、成软骨性(chodrogenic)、成腱性(tendonogenic)、成韧带性(ligamentogenic)、成骨髓基质性(maroow stromagenic)、成脂肪性(adipogenic)、以及成真皮性(dermogenic)。
本文使用术语“间充质干细胞”是具有自动复制并分化为一个或更多间充质细胞能力的间充质细胞。与中胚层细胞类似，间充质干细胞是多能干细胞，能分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、基质细胞、腱细胞等。尽管自动复制和多能的间充质细胞在发育过程中丧失了这些能力，间充质干细胞已知在经历发育后在成体内存留很长一段时间。
本文使用术语“间充质细胞”是指成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、基质细胞、腱细胞和形成间充质组织的其它细胞、以及可以分化为这些细胞的间充质干细胞。出现在胚胎形成期间的间充质细胞、动物个体中的间充质细胞、以及由多能干细胞在体外或体内分化生成的间充质细胞都包含于术语“间充质细胞”。
对于从业者而言，这些干细胞可以来自或获得于任何可用的来源。
间充质干细胞可以通过在本领域中若干公知的方法获得。参见例如，美国专利5,486,358、6,387,367和7,592,174，以及美国专利申请公开号2003/0211602，将其内容引入本文作为参考。间充质细胞可以包括自体间充质干细胞，即从需要治疗的受试者取得的一个或多个细胞(即供体和受体是同一个人)。自体间充质干细胞具有避免任何对细胞免疫排异的优点。或者，细胞可以是异源的，例如从供体取得。第二受试者可以是相同的或不同的物种。通常，当细胞来自于供体时，他们应来自与受体充分免疫相容的供体(即，不能是移植排斥的受试者)，以减轻或消除免疫抑制的需要。在一些实施方式中，从异种来源取得细胞，即，经基因工程改造使与受体或受体的物种充分免疫相容的非人哺乳动物。确定免疫相容性的方法在本领域中是公知的，包括组织配型来评估HLA和ABO决定簇的供体-受体相容性。参见例如，Transplantation Immunology，Bach和Auchincloss著，(Wiley，John&Sons,Incorporated，1994年)。
在一些实施方式中，间充质干细胞来自去分化的体细胞(重编程的细胞)。例如，体细胞去分化为多能干细胞，用于例如对内胚层来源的细胞直接重编程。不希望束缚于理论，去分化的细胞具有与其衍生前相比更原始的细胞类型相类似的形态，例如，间充质的形态。
在一些实施方式中，间充质干细胞是再分化的间充质干细胞。本文使用的术语“再分化的间充质干细胞”是指由去分化的间充质干细胞分化得到的间充质干细胞。
在一些实施方式中，间充质干细胞处于稳定化的状态，例如，将细胞从受试者中取出并以使其存储一段时间的方式进行处理。例如，细胞可以被冷冻，例如，使用在本领域中已知的方法冷冻原代细胞，使得细胞解冻时是活的。例如，在本领域中冷冻和解冻胚胎而产生活哺乳动物的已知方法可适用于本发明的方法。此类方法包括使用液态氮，例如与一种或多种冷冻保护剂、如防止细胞冻融操作的试剂共同使用。
从受试者或供体处获得的间充质干细胞群是基本上纯净的。群的纯度可使用在本领域中已知的方法进行测定和控制。例如，可以使用荧光激活细胞分拣的方法。
不希望束缚于理论，任何合适的细胞培养基均可用于本发明的体外或离体方法。例如，MSC可以保存在含有10％胎牛血清的α-MEM培养基中。
在本发明这方面和其它方面的一些实施方式中，间充质干细胞是骨髓衍生的间充质干细胞(BMSC)。
在本发明这方面和其它方面的一些实施方式中，间充质干细胞是鼠骨髓衍生的间充质干细胞。
在本发明这方面和其它方面的一些实施方式中，间充质干细胞是人间充质干细胞(hMSC)。
本发明人还发现经RAR激动剂处理的干细胞可用于修复或再生肌肉。因此，在另一个方面，本发明提供了在受试者中进行肌肉修复或再生的方法，该方法包括：向受试者给予干细胞群，其中，所述群的至少一个细胞已与RAR激动剂接触。
在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：(i)将至少一个干细胞与RAR激动剂接触；以及(ii)将所述干细胞给予具有损伤的肌肉组织的受试者。
在将至少一个干细胞与RAR激动剂接触所需的时间后，处理过的干细胞可以立刻给予或在给予受试者前储存一段时间。不作任何限定，所述一段时间可为数分钟到数天。
给予受试者的经RAR激动剂处理的干细胞数量范围为单个细胞到大于106。
本发明的另一个方面涉及在受试者中进行肌肉修复或再生的方法，所述方法包括：向受试者给予干细胞群，其中如本文所述，部分干细胞用RARγ激动剂进行预处理。在一个实施方式中，预处理干细胞的部分是约50％(1:1的比例)。使用较高比例的预处理干细胞群(例如，2:1、3:1、4:1、5:1，预处理干细胞:未处理干细胞)以及较低比例的预处理干细胞群(1:2、1:3、1:4、1:5，预处理干细胞:未处理干细胞)在该方法中同样视为有用。例如，预处理干细胞的部分可以是约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或45％。预处理干细胞的部分也可以是约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
肌肉修复或再生的方法包括：向受试者肌肉损伤部位给予包含预处理和非处理的干细胞的组合物，从而在该部位使肌肉修复或再生。在一个实施方式中，损伤为复合组织损伤。复合组织损伤是多个组织损伤的部位，并可包括一处或多处的肌肉、骨、腱、韧带、和脂肪组织的损伤。各种组合是可设想的。在一个实施方式中，复合组织损伤包括肌肉和骨。在一个实施方式中，复合组织损伤包括肌肉和至少一个另外的组织(例如，韧带、腱、软骨、骨、皮肤、脂肪和血管)。在一个实施方式中，复合组织损伤包括肌肉和至少两个另外的组织(例如，两处以上的韧带、腱、软骨、骨、皮肤、脂肪和血管)。在一个实施方式中，另外的组织损伤包括骨。在一个实施方式中，复合组织损伤包括肌肉和至少三个另外的组织(例如，三处以上的韧带、腱、软骨、骨、皮肤、脂肪和血管)。在一个实施方式中，另外的组织损伤包括骨。在一个实施方式中，复合组织损伤包括肌肉和至少四个另外的组织。在一个实施方式中，另外的组织损伤包括骨。除本文所述以外另外的组织类型也包含于损伤(与肌肉损伤结合)之中。
如以上讨论，本发明人已发现通过急性或慢性暴露于视黄酸受体γ(RARγ)激动剂，祖干细胞可被诱导发生肌肉分化。因此，在一个方面，本发明提供了诱导或刺激干细胞以谱系定向的方式分化为单一的特定谱系，所述方法包括使干细胞与视黄酸受体激动剂接触。
在本发明这方面和其它方面的一些实施方式中，特定的谱系选自于由以下谱系所组成的组：中胚层谱系、内胚层谱系、外胚层谱系、神经元、造血谱系、以及上述谱系的任意组合。
在本发明这方面和其它方面的一些实施方式中，特定的谱系为间充质谱系。
在本发明的这方面和其它方面的一些实施方式中，间充质谱系选自于由以下谱系所组成的组：成肌性(myogenic)、成骨性(osteogenic)、成软骨基因性(chodrogenic)、成腱性(tendonogenic)、成韧带性(ligamentogenic)、成骨髓基质性(maroow stromagenic)、成脂肪性(adipogenic)、以及成真皮性(dermogenic)。
试剂盒
在另一个方面，本发明提供用于肌肉修复或再生的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含RAR激动剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含干细胞群。RAR激动剂可以预先配制成用于给药的药物制剂，或者可在试剂盒中提供用于配制成药物制剂的成分。
在一些实施方式中，试剂盒包含RAR激动剂，其中所述激动剂配制为外用制剂。
在一些实施方式中，试剂盒包含干细胞群，其中，所述群中的至少一个细胞通过将该细胞与RAR激动剂接触而进行预处理。
除了上述组分以外，所述试剂盒还可包括信息资料(informational material)。所述信息资料可为说明性资料、指导性资料、销售资料或其它与本文描述的方法和/或将化合物用于本文描述的方法有关的资料。例如，所述信息资料描述将制剂给予受试者的方法。所述试剂盒还可包括递送装置。
在一个实施方式中，所述信息资料可包括以合适的方式给予所述制剂的说明书，所述方式例如以合适的剂量、剂型或给药方式给予所述制剂(例如，本文描述的剂量、剂型或给药方式)。在另一个实施方式中，所述信息资料可包括鉴定合适受试者的说明书，所述受试者例如为人，又例如为成人。所述试剂盒的信息资料并不受限于其形式。在许多情况下，所述信息资料(例如，说明书)可以印刷品的形式(例如，印刷文本、附图、和/或照片，例如，标签或印张)提供。然而，所述信息资料还可以其它形式提供，如盲文、计算机可读资料、录像或录音。在另一个实施方式中，所述试剂盒的信息资料为链接或联系信息，例如，实际地址、电子邮件地址、超链接、网站或电话号码，在这些信息资料中，试剂盒的使用者可获得大量关于本文描述的方法中的制剂和/或其使用的信息。当然，所述信息资料也可以任何组合形式提供。
在某些实施方式中，所述制剂的单一组分可以提供于一个容器中。或者，可期望在两个以上的容器中分别提供所述制剂的组分，例如，一个容器用于提供寡核苷酸制剂、至少另一个容器用于提供载体化合物。可将不同组分例如根据随试剂盒提供的说明书进行组合。所述组分可根据本文描述的方法组合，例如，以制备和给予药物组合物。
除了制剂以外，所述试剂盒的组合物还可包括其它成分，如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂、和/或用于对本文描述的状况或障碍进行治疗的第二试剂。或者，所述其它成分可包括于所述试剂盒中，但位于与制剂不同的组合物或容器中。在这些实施方式中，所述试剂盒可包括用于对制剂和其它成分进行混合的说明书、或用于将寡核苷酸与其它成分共同使用的说明书。
所述RAR激动剂可以任何形式提供，例如，液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述制剂基本上纯净和/或无菌。当以液体溶液形式提供所述试剂时，所述液体溶液优选是水溶液，其中优选无菌水溶液。当以干燥形式提供所述制剂时，通常通过加入合适的溶剂进行复水。所述溶剂(例如，无菌水或缓冲剂)可任选地在试剂盒中提供。
在某些实施方式中，所述试剂盒包含分开的用于所述制剂和信息资料的容器、分隔器或区室。例如，所述制剂可置于瓶、小瓶(vial)、或注射器中；所述信息资料可置于塑料套筒或包中。在其它实施方式中，将试剂盒的各个要素置于单一、未分隔的容器中。例如，所述制剂置于已贴有标签形式的信息资料的瓶、小瓶或注射器中。
在某些实施方式中，所述试剂盒包括多个(例如，一组)单独的容器，所述容器各自包含一个或多个单位剂型的所述制剂。例如，所述试剂盒包括多个注射器、安瓿瓶、箔包装或泡罩包装，其各自包含一单位剂型的所述制剂。所述试剂盒的容器可以是气密和/或防水的。
定义
除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除在其所属领域已具有的含义。提供所述定义以辅助描述本文描述的方面的具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。另外，除非上下文另有要求，单数术语涵盖复数，并且复数术语涵盖单数。
本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定的实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外成分。
术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
除非文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。术语“包含/包括(comprises)”意思是“含有(includes)”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
本文使用的术语“降低(decrease)”、“减少(reduced/reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”都意味着减少有统计学意义的量。然而，为避免疑义，“减少(reduced/reduction)”或“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”表示相对于参比水平降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括降低100％(如，相对于参比样品的缺乏水平)、或相对于参比水平降低在10％到100％之间的任意量。
本文使用的术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”通常都意味着增加有统计学意义的量；为避免疑义，术语“增加(increased/increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”表示相对于参比水平增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括增加100％、或相对于参比水平增加在10％到100％之间的任意量；或相对于参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或增加在2倍和10倍之间的任意量、或是更大量的增加。
术语“提高”是指以统计学显著的量的增加；为避免任何疑问，术语“提高”是指相对于参比水平增加至少5％、至少10％、至少15％、在至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、或至少10倍以上。
术语“统计学显著(statistically significant)”或“显著地(significantly)”表示统计显著性，并且通常意味着参比水平以上或以下两个标准差(2SD)。这个术语表示统计证明存在差异。它被定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用p值来作出决定。
本文使用的术语“离体”是指从生物体移出并在生物体以外的环境(例如，在试管内)培养的细胞。
除非本文另有定义，与本申请有关的科学术语和技术术语所表达的含义均与本领域普通技术人员公认的理解方式相同。此外，除非上下文需要，单数形式的术语均包括复数含义，复数形式的术语均包括单数含义。
应该理解的是，本发明并不只局限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂等因素，并可能发生变化。本文所使用的术语仅是出于描述特定实施方式的目的，并非用来限定本发明的范围。本发明的范围由权利要求书单独确定。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。
在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法、及其各组分，对本发明是必需的，仍然开放性地包含必需或非必需的未指定元素(“包括”)。在一些实施方式中，在对化合物、方法或其相关组分的说明中所包含的其它元素被限定为对本发明基本特征和新颖性特征不产生实质影响的元素(“基本由…组成”)。这等同地适用于所描述的方法中的步骤、以及其中的组合物及其组分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法、及其各成分意在排除对于组分、组合物或方法而言不被视为必需要素的任何元素成分(“由…组成”)。
对于未明确指出的内容，本领域技术人员将会理解的是，本文所描述并解释的各种实施方式中的任意一个可进行进一步的修改，以包含本文任意其它实施方式中所示的特性。
出于记载和公开的目的，在此以引用的方式清楚地将本发明指明的所有专利和其他出版物并入，例如，在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。提供此类出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。在这点上，不应将任何事物视为发明人无权根据在先发明或因任何其他原因使本发明的内容早于这些公开内容的认定。所有关于日期的陈述或关于此类文件内容的表达均基于申请人可得的信息，不构成对此类文件的日期或内容的正确性的任何认定。
本发明为以下编号的段落中任一项所定义。
1.一种使受试者肌肉修复或再生的方法，所述方法包括给予具有损伤肌肉组织的受试者治疗有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂，从而修复或再生所述损伤肌肉组织。
2.如段1所述的方法，其中，所述给予是局部给予或全身给予。
3.如段1-2中任一项所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者中内源性类视黄醇信号增强的时间段内，所述信号增强由所述受试者遭受肌肉组织损伤而引起。
4.如段1-3中任一项所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤3天后。
5.如段4所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤约4天后。
6.如段4所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤约5天后。
7.如段4所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤约6天后。
8.如段4所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤约7天后。
9.如段4所述的方法，其中，所述给予开始于所述受试者遭受所述肌肉组织损伤约5天后，并且持续至所述受试者遭受所述肌肉组织损伤后的至少第7天。
10.如段9所述的方法，其中，所述给予持续至所述受试者遭受所述肌肉组织损伤后的至少第9天。
11.如段1-10中任一项所述的方法，其中，所述RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药和药学上可接受的盐。
12.如段1-11中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是由物理损伤或事故、疾病、感染、过度使用、丧失血液循环、或肌肉萎缩或损耗造成。
13.如段1-11中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是营养不良的肌肉或老化肌肉。
14.如段1-11中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是由肌肉萎缩和/或损耗造成。
15.如段1-14中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
16.如段1-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者为小鼠。
17.如段1-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。
18.如段1-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予所述受试者抗炎剂。
19.一种使受试者肌肉修复或再生的方法，所述方法包括在受试者肌肉损伤部位给予多能干细胞或专能干细胞，从而使该部位肌肉修复或再生，其中，所述多能干细胞或专能干细胞已利用RARγ激动剂进行预处理。
20.如段19所述的方法，其中，所述肌肉损伤为复合组织损伤。
21.如段20所述的方法，其中，所述复合组织损伤包含对肌肉和骨的损伤。
22.如段19-21中任一项所述的方法，其中，所述预处理的干细胞与未处理的干细胞联合给予。
23.如段22所述的方法，其中，所述预处理的干细胞与所述未处理的干细胞以1:1的比例给予。
24.如段19-23中任一项所述的方法，其中，所述预处理的干细胞已利用RARγ激动剂预处理约3天的时间。
25.如段19所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
26.如段19-25中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为间充质干细胞。
27.如段19-26中任一项所述的方法，其中，所述给予为局部给予。
28.如段19-27中任一项所述的方法，其中，所述给予是通过将所述细胞移植入所述受试者中而进行。
29.如段19-28中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞对所述受试者而言是自体的或异源的。
30.如段19-29中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为哺乳动物多能干细胞。
31.如段19-30中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为啮齿动物多能干细胞。
32.如段19-30中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
33.如段19-32中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予所述受试者抗炎剂。
34.如段19-33中任一项所述的方法，其中，所述RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药和药学上可接受的盐。
35.如段19-34中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是由物理损伤或事故、疾病、感染、过度使用、丧失血液循环、或肌肉萎缩或损耗造成。
36.如段19-34中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是营养不良的肌肉或老化肌肉。
37.如段19-34中任一项所述的方法，其中，所述损伤肌肉组织是由肌肉萎缩和/或损耗造成。
38.一种诱导或刺激分离的间充质干细胞在体外成肌分化的方法，所述方法包括使所述间充质干细胞与有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂接触。
39.如段38所述的方法，其中，接触时间选自于由以下时间所组成的组：约12小时、约1天、约2天、以及约3天。
40.一种诱导或刺激多能干细胞谱系-定向分化成为间充质谱系的方法，所述方法包括使所述多能干细胞与有效量的视黄酸受体γ(RARγ)激动剂接触。
41.如段40所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
42.如段40-41中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为间充质干细胞。
43.如段40-42中任一项所述的方法，其中，所述间充质谱系选自于由以下谱系所组成的组：成肌性、成骨性、成软骨性、成腱性、成韧带性、成骨髓基质性、成脂肪性、以及成真皮性的谱系。
44.如段40-43中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为哺乳动物多能干细胞。
45.如段40-44中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为啮齿动物多能干细胞。
46.如段40-45中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
47.如段40-46中任一项所述的方法，其中，所述RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药和药学上可接受的盐。
48.一种包含间充质干细胞的组合物，其中，所述间充质干细胞的一部分已经通过与RARγ激动剂接触而进行预处理，从而生成预处理的间充质干细胞。
49.如段43所述的组合物，其中，经预处理的所述间充质干细胞的一部分选自于由以下比例所组成的组：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、以及90％。
50.一种包含多能干细胞群的组合物，其中，该群中至少一个细胞与RARγ激动剂接触，从而生成预处理的多能干细胞。
51.如段50所述的组合物，其中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
52.如段50-51中任一项所述的组合物，其中，所述多能干细胞为间充质干细胞。
53.如段50-52中任一项所述的组合物，其中，所述干细胞为分离的干细胞。
54.如段50-53中任一项所述的组合物，其中，所述干细胞为哺乳动物干细胞。
55.如段50-54中任一项所述的组合物，其中，所述干细胞为鼠科动物干细胞。
56.如段50-54中任一项所述的组合物，其中，所述干细胞为人干细胞。
57.如段50-56中任一项所述的组合物，其中，所述RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药和药学上可接受的盐。
58.包含如段50-57中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
59.一种用于修复或再生肌肉的试剂盒，所述试剂盒包含如下组分中的至少一种：
RARγ激动剂；
RARγ激动剂和干细胞；或
如段48-58中任一项所述的组合物。
60.如段59所述的试剂盒，其中，所述干细胞为诱导多能干细胞。
61.如段59-60中任一项所述的试剂盒，其中，所述干细胞为间充质干细胞。
62.如段59-61中任一项所述的试剂盒，其中，所述RARγ激动剂被制剂在药物组合物中。
63.如段59-62中任一项所述的试剂盒，其中，所述RARγ激动剂被制剂用于局部施用。
64.如段59-63中任一项所述的试剂盒，其中，所述干细胞为分离的干细胞。
65.如段59-64中任一项所述的试剂盒，其中，所述干细胞为哺乳动物干细胞。
66.如段59-65中任一项所述的试剂盒，其中，所述干细胞为啮齿动物干细胞。
67.如段59-65中任一项所述的试剂盒，其中，所述干细胞为人干细胞。
68.如段59-67中任一项所述的方法，其中，所述RARγ激动剂选自于由以下化合物所组成的组：CD-271(6-(4-甲氧基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-394、CD-437(6-(4-羟基-3-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基苯基)-2-萘羧酸)；CD-1530(4-(6-羟基-7-三环[3.3.1.1(3,7)]癸烷-1-基-2-萘基)苯甲酸)；CD-2247；帕罗伐汀(4-[(1E)-2-[5,6,7,8-四氢化-5,5,8,8-四甲基-3-(1H-吡唑-1-基甲基)-2-萘基]-乙烯基]苯甲酸)；BMS-270394(3-氟-4-[(R)-2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；BMS-189961(3-氟-4-[2-羟基-2-(5,5,8,8-四甲基-5,6,7,8-四氢化-萘-2-基)-乙酰氨基]苯甲酸)；CH-55(4-[(E)-3-(3,5-二-叔丁基-苯基)-3-氧代-丙烯基]苯甲酸)；6-[3-(金刚烷-1-基)-4-(丙-2-炔基氧基)苯基]萘-2-羧酸；5-[(E)-3-氧代-3-(5,5,8,8-四氢化萘-2-基)丙烯基]噻吩-2-羧酸；以及它们的对映异构体、衍生物、前药和药学上可接受的盐。
69.如段59-68中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含使用说明书。
本发明通过下列实施例进一步进行阐述。提供这些实施例以帮助理解本发明，而不应被理解为对本发明的限制。
实施例
实施例1
方法
骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)的分离和培养。MSC：对之前描述的方法(ref)稍作修改进行MSC的分离。简要地说，将从4-6周龄小鼠的长骨(long bones)中取得的小鼠骨髓细胞(1-2×107)接种到100mm的培养皿中，在37℃下孵育3小时以使贴壁细胞贴壁，然后用PBS冲洗两次以除去未贴壁的细胞。骨髓衍生的MSC在12-15天的培养后形成贴附集落。将原代培养物传代以分散集落形成细胞(第1代)。然后当这些细胞达到70％汇合时将其再次传代培养。在第一代之前，细胞维持在含20％胎牛血清(FBS；Equitech-Bio公司)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的复合物(Biofluids公司)、以及55μM 2-巯基乙醇(Gibco BRL；Invitrogen公司)的α-MEM培养基(Gibco BRL；Invitrogen公司)中。第一代之后，除非另有说明，细胞维持在10％FBS的α-MEM中。
从B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J小鼠(Jax小鼠)中分离表达DsRED的MSC。从携带H2K-GFP的转基因小鼠中获得表达GFP的MSC(Dominici等.Genesis 42：17-22(2005))。
细胞移植：将经RAR激动剂预处理或不经RAR激动剂预处理的MSC(1×105)悬浮在10μl无血清DMEM中并置于如本文所述而创造的肌肉缺损中。
组织学程序：为了检查肌肉组织结构，将样品在4％的PFA中固定并包埋入石蜡中。使用H&E(http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/HE_Mayer.htm)或Masson的三色染色溶液(http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/masson_trichrome.htm)对5μm连续切片进行染色。为了检测脂肪组织，将4％PFA固定的样品在PBS中的20％蔗糖中平衡，包埋入OCT化合物中，然后通过恒冷切片机(cryostat)切片。干燥10μm的冰冻切片，复水后再以油红O染色(http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/oil_red_o.htm)。
免疫荧光。为了检测组织切片中的各种抗原，将5μm石蜡切片去石蜡化、复水，然后在37℃用0.02N的HCl中的0.1％的胃蛋白酶处理15分钟。切片用PBS-T洗涤三次，并在含0.3％BSA的10％正常山羊血清中封闭。切片与一抗孵育，用PBS-T洗涤三次，然后与二抗孵育。抗原、抗体及其稀释液如下所示。
MyoD:抗-MyoD；sc-760(Santa Curz，1:100)，抗-兔Alexa Flour 488(Invitrogen，1:500)
Myf5:抗-Myf5；sc-302(Santa Curz，1:100)，抗-兔Alexa Flour 488(Invitrogen，1:500)
抗-Laminina2；ALX-804-190(Enzo Life Science，1:250)，抗-兔Alexa Flour594(Invitrogen，1:500)
肌球蛋白重链(MHC):抗-MHC；MF-20(Developmental Studies Hybridoma Bank，1:25)，抗-小鼠Alexa Flour 588(Invitrogen，1:500)
骨钙蛋白(Osteocalcin，OC):抗-OC；M173(Takara，1:500)，抗-兔Alexa Flour594(Invitrogen，1:500)
绿色荧光蛋白(GFP):缀合有生物素的抗-GFP；NB100-1678(Novus，1:250)，链霉亲和素Alexa Flour 488(Invitrogen，1:500)
RAR激动剂的局部和全身给药。如在先所述的灌胃方法进行RAR激动剂的全身给药(Shimono等，J.Orthop.Res.28：271-277，2010)。使用带有26G针的Hamilton注射器注射RAR激动剂(溶于DMSO中)进行RAR激动剂的局部给药。
结果
研究了类视黄醇激动剂对小鼠骨髓衍生的间充质干细胞(BMSC)培养在成肌分化方面的分化效果。使用标准方法从6周龄小鼠的股骨和胫骨(femurs and tibias)制备BMSC并在0.1％的DMSO(介质：对照)、1μM的全反式视黄酸(RA)(商购自Sigma公司)、1μM的RARα激动剂(得自NuRx制药公司)或30nM的RARγ激动剂(CD1530，可商购)存在的情况下维持在5％FBS的DMEM中7天。许多细长的多核肌细胞只在RARγ激动剂处理的培养中形成。
在存在或不存在RARγ激动剂(CD1530，100nM)的条件下，培养取自间充质干细胞系的细胞10天。对培养物进行处理以利用MyoD或Myf5抗体进行免疫染色处理或利用核染料DAPI染色。对照未处理细胞含有检测不到的量的MyoD和Myf5，但两种蛋白质明显地存在于RARγ激动剂处理的培养物中。结果表明在间充质干细胞(MSC)培养中由于RARγ激动剂使得MyoD和Myf5水平升高。
使用肌肉缺损小鼠模型研究通过RARγ激动剂给药而带来的肌肉修复刺激。在8周龄小鼠小腿或胫前肌(calf or anterior tibial muscles)进行电烧灼形成2.0mm×2.0mm×2.0mm的缺损以制造圆形缺损。
在上述8周龄小鼠的小腿肌肉组织中制造圆形缺损(一处肌肉缺损/小鼠)。小鼠在损伤后第8天、第10天和第12天通过灌胃接受玉米油(介质)或300μg的RARγ激动剂(CD1530)/天。在第14天收集组织进行组织学分析。在第14天，对照小鼠中的肌肉缺损在很大程度上填充以瘢痕样纤维和结缔组织。通过免疫染色检测肌球蛋白重链(MHC)，这些瘢痕样组织全都是阴性的。与之不同，RARγ激动剂治疗的小鼠的肌肉缺损部位填充以许多细长的肌样细胞，并且这些细胞中许多都为MHC阳性。结果表明RARγ激动剂全身给药刺激肌肉修复。
在如上所述在胫前肌中心制造2×2×2mm缺损(一处肌肉缺损/小鼠)后，小鼠在损伤后第8天、第10天和第12天通过灌胃接受玉米油(介质)或300μg的RARγ激动剂/天。在第2周和第4周收集组织进行组织学分析。在小鼠损伤后的第4周收集对照和RARγ激动剂(CD1530)治疗的小鼠的损伤肌肉组织的宏观照片。在对照中，缺损清晰可见为白色斑点。与之不同，在RARγ激动剂治疗的小鼠中原始缺陷几乎没有可见的迹象。组织学分析表明在第2周和第4周，对照小鼠的肌肉组织缺损被脂肪和纤维组织的混合物占据。还注意到肌纤维之间的纤维组织沉积。然而，在RARγ激动剂治疗的小鼠中，肌肉缺损沿胫骨前肌的主要纵向轴线对齐填充有肌纤维。结果表明全身给予RARγ激动剂随着时间的推移完全修复了肌肉缺损。
在损伤4周后进行骨骼肌组织的组织学分析。将损伤4周后收集的肌肉组织样本的连续横向切片(与上文所讨论的相同的样本)用Masson三色染色或使用抗层粘连蛋白(肌细胞周围富含的细胞外蛋白)抗体进行免疫染色处理。在对照中，初始损伤部位几乎没有修复并在很大程度上被脂肪组织和纤维结缔组织(未被抗层粘连蛋白抗体染色)占据。与之不同，在RARγ激动剂治疗的动物中肌肉损伤几乎完全修复；修复组织强烈地被抗层粘连蛋白抗体染色。为了评价和量化骨骼肌组织结构的变化，拍摄三色染色连续切片的图像，并在多个限定的区域中通过ImagePro软件确定了肌肉纤维、脂肪和纤维组织的相对量。分析区域各自为9×9网格(约3×3mm)，其中包括原始损伤部位(2×2mm)。肌肉损伤引起总肌纤维面积减少，同时增加纤维和脂肪组织的面积。与之不同，CD1530治疗在很大程度上恢复了组织的组成。图1图示出了所测定的肌肉的相对量。
为了验证在肌肉的修复和再生中RARγ是必需的，通过上述方法在野生型(WT)和无RARγ小鼠中制造肌肉损伤。这些动物随后用γ-激动剂或介质(玉米油)处理。在损伤后第4周收集组织样本、切片并用Masson三色染色溶液染色。与上述讨论的结果一致，γ-激动剂治疗引起WT小鼠有效的肌肉修复。然而，对无RARγ小鼠具有最低疗效，无RARγ小鼠的肌肉缺损部位填充有脂肪和一些结缔组织细胞细胞并以纤维细胞内衬(lined)。这些结果表明：(1)γ-激动剂对肌肉修复的效果由RARγ介导；以及(2)RARγ对于骨骼肌组织的修复是必需的。
对不同的类视黄醇激动剂对骨骼肌修复的影响进行了研究。在4周的时间点时拍摄肌肉损伤部位的宏观照片。损伤肌肉组成的组织形态分析如图2所示。如上文所述的方法在8周龄小鼠中制造肌肉损伤缺损。小鼠在第8天、第10天和第12天通过灌胃接受玉米油(对照)、300μg泛激动剂视黄酸(RA)、900μg NRX195183(RARα激动剂)或300μg CD1530(RARγ激动剂)。损伤四周后收集组织样本，处理用于组织学分析，并进行组织形态计量学定量。在对照动物和RARα激动剂或RA治疗的动物中，由于脂肪组织替换肌肉，损伤部位清晰可见为大白斑。然而，在RARγ治疗的动物中，由于填充有修复的肌肉组织，损伤部位在第4周基本上是不可见的。为了量化该响应，对修复部位组织的连续切片进行三色染色并如上所述在所限定的区域内通过ImagePro软件对肌肉、脂肪和纤维组织的相对量进行定量分析。分析区域各自为9×9网格(约3×3mm)，其中包括原始损伤部位(2×2mm)。结果如图2所示。图中显示了从三只小鼠中取得的九个切片的平均值。“正常”来自于未损伤的正常肌肉中的肌肉组织组成。正如所预期的，对照动物的肌肉由90％的肌肉组织、7％的纤维组织和痕量的脂肪组织组成。肌肉损伤引起肌纤维面积从90％显著降低至33％，同时脂肪和纤维组织面积相应地增加。RA治疗适度地使肌纤维面积从33％(对照)提高至54％，但纤维组织面积显著增加。RARα激动剂NRX195183没有改善组织组成。与之不同，在CD1530治疗的动物中的修复组织的组成几乎是正常的。
对具有不同骨架结构的RARγ激动剂对肌肉修复的影响进行了研究。在上述讨论的实验中，显示γ-激动剂CD1530可以显著加快肌肉的修复；并且，对于该疗效而言，RARγ的表达是必需的。为了进一步验证这些结果并确定可能更有效的γ-激动剂，对其它三种结构不同的选择性RARγ激动剂(BMS270394、Palovarotene、以及CD437)进行了肌肉修复测试。由上述方法制造腿部肌肉损伤。各组小鼠自损伤后的第8天、第10天和第12天接受不同激动剂之一(100μg/灌胃/天)或介质。术后4周收集组织并进行如上测试。在对照中，肌肉损伤部位清晰可见为发白斑点，并有最小的肌肉修复；此外，纤维瘢痕组织存在于损伤的肌肉内。与之不同，每个γ-激动剂都诱导有效的肌肉修复；在三种被测试的激动剂中，BMS270394是最有效的并且完全恢复到正常肌肉结构。结果表明γ-激动剂在触发肌肉修复中是非常有效的。
对RARγ激动剂局部给药对肌肉修复的影响进行了研究。尽管在肌肉修复实验中并未观察到γ激动剂全身给药的主要副作用，但是在特定临床情况下可能有必要对其进行局部递送。当局部给药时，为了对这些药物的有效性进行测试，用上述方法制造肌肉损伤，并在术后第8天和第10天在损伤部位周围皮下注射3μg CD1530。在对照组注射介质，在第4周如上述方法收集并测试组织。在对照中，损伤部位清晰可见并主要由脂肪组织占据。然而，在CD1530治疗组中，肌肉缺损几乎完全被修复。γ-激动剂的分子量通常小于500，因此，这些药物可以软膏剂或其它剂型(除局部注射之外)从皮肤递送到更深的肌肉组织中。
在培养基中用介质(对照)或100nm CD1530对表达GFP的小鼠间充质干细胞处理3天，与Matrigel和1μg rhBMP2混合，然后移植至裸鼠中。移植两周后，收集异位组织群(ectopic tissue masses)进行分析。在对照中可观察到大量软骨内的骨形成(endochondral bone formation)；抗-GFP和抗-OC(骨钙蛋白)免疫染色显示移植的MSC有助于骨形成。然而，在移植有γ-激动剂预处理的MSC的小鼠中没有异位软骨内骨形成；这些细胞由GFP染色阳性而显示存在，但对OC染色阴性，并常常对齐(aligned)。一些细胞融合或处在融合过程中。因此，γ激动剂治疗有效引发MSC进行成肌分化途径。这些结果表明RARγ激动剂是间充质干细胞(MSC)成肌分化的引发因子。
为进一步测试γ激动剂引发MSC变为成肌谱系的能力，如上述讨论在裸鼠体内制造肌肉损伤缺损，并将由γ-激动剂预处理3天(或保持未处理)的表达DsRed的MSC移植到其中。移植2周后，收集损伤部位的组织并在荧光体立体显微镜下检查。然后将组织进行处理用于组织学分析。在植入γ-激动剂预处理的MSC的肌肉损伤部位处，荧光立体显微镜显示强烈的红色荧光信号，但在植入对照未处理的MSC(A，左侧)的部位几乎没有观察到荧光。用油红O染色显示在植入对照MSC的损伤部位存在大量脂肪组织(B，左侧)，但在植入γ-激动剂预处理的MSC的部位则没有这些细胞(B，右侧)。免疫荧光分析显示DsRed-阳性和γ-激动剂预处理的MSC有助于表达MHC的肌肉修复组织的形成(C，右侧)，但它们不存在于对照中。(DsRed，红色；MHC，绿色；DAPI，紫色)在上述实验中，在γ-激动剂全身给药4周内引起肌肉损伤缺损的修复。值得注意的是，类似的缺陷在移植γ-激动剂引发的MSC两周内便几乎完全被修复。因此，使用γ-激动剂预处理的MSC可以是非常有效的快速修复肌肉损伤的方法。这些结果表明γ-激动剂引发的MSC修复肌肉损伤。
实施例2
方法
除非另有说明，所有方法均按照实施例1中所描述的进行、或通过本领域中公知的标准程序进行。
通过用生物素化的抗-人TRA-1-85(1:250稀释液，R&D cat#BAM3195)以及抗层粘连蛋白(1:250,Enzy,ALX-804-190)与切片孵育进行人体细胞和肌球蛋白重链的免疫检测，洗涤，然后用Alexa Fluor488链霉亲和素和Alexa Fluor594抗大鼠IgG孵育。
结果
使用γ-激动剂预处理的人脂肪组织衍生的间充质干细胞修复肌肉损伤。
下述实验表明RARγ激动剂预处理的干细胞不仅使肌肉组织自己再生，并且促进宿主细胞的成肌分化。因此，这些细胞被称为“预处理的(pre-treated)”而不是“引发的(primed)”间充质干细胞，从而使术语“引发的”符合已被认可的定义(该术语在本领域中用于表示使细胞进行肌生成)。
为了测试用RARγ激动剂对人间充质干细胞进行预处理的效果，如上述方法在NOD小鼠(NOD.Cg-Rag1tm1Mom Prf1tm1Sdz/Sz)胫前肌制造圆形的缺损。未处理或RARγ处理的人脂肪衍生的间充质干细胞被移植到缺损部位(5,000细胞每部位)。术后两周收集组织，并通过Masson三色染色切片对RARγ预处理的MSC移植的肌肉和对照MSC移植的肌肉进行组织学分析，还通过对RARγ预处理的MSC移植的肌肉和对照MSC移植的肌肉的核(DAPI)以及肌球蛋白重链(MHC，抗人衍生的细胞抗原)进行免疫荧光检测来进行组织学分析。
RARγ预处理的人MSC明显促进受损肌肉组织的修复。虽然RARγ预处理的人MSC促进肌肉组织再生，但未经预处理的MSC几乎被排除在肌肉组织之外。
为了测试RARγ激动剂预处理是否对不同类型的间充质干细胞都有效，在体外分别用1μM CD1530或介质对人脂肪组织衍生的间充质干细胞(Zenbio，Cat#ASC-F)处理3天，然后移植至肌肉损伤模型系统中。用上文所述的方法在6周龄的NSG小鼠(NOD scidγ小鼠，Jax小鼠#005557)的胫骨前肌制造圆形缺损(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)。未处理的或RARγ处理的人脂肪衍生的间充质干细胞被移植至缺损部位(10000细胞每部位)。术后2周收集组织并进行组织学分析(RARγ引发的MSC移植的肌肉和对照MSC移植的肌肉的Masson三色染色切片；以及通过免疫荧光检测RARγ激动剂预处理的MSC移植的肌肉和对照MSC移植的肌肉的核(DAPI)、层粘连蛋白以及人衍生细胞抗原来进行)。
RARγ预处理的人MSC明显促进损伤肌肉组织修复。虽然观察到RARγ预处理的人MSC主要分布于肌纤维周围，但是未处理细胞大多排除在肌肉组织之外。这些结果表明，使用RARγ激动剂预处理的干细胞(例如MSC)对肌肉修复是有效的治疗，并且各种来源的干细胞(例如，MSC)都可用于这种疗法。
用引发的(RARγ激动剂处理的)或未引发的MSC修复复合组织(肌+骨)损伤
切断(Sever)肌肉损伤往往伴随着其它组织如骨、肌腱和神经的损伤。通过使用简化的复合损伤模型，对RARγ激动剂处理的MSC在优先靶向受损的肌肉组织这一方面进行了检查。
通过切割2月龄的小鼠腓骨(fibula)和周围的肌肉组织制造复合(骨和肌肉)组织损伤。在此之后，将RARγ激动剂预处理的MSC和对照未处理的MSC的比例为1:1的混合物移植至损伤部位附近。由表达GFP(预处理的)或表达DsRED(未处理)的小鼠骨髓制备MSC。术后1周收集损伤的组织、切片并使用抗-GFP和抗-DsRed抗体分别检测预处理和未预处理的MSC的分布。HE染色的组织学分析显示损伤的骨和肌肉组织仍处在修复过程中。引人注目的是，当大部分引发的MSC在肌肉组织中检测到时，大多数引发的细胞总是与骨组织相关。观察到一些表达DsRed的RARγ激动剂预处理的MSC形成典型的多核骨骼肌细胞。
观察到RARγ激动剂预处理的和未处理的MSC靶向不同的组织损伤部位。这些结果表明，RARγ激动剂预处理的MSC选择性地靶向损伤肌肉组织。当其它组织也受损时，RARγ激动剂预处理的MSC对于修复损伤肌肉组织将是有效的。在先已报道RARγ激动剂全身给药不仅能抑制异位骨化(heterotopic ossification)，还延迟骨折愈合(Shimono等，NatureMedicine 17，454-460(2011))。此外，这些结果有力地表明，以适当的比例联合移植预处理的和未处理的MSC对复合组织损伤是有效的治疗。
肌肉修复中需要RARγ信号
上述结果表明，在无RARγ小鼠中肌肉组织缺损几乎不被修复。为了进一步证实这一发现，使用另一种广泛使用的肌肉退化模型。在野生型和无RARγ小鼠的前胫骨的肌肉组织中注射1μg心脏-毒素。在心脏-毒素注射两周后收集肌肉组织、切片并通过Masson三色染色检查。观察到2周后在对照野生型小鼠中心脏-毒素注射的肌肉组织大部分被不成熟的肌纤维修复。与之不同，观察到无RARγ肌肉组织几乎不被修复。
肌肉损伤后局部类视黄醇的信号上调
视黄酸信号报告小鼠(RARE-LacZ小鼠)的胫前肌被切断或经历假手术。在第1天、第4天或第7天收集肌肉组织并用X-gal染色。观察到损伤后第4天报告子活性增加，表明其参与肌肉组织修复的这一信号通路中。
在第8小时、第2天、第4天收集总肌肉组织RNA，并进行RT-PCR以分析RAR信号相关基因的表达。ALDH2基因(由其前体产生RA的限速酶)的表达在损伤后第4天上调，在第11天返回到正常的表达水平。与之不同，Cyp26b1(Cyp26B)(降解RA的酶)在损伤后第2天瞬时上调。结果如图4和图5所示，表明局部RA浓度首先降低，然后在肌肉损伤后瞬时增加。
肌肉组织修复中治疗时间点的作用
如上文所述方法制造肌肉缺损。在1-3天或5-7天对小鼠进行RARγ激动剂(CD1530)治疗。图片显示损伤后4周的HE染色的肌肉组织。未经治疗的对照中肌肉缺损在很大程度上被脂肪和纤维组织取代。在1-3天进行的RARγ激动剂治疗减少了脂肪和纤维瘢痕组织的形成，但留下了部分缺损。与之不同，在5-7天治疗组中，肌肉缺损完全被新生成的肌纤维填充。因此，治疗时机对更快速和更好地进行肌肉组织修复是非常重要的。当内源性类视黄醇信号增加时，RARγ信号应增强。所建议的治疗方案是在肌肉损伤后第5天和第7天进行RARγ激动剂局部或全身给药。可以通过LS/MS/MS测量局部视黄酸浓度来进一步提高治疗时机的精确性。
如上述方法制造肌肉缺损。在治疗期的1-5天、5-9天和1-9天隔天给予小鼠100ngRARγ激动剂(CD1530)。1-5天组小鼠在第1天、第3天和第5天接受CD1530。5-9天组在第5天、第7天和第9天接受CD1530。1-9天组在第1天、第3天、第5天、第7天和第9天接受CD1530。随后将肌肉与介质处理的损伤肌肉以及完整肌肉(未损伤肌肉组织)进行比较。检查了受损后第4周肌肉组织的HE染色。在未经处理的对照中观察到肌肉缺损在很大程度上被脂肪和纤维组织取代(介质)。1-5天或1-9天接受RARγ激动剂治疗组则都减少了脂肪和纤维瘢痕组织的形成，但留下了大量凹痕(indentation)。5-9天治疗组的新形成的肌肉组织的质量和数量是最好的，其凹痕大大减少。
损伤肌肉组织的组织-形态计量学分析
如上文所述，使用Masson三色对修复部位处的连续组织切片进行染色，并使用ImagePro软件在限定区域内对肌肉、脂肪和纤维组织的相对量进行分析以定量。结果如图6所示。图像分析证实，5-9天治疗组的肌肉组织在所有损伤组中包含最少量的脂肪和纤维组织。这表明，治疗时机对更快速和更好地进行肌肉组织修复是非常重要的；这还表明，在内源性类视黄醇信号增加时(而不是之前)，RARγ信号被治疗性增强(例如，通过给予RARγ激动剂)，此时可获得更多的有益效果。
