展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备及应用。
背景技术
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)是小RNA病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的一员，可引起牛、羊及其他偶蹄类动物自然疫源性疾病。 FMDV核酸为单股正链RNA，总长为8300个核苷酸，编码一条多肽，在酶的作用下产 生不同的结构蛋白(VP4、VP3、VP2和VP1)和一些非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、 3B、3C、3D)。FMD可以造成巨大的社会影响和经济损失，是OIE法定向其报告的动 物传染病之一。目前，我国在FMD研究方面主要是：O、A型，SAT2FMD的各项研究 处于空白状态。
猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)能导致初产母猪及血清学阴性的经产母猪发生流产、不孕、产死胎、木乃伊胎及弱仔等，一旦正常猪群中一只染上PPV，三个月内能使所有猪都感上。有该病的猪场，生殖失败能连续几十年。PPV有很强的抵抗力，尤其是pH和温度不敏感，对我国养猪业造成很大的损失。PPV是无囊膜的二十面体对称病毒粒子，大小介于20～25nm。5000bp的单股负链DNA不编码蛋白，正链的5’编码蛋白NS1、NS2、NS3，其中NS1与基因复制有关，其他两个蛋白功能尚不清楚。3’编码蛋白VP1、VP2、VP3，VP3由VP2水解产生VP2蛋白能自组装成VLPs，能诱导体液免疫和细胞免疫。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供重组杆状病毒rBacNT1L2B的制备方法，本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因 GS1923OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒 rBacmidNT1L2B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B。
优选地，包括以下步骤:
(1)NT1L2B基因的扩增及重组供体质粒的构建
根据优化合成含有嵌合序列的质粒GS1923OP，运用生物信息学软件Primer 5.0设计引物P1/P2，扩增得到嵌合基因NT1L2B；回收纯化目的条带NT1L2B，将目的片段和pFastBacTMDual载体分别进行BamH I、Pst I双酶切，回收清洁后连接，化学法转DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFastNT1L2B，并进行酶切、测序鉴定；
表1 引物序列及酶切位点
Table 1 Primer sequence and enzyme cutting site
注：下划线处为保护碱基和酶切位点
(2)NT1L2B重组穿梭质粒的构建与鉴定
将pFastNT1L2B供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞，在含有庆大霉素(7μg/m)，卡那霉素(50μg/mL)，四环素(10μg/mL)，IPTG(40μg/mL)和X-gal(100μg/mL) 的固体LB平板上37℃倒置培养48h进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，置于含三种抗生素的液体培养基中摇菌。抽提DNA，以M13F/R(表1)载体通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmidNT1L2B，并提取rBacmidNT1L2B重组杆粒，用于细胞转染。
(3)NT1L2B重组杆状病毒的获得与鉴定
参照脂质体转染试剂盒Cellfectin@II Reagent的说明书，将rBacmidNT1L2B杆粒转染生长状态良好的sf9细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清，即获得阳性重组杆状病毒，命名为rBacNT1L2B。
(4)展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备方法
使用毒株rBacNT1L2B感染HF细胞进行重组蛋白NT1L2B表达，27℃无CO2细胞摇床125r/min震荡培养72h；离心收集细胞，超声破碎得到重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取样品。
展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒在制备SAT2FMDV疫苗的应用。
嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位猪细小病毒样颗粒在制备PPV的新型疫苗的应用。
本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区嵌入SAT2FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)， N端嵌入T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1923OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B,用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光(indirectimmunofluorescence assay，IFA)针对嵌合表位和VP2 蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在67KDa出现一条特异性条带。透射电镜(Transmission Electron Micrograph，TEM) 观察，重组蛋白NT1L2B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到一针两防的目的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的描述。
图1是PPV结构蛋白VP2 Loop位置示意图；
图2是VP2 Loop结构的空间结构图。
图3是NT1L2B嵌合基因插入位置示意图。
图4是NT1L2B序列扩增结果图。
图5是重组供体质粒pFastNT1L2B的双酶切鉴定结果图。
图6是重组穿梭质粒的PCR鉴定结果图。
图7是rBacNT1L2B感染HF细胞产生的CPE情况图(400×)。
图8是VP2蛋白表达的Western-bolt检测结果图。
图9是SAT2 FMDV B细胞表位表达的Western-bolt检测结果图。
图10是SAT2 FMDV T细胞表位表达的Western-bolt检测结果图。
图11是IFA检测NT1L2B蛋白在感染细胞中的表达图(400×)。
图12是PPV病毒粒子(25.0k×)、VP2-VLPs(40.0k×)、NT1L2B-VLPs(25.0k×)透射电镜观察结果图。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1 嵌合基因NT1L2B设计如图1-3所示：
1.2 材料
PPV毒株、pFastBacTMDual载体、猪细小阳性血清和sf9、HF细胞由本实验室保存。感受态细胞DH5a、DH10Bac、限制性内切酶BamH I、Pst I均购自TaKaRa公司(大连)。 Sf-900TMIII SFM(1×)、EXPRESS
1.3 NT1L2B基因的扩增及重组供体质粒的构建
根据优化合成含有嵌合序列的质粒GS1923OP，运用生物信息学软件Primer 5.0设计引物P1/P2，扩增得到嵌合基因NT1L2B。回收纯化目的条带NT1L2B，将目的片段和pFastBacTMDual载体分别进行BamH I、Pst I双酶切，回收清洁后连接，化学法转DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFastNT1L2B，并进行酶切、测序鉴定。
表1 引物序列及酶切位点
Table 1 Primer sequence and enzyme cutting site
注：下划线处为保护碱基和酶切位点，其中前面CG和AA是保护碱基。
1.4 NT1L2B重组穿梭质粒的构建与鉴定
将pFastNT1L2B供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞，在含有庆大霉素(7μg/m)，卡那霉素(50μg/mL)，四环素(10μg/mL)，IPTG(40μg/mL)和X-gal(100μg/mL) 的固体LB平板上37℃倒置培养48h进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，置于含三种抗生素的液体培养基中摇菌。抽提DNA，以M13F/R(表1)载体通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmidNT1L2B，并提取rBacmidNT1L2B重组杆粒，用于细胞转染。
1.5 NT1L2B重组杆状病毒的获得与鉴定
参照脂质体转染试剂盒Cellfectin@II Reagent的说明书，将rBacmidNT1L2B杆粒转染生长状态良好的sf9细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清，即获得阳性重组杆状病毒，命名为rBacNT1L2B。
1.6 Western-blot鉴定NT1L2B蛋白的表达
将重组杆状病毒rBacL2B接种HF细胞，感染72h后，离心收集细胞沉淀。加入PMSF并做超声处理，10,000r/min离心10min收集上清，用于Western-blot分析。用5％脱脂奶粉按1:100稀释PPV阳性血清(1:100稀释VYT兔多抗、1:100稀释NVQ兔多抗)为一抗，以5％脱脂奶粉按1:2000稀释HRP标记的抗猪IgG(1:300稀释HRP标记山羊抗兔)作为二抗，同样的方法处理正常HF细胞蛋白样品作为阴性对照。
1.7 IFA鉴定NT1L2B蛋白的表达
将重组杆状病毒rBacL2B接种于生长状况良好的HF细胞，感染12h后，用PBS洗 3次。4℃预冷的4％多聚甲醛室温固定15min后PBS洗3次，0.1％Triton-100X通透细胞膜10min后PBS洗3次。使用5％NBS 37℃封闭1h。5％NBS 1:200稀释PPV阳性血清(1:100稀释VYT、NVQ兔多抗)为一抗，37℃孵育1h，用PBST洗涤5次。5％NBS 1:500稀释Anti-Swine IgG(H+L)(1:300稀释FITC标记山羊抗兔)为二抗，37℃孵育1h，用PBST洗涤5次，置于荧光倒置显微镜下观察结果，以同样方法处理HF细胞为阴性对照。
1.8 TEM观察NT1L2B-VLPs的组装
使用毒株rBacNT1L2B感染HF细胞进行重组蛋白NT1L2B表达，27℃无CO2细胞摇床125r/min震荡培养72h。离心收集细胞，超声破碎得到重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取样品，经磷钨酸负染色处理，TEM观察病毒样颗粒的组装情况。
2 结果
2.1 NT1L2B基因的扩增及重组供体质粒pFastNT1L2B的鉴定
以质粒GS1923OP为模板，P1/P2为引物扩增NT1L2B基因，获得约为1830bp的目的条带(见图4)，与预计大小相符。筛选获得重组供体质粒pFastNT1L2B，进行BamH I 和Pst I双酶切验证，结果(见图5)显示，双酶切后有2条特异条带，其中一条为NT1L2B 基因约为1830bp，另一条为载体片段约为6000bp，均与预计大小相符。进一步对 pFastNT1L2B重组质粒进行测序验证，结果表明插入序列没有碱基突变，完全正确。
2.2 NT1L2B重组穿梭质粒及杆状病毒的获得
将pFastNT1L2B重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞，筛选白色菌落纯化后摇菌。提取重组杆粒，经M13F/R(表1)引物PCR检测可以扩增到一约4390bp的目的条带，结果见图6。将重组杆粒rBacmidNT1L2B脂质体法转染sf9细胞，28℃培养，主要表现为细胞胀大变圆，细胞核不明显，结果见图7。
2.3 Western-blot鉴定重组蛋白的表达
湿转法对重组蛋白NT1L2B进行Western-blot鉴定(见图8、9、10)。检测结果显示，重组病毒感染的HF细胞样品中，有一约67KDa左右的特异条带，而正常细胞未出现该条带。表明嵌合蛋白NT1L2B在HF细胞中成功表达，且表达产物具有一定的反应原性。
2.4 IFA鉴定重组蛋白的表达
rBacNT1L2B杆状病毒感染HF细胞，针对VP2蛋白进行免疫荧光检测后，rBacL2B 感染的HF细胞出现红色荧光(见图11B)，针对SAT2 FMDV B细胞表位检测后， rBacNT1L2B感染的HF细胞出现绿色荧光(见图11C)，针对SAT2 FMDV T细胞表位检测后，rBacNT1L2B感染的HF细胞出现绿色荧光(见图11D)，而正常的HF细胞未出现荧光(见图11A)，表明嵌合的SAT2FMDV B、T细胞表位基因在VP2表面获得展示，并且没有影响VLPs的组装。
2.5 TEM观察NT1L2B-VLPs
用TEM观察纯化的蛋白，结果显示直径为27nm左右，重组蛋白形态大小均与本实验室之前纯化的PPV病毒粒子(图12A)及组装的VP2-VLPs相似(图12B)，表明嵌合了 SAT2FMDV B、T细胞表位的VP2蛋白在HF细胞中成功组装成VLPs，并且把B细胞表位和T细胞表位呈现在VLPs表面。
实施例1
重组杆状病毒rBacNT1L2B的制备方法，包括以下步骤:
(1)NT1L2B基因的扩增及重组供体质粒的构建
根据优化合成含有嵌合序列的质粒GS1923OP，运用生物信息学软件Primer 5.0设计引物P1/P2，扩增得到嵌合基因NT1L2B；回收纯化目的条带NT1L2B，将目的片段和pFastBacTMDual载体分别进行BamH I、Pst I双酶切，回收清洁后连接，化学法转DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取重组供体质粒pFastNT1L2B，并进行酶切、测序鉴定；
表1 引物序列及酶切位点
Table 1 Primer sequence and enzyme cutting site
注：下划线处为保护碱基和酶切位点，其中前面CG和AA为保护碱基。
(2)NT1L2B重组穿梭质粒的构建与鉴定
将pFastNT1L2B供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞，在含有庆大霉素(7μg/m)，卡那霉素(50μg/mL)，四环素(10μg/mL)，IPTG(40μg/mL)和X-gal(100μg/mL) 的固体LB平板上37℃倒置培养48h进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，置于含三种抗生素的液体培养基中摇菌。抽提DNA，以M13F/R(表1)载体通用引物进行PCR检测，筛选阳性克隆杆粒，命名为rBacmidNT1L2B，并提取rBacmidNT1L2B重组杆粒，用于细胞转染。
(3)NT1L2B重组杆状病毒的获得与鉴定
参照脂质体转染试剂盒Cellfectin@II Reagent的说明书，将rBacmidNT1L2B杆粒转染生长状态良好的sf9细胞，28℃恒温培养箱培养36～72h，待出现细胞病变后，收集上清，即获得阳性重组杆状病毒，命名为rBacNT1L2B。
(4)展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备方法
使用毒株rBacNT1L2B感染HF细胞进行重组蛋白NT1L2B表达，27℃无CO2细胞摇床125r/min震荡培养72h；离心收集细胞，超声破碎得到重组蛋白后，使用蔗糖密度梯度离心纯化后收取样品。
展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒在制备SAT2FMDV疫苗的应用。
嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位猪细小病毒样颗粒在制备PPV的新型疫苗的应用。
本发明采用Bac-to-Bac表达系统，构建并表达根据昆虫细胞嗜性优化的嵌合蛋白，命名为NT1L2B。Western-blot和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay，IFA) 分析其反应原性，说明嵌合的B、T细胞表位在VP2蛋白中表达。透射电镜(Transmission Electron Micrograph，TEM)观察，其形成了与病毒粒子相似的颗粒，表明嵌合B细胞表位和T细胞表位没有影响VLPs的形成，并且成功展示在VLPs的表面。此NT1L2B-VLPs 的成功组装，为SAT2 FMDV制备储备疫苗奠定了基础，并且为PPV的新型疫苗研制提供了理论基础。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备及应用
<130> 2020.7.6
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 病毒(Virus)
<400> 1
Val Tyr Thr Lys Ala Ala Ala Ala Ile Arg Gly Asp Arg Ala Ala Leu
1 5 1015
Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Thr Asn His Thr Leu Pro Pro Thr Phe Asn
202530
Phe Gly Tyr Val Thr Val Asp Lys
3540
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 病毒(Virus)
<400> 2
Asn Val Gln Glu Gly Arg Arg Lys His Thr Asp Val Ala Phe Leu Leu
1 5 1015
Asp Arg Ser Thr
20
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgggatccat gaacgtgcaa gagggccgcc g 31
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aactgcagtt agtacagctt tctagggatc agctgg 36
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtttttccca gtcacgac 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggaaacag ctatgac 17
