炎症性肠病专利 1篇：
炎症性肠病治疗药
第一、技术领域
本发明涉及炎症性肠病治疗药。
第二、背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease：IBD)是在结肠和小肠的粘膜引起慢性炎症或溃疡，长期腹泻、接着便血、反复再发的原因不明的疑难病。在我国被指定为特种疾病，作为该疾病对策研究事业的一环，给各患者发放该疾病治疗医疗接受者证。在IBD中有2类主要的疾病：克罗恩病(Crohn disease，CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)。
克罗恩病也被称为局限性肠炎、肉芽肿性回肠炎或回结肠炎，是在肠壁上引起的慢性炎症，在消化道的任何部位都会引起。所谓溃疡性结肠炎，是在结肠引起炎症、形成溃疡的慢性疾病，引起出血性腹泻和腹部剧烈疼痛，引起伴随发热的发作。两种疾病的患者人数虽然达不到欧美、但在本国也一味地增加，患者人数，溃疡性结肠炎约是73000人(2001年)、克罗恩病约是21000人(2001年)。另外，在46种特定疾病中，上述接受者证的发放数，溃疡性结肠炎是第1位、克罗恩病是第8位。
如上所述，炎症性肠病原因不明，所以，通常的腹泻治疗药等无效。在炎症性肠病的治疗中，以往，氨基水杨酸制剂(柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸)和皮质类固醇制剂作为第一和第二选择药被广泛使用。在重症例中还使用免疫抑制剂(硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等)、抗细胞因子制剂。氨基水杨酸制剂广泛使用柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸，但50%左右的给药患者发现呕吐、食欲不振和肝功能障碍等消化器官障碍，颗粒球减少和溶血性贫血、叶酸缺乏性贫血等血液系统障碍。另外，因为具有水杨酸骨架，所以，在对水杨酸类药剂显示过敏症状的病例中有出现副作用的可能性，有时确认腹泻、腹痛、淀粉酶上升和肾功能障碍等。另外，因为发现柳氮磺吡啶有男性不育和尿带色的副作用，所以，对患者也造成精神上大的压力。皮质类固醇制剂有骨质疏松症、成长障碍、继发性肾上腺不足、耐糖功能异常、高血压等各种副作用。另外，没有CD和UC的缓解维持效果也是问题。另一方面，抗细胞因子疗法是和这些以往完全不同的新治疗法，最初亮相的药剂是嵌合型抗人TNF-α单克隆抗体的英夫利西。报告了在从类固醇抵抗性的中度到重度的克罗恩病患者中是有效的(非特许文献1)，在缓解维持中也是有效的(非特许文献2)。作为副作用，已知高血压、畏寒、发疹、发热、头痛、湿疹等。还因为英夫利西是嵌合型抗体，所以，有显示抗原性的可能性，有时引起急性超过敏反应。另外，最近，重视抗生物质成为必要的感染症和致癌性问题。
非特许文献1：N.Engl.J.Med.，第337卷，第1029页，1997年
非特许文献2：Gastroenterology，第117卷，第761页，1999年
第三、发明内容
本发明的目的在于提供新的炎症性肠病治疗药。
本发明人使用作为炎症性肠病模型已知的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱发和葡聚糖硫酸钠(DDS)诱发IBD模型，以各种化合物为对象、研究炎症性肠病治疗作用，完全意外地发现已知具有抗肿瘤效果增强作用、癌转移抑制作用和抗癌剂副作用减轻作用的5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮盐酸盐[化合物(1)]具有优异的炎症性肠病治疗效果，完成了本发明。
即，本发明提供一种炎症性肠病治疗药，将5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮[化合物(I)]或其药学上可接受的盐作为有效成分。
另外，本发明提供5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮或其药学上可接受的盐在制造炎症性肠病治疗药中的使用。
本发明还提供一种炎症性肠病的治疗方法，其特征在于，将有效量的5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮或其药学上可接受盐进行给药。
发明效果
根据本发明，可以提供有效而安全的包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎症性肠病治疗药。该化合物(1)对炎症性肠病这样的慢性炎症的治疗效果与副作用的平衡，比氨基水杨酸制剂和皮质类固醇制剂更优异，仅仅在腹泻抑制作用方面就完全不能预想到。
第四、附图说明
图1是表示在TNBS肠炎小鼠中、由给药化合物(1)产生的炎症抑制作用的图(HE染色图)。
图2是表示在TNBS肠炎小鼠中的炎症指标的图。
图3是表示在TNBS肠炎小鼠中、由给药化合物(1)产生的肠上皮细胞的凋亡的抑制作用的图。
图4是表示TNBS肠炎小鼠的凋亡诱发率的图。
第五、具体实施方式
在本发明的医药中作为有效成分使用的5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮是下式(I)：
表示的化合物。该化合物(I)是公知化合物，关于其药理作用，已知抗肿瘤效果的增强作用(国际专利公开WO/9630346号公报)、癌转移抑制作用(国际专利公开WO/9813045号公报)和抗癌剂的副作用减轻作用(特开2000—273044号公报)，但关于对炎症性肠病的作用完全未知。
化合物(I)的药学上可接受的盐没有特别限定，但优选使药学上可接受的酸作用的酸加成盐。作为该酸加成盐，例如可以例示与盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸的盐;草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、醋酸、对甲苯磺酸、甲磺酸等有机酸的盐。作为化合物(I)或其盐的特别优选的具体例子，可以列举5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮盐酸盐、5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基)甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮对甲苯磺酸盐。
如后述实施例中所表，化合物(I)或其盐对作为炎症性肠病模型已知的TNBS诱发或DDS诱发IBD模型，具有极其优异的抗炎症作用和肠上皮细胞的凋亡抑制作用。而且，其治疗效果比对以往IBD使用的皮质类固醇剂更优异。另外，化合物(I)或其盐的安全性高，如果考虑以往的炎症性肠病治疗药大多有副作用的问题，作为以往没有的全新的炎症性肠病治疗药是有用的。
另外，已知化合物(I)或其盐是胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶阻碍剂，但在实施例中使用的小鼠、大鼠等啮齿类的消化道中，几乎没有发现胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶，难以认为化合物(I)只由胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶阻碍作用发挥炎症性肠病治疗效果。另外，也已知起因于抗癌剂的腹泻的抑制效果，但公开的是由抗癌剂引起的细胞伤害的抑制效果，从该见解出发，完全不能预想到本发明这样的对慢性炎症疾病的治疗效果。此外，因为已知胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶通过作为PD-ECGF的活性诱导血管新生，所以有胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶阻碍剂作为由血管新生阻碍作用引起的癌转移抑制剂利用的报告，但作为炎症性肠病治疗剂的有用性是未知的。
本发明的对象疾病是炎症性肠病，例如，可以列举克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴球性结肠炎、经路变更后的结肠炎等，特别是克罗恩病、溃疡性结肠炎。
化合物(I)或其盐可以分别单独地制剂成各种的给药单位形态进行给药。
在将本发明的医药作为包括人的哺乳动物的IBD的治疗剂使用时，可以根据治疗目的制成各种药学上给药形态，具体地可以制成片剂、包覆片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浊剂、乳剂等口服剂;注射剂、栓剂等非口服剂。这些给药剂可以使用药学上可接受的载体等，由在该领域通常已知的惯用的制剂方法进行制剂化。在成形为片剂形态时，例如，可以使用乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂;水、乙醇、丙醇、玉米淀粉、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂;干淀粉、藻酸钠、琼脂粉末、海带多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钾、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、乳糖等崩解剂;白糖、硬脂酸、可可脂、氢化油等崩解抑制剂;季铵盐、十二烷基硫酸钠等吸收促进剂;甘油、淀粉等保湿剂;淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶状硅酸等吸附剂;精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等润滑剂等。片剂可以根据需要制成施加了通常包衣的片剂，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、涂膜片、双重片、多层片等。在成形为丸剂形态时，作为载体，例如，可以使用葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高岭土、滑石等赋形剂;阿拉伯胶粉末、黄蓍胶粉末、明胶、乙醇等粘合剂;海带多糖粉末、琼脂粉末等崩解剂等。胶囊剂按照通常方法，与上述例示的各种载体混合，在硬质明胶胶囊、软质胶囊等中填充而配制。制造口服用液体制剂时，可以使用矫味剂、缓冲剂、稳定剂、矫臭剂等，由通常方法制造内服液剂、糖浆剂、酏剂等。此时，矫味剂可以列举白糖、橙皮、柠檬酸、酒石酸等，作为缓冲剂可以列举柠檬酸钠等，作为稳定剂可以列举黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶等。在成形为栓剂形态时，作为载体例如可以使用聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇的酯类、明胶、半合成甘油酯等。制造注射剂时，液剂、乳剂和悬浊剂被灭菌，而且优选与血液是等渗的，在成形为这些形态时，作为稀释剂例如可以使用水、乳酸水溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类等。另外，此时在配制等渗性溶液时，即使医药制剂中含有足够量的食盐、葡萄糖或甘油，另外也可以添加通常的溶解助剂、缓冲剂、无痛剂等。根据需要，上述各制剂中还可以配合着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等以及其它医药品。在本发明的制剂中所含的化合物(1)或其药学上可接受的盐的量没有特别限定，可以适当选择，通常都优选制成制剂中0.01～70重量%左右。
本发明的医药的给药方法没有特别限定，根据各种制剂形态、患者年龄、性别及其它条件、患者的症状程度等适当决定。例如，以片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浊剂和乳剂进行口服给药。注射剂单独或者与葡萄糖、氨基酸等通常的补充液混合进行静脉内给药，还可以根据需要，单独在动脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内进行给药。栓剂进行直肠内给药。
本发明的医药的有效成分的给药量可以根据用法、患者年龄、性别及其它条件、疾病程度等适当选择。通常，化合物(I)或其药学上可接受的盐的给药量，优选标准是0.01～1000mg/kg/日左右、优选是0.1～100mg/kg/日左右。另外，这些本发明的制剂可以分为1日1次或2～4次左右进行给药。
实施例
以下，列举实施例更详细地说明本发明，但本发明不被这些实施例限定。
配方例1
化合物(1) 25.0mg
乳糖 8.0mg
结晶纤维 4.0mg
硬脂酸镁 1.0mg
滑石 1.0mg
玉米淀粉 3.5mg
羟丙基甲基纤维素 2.5mg
每片 45.0mg
由通常方法，以上述配合比例配制片剂。
配方例2
化合物(1) 50.0mg
乳糖 85.0mg
玉米淀粉 100.0mg
羟丙基甲基纤维素 3.0mg
每包 238.0mg
由通常方法，以上述配合比例配制颗粒剂。
配方例3
化合物(1) 50.0mg
乳糖 24.0mg
结晶纤维素 13.0mg
硬脂酸镁 1.0mg
每个胶囊 45.0mg
由通常方法，以上述配合比例配制胶囊剂。
配方例4 注射剂
化合物(1) 50.0mg
注射用蒸馏水 适量
每个安瓿 5mL
由通常方法，每个安瓿以上述配合比例配制注射剂。
配方例5 栓剂
化合物(1) 100.0mg
Witepsol W—35 1400.0mg
(注册商标、Dynamit Nobel AG生产)
每个 1500.0mg
由通常方法，每个以上述配合比例配制栓剂。
实施例1(在TNBS诱发IBD模型中的作用)
本试验按照Biochemical and Biophysical Research Communications329(2005)1217—1224中记载的方法，对作为克罗恩病模型的TNBS肠炎小鼠，连日口服给药化合物(1)(50mg/kg)，评价抗炎症作用。
将1组10只8周龄雌BALB/c小鼠(日本SLC(株))绝食24小时后，用二乙醚麻醉后，将用50%乙醇1mL稀释的TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸(东京化成工业(株))2.0g用乙烯树脂制造的导管从肛门插入2.5cm进行灌肠。灌肠后30秒钟反吊，立刻使由肛门灌肠的TNBS溶液不泄漏。在对照组中，取代TNBS，灌肠1mL生理食盐水。在灌肠TNBS或生理食盐水7日后，在二氧化碳中使全部小鼠安乐死，进行解剖。在化合物(1)给药组中，在TNBS灌肠前一日起、连日口服给药50mg/kg化合物(1)，在对照组、化合物(1)非给药组中，在灌肠前一日起、连日口服饮料水。在横轴方向每1cm切开在给药期结束后摘出的小鼠结肠，在10%福尔马林中固定后、包埋在石蜡中，进行HE染色，以组织学评分(表1)为基础、将所见炎症数值化。
与灌肠生理食盐水的对照(图1)相比，灌肠TNBS，由此可见炎症细胞浸润和粘膜脱落。在TNBS 2.0mg给药组中，确认全层性的炎症细胞浸润和广泛范围的粘膜脱落、高度浮肿、隐窝消失，但在化合物(1)给药组中，虽然有炎症细胞浸润、粘膜脱落，但炎症范围、程度是轻度(图1)。使用组织学评分(表1)，将炎症程度数值化，在化合物(1)给药组和化合物(1)非给药组之间比较研究(图2)。与化合物(1)非给药组相比，化合物(1)给药组有意使评分减少(TNBS 2.0mg：15.0±1.2分、TNBS+化合物(1)：9.8±2.1分)。
表1
评分范围为0至最大约22分
实施例2(在TNBS肠炎结肠中的肠上皮细胞的凋亡的抑制)
将TNBS肠炎结肠进行吉姆萨染色、将核染色，研究肠上皮细胞的凋亡(图3)。以细胞缩小或可以确认核的断片化的细胞为凋亡细胞。在显微镜下分别数出1000个切片细胞数，将凋亡细胞的比例(凋亡诱导率)数值化(图4)。可知关于TNBS的各种浓度，通过给药化合物(1)，有意抑制肠上皮细胞的凋亡(TNBS：40.0±3.0%、TNBS+化合物(1)：26.0±5.0%)。
实施例3(在DSS诱发IBD模型中的病态改善作用)
本试验按照在PEDIATRIC RESEARCH，Vol.53，No.1，143-147，2003中记载的方法进行。即，将在第0日，以各组的平均体重均等的方式，将小鼠(6周龄，C57BL/6N Jcl，日本CLEA)每8只进行分配。用精制水将葡聚糖硫酸钠(以下为DSS，和光纯药)溶解成为3%w/v后，由给水瓶使小鼠自由饮水5日(0～第4日)，制成溃疡性结肠炎模型。实验组设定为药剂非给药组(对照)、化合物(1)的100mg/kg/日给药组、作为比较对照药的5-氨基水杨酸(以下为5—ASA)100mg/kg/日给药组、氢化泼尼松(prednisolone)5mg/kg/日给药组(另外，该对照药的给药量是药效用量)。再设定取代3%DSS水溶液、饮用精制水的未处理组。药剂由开始饮用3%DSS水溶液后第4日投药7日(第4日～第10日)。在药剂给药结束日的第二日(第11日)实施判断、作为评价指标，测定结肠长度和从试验开始日(第0日)到试验结束日(第11日)的体重变化率。
与未处理组相比，判断日的对照组的结肠长度是73.4%，观察到显著萎缩。与未处理组相比，化合物(1)给药组和氢化泼尼松给药组的结肠长度分别是88.6%、93.2%，与对照组相比，各自的结肠长度有意增长，可见病态改善。5—ASA给药组是对照的80.3%，虽然可以确认改善结肠萎缩的倾向、但不能确认有意差。
另一方面，在试验开始日和判断日的体重变化率中，相对在对照组观察到1.7±1.8%的体重减少，化合物(1)只观察到仅仅0.4±1.2%，有体重增加倾向。但是，观察到在氢化泼尼松给药组中3.9±1.0%、在5—ASA给药组中5.0±0.3%的超过对照组的体重减少，推测由药剂的副作用引起。
由以上结果，相比于已有的炎症性肠病治疗剂，化合物(1)效果和副作用的平衡优异，暗示作为溃疡性结肠炎的治疗药是有用的。
[表2]
在DSS诱发IBD模型动物中的结肠长度和体重变化
结肠长度的变化(与未处理组的比，%)体重变化率(%，Mean±SE)未处理1003.7±1.5对照73.4-1.7±1.8100mg/kg/日化合物(1)88.6*0.4±1.25mg/kg/日氢化泼尼松93.2*-3.9±1.0100mg/kg/日5—ASA80.3-5.0±0.3
*在与对照组的结肠长度的比较中、显示了有意改善的组
(P<0.05，student-t test)
实施例4(单次口服给药毒性试验)
使用5只雄性、5只雌性的SD系大鼠(6周龄)，用0.5%HPMC溶液悬浊调整2000mg/kg化合物(1)，以10mL/kg的给药用量单次口服给药。结果，完全看不到死亡例、也不能确认体重变化。
炎症性肠病专利 2篇：
用于治疗炎症性肠病的药物
第一、技术领域
本发明具体涉及免疫治疗技术领域，更具体的，涉及用于治疗炎症性肠病的药物。
第二、背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)属于自身免疫性疾病，是一种发生在肠道的，要终生治疗并且不可治愈的慢性特发性疾病，具有频繁复发和缓解的临床特点。近十年来，IBD在我国就诊人数呈逐步增加趋势，将成为我国消化系统常见病。IBD的常规药物疗法，例如抗炎剂、糖皮质激素和免疫抑制剂由于其在长期治疗期间的全身不良反应和毒性而受到限制。
细胞治疗是通过体外激活、扩增自体或异体的免疫效应细胞，再回输给患者，起到杀伤目标细胞和提高患者免疫功能等作用。细胞免疫治疗是未来炎症性肠病综合治疗的重要组成部分。
现有技术还没有关于治疗炎症性肠病的细胞免疫治疗方法。
第三、发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷，本发明的主要目的是提供一种用于治疗炎症性肠病的药物。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于治疗炎症性肠病的药物，所述药物包括CD4-CD8-双阴性的T细胞。
优选的，所述CD4-CD8-双阴性的T细胞为CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞(简称为DN T细胞)。
本发明首先通过构建炎症性肠病的小鼠模型，然后抽取自体外周血，分离出DN T细胞，体外扩增培养后，再静脉注射回输给自体，能够达到缓解治疗肠道炎症的目的。
优选的，所述CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞来自外周血。
优选的，所述外周血为自体外周血。当然，与自体血型匹配的受试者的外周血也是可以的。
优选的，所述自体外周血的CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞通过流式分选方法获得，同时经过体外扩增培养。
更优选的，所述体外扩增培养过程中加入白介素-2，能够刺激体DN T细胞的扩增;所述白介素-2的浓度为20ng/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过构建炎症性肠病的小鼠模型，然后抽取自体外周血，分离出DN T细胞，体外扩增培养后，再静脉注射回输给自体，能够达到缓解治疗肠道炎症的目的。本发明首次利用DN T细胞及其免疫治疗方法可以实现对炎症性肠病的免疫治疗，其方法具有减轻肠道炎症等优点，适于炎症性肠病的综合治疗，适用于临床推广应用。
第四、附图说明
图1为输入DN T细胞受体肠道病理切片;
图2为输入DN T细胞受体小鼠体重下降情况，其中DN T组即为回输组;
图3为输入受体小鼠的供体DN T细胞分泌情况;其中，PMA+Ion+BFA组代表小鼠DN T细胞体外刺激组，PMA为佛波酯，PMA和Ionomycin的共同作用可以起到激活细胞的作用。
BFA为蛋白转运抑制剂，阻止高尔基体将新分泌蛋白运输到细胞外，从而达到通过流式来检测细胞因子的目的;unstimulated代表未加刺激组。
第五、具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 以小鼠为模型建立用于免疫治疗炎症性肠病的DN T细胞的方法
一、IBD小鼠模型的建立过程
使用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导小鼠结肠炎模型，给小鼠饮用含3%(w/v)DSS水持续7天，再改用正常水饮用1天，构建小鼠结肠炎模型。每日检测小鼠体重及疾病活动度指数(DAI)，用来评价小鼠结肠炎严重程度。DAI评分包括大便性状，直肠出血情况等。
二、向建立的小鼠模型中回输DN T细胞
用于免疫治疗炎症性肠病的DN T细胞的方法用到以下成分：(1)T细胞的特异性荧光抗体;(2)培养基(10%胎牛血清的1640培养基);(3)白介素-2(20ng/ml)。
具体包括如下步骤：
S1. 抽取供体小鼠的外周血20ml，采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞;
S2. 染色标记CD3+CD4-CD8-T细胞(简称为DN T细胞);
S3. 流式分选仪分选纯化DN T细胞;
S4. 加入培养基和白介素-2(20ng/ml)体外培养14天，每隔3天换一次培养基和白介素-2;
S5. 生理盐水洗涤细胞3次，静脉注射至受体(IBD小鼠模型)体内。
S6. 疗效判定：以不注射细胞、向受体内注射PBS为对照，检测受体肠道病理情况和体重下降情况。
小鼠肠道病理切片的结果如图1，从图1中可以看出，与输入PBS组相比，回输组的肠道病理情况得到了明显改善。
小鼠体重下降情况的结果如图2，图2的左图为小鼠肠道长度统计结果，图2的右图为小鼠的体重统计结果，从图2可以看出，与输入PBS组相比，DNT组(即回输组)小鼠的体重下降缓解，且肠道长度较长。
流式细胞分选结果如图3，从图3可以看出，小鼠肠道中来自供体小鼠的DN T细胞可分泌细胞因子IL-4保护肠道。
炎症性肠病专利 3篇：
炎症性肠病的预防或治疗剂
第一、技术领域
本发明涉及一种炎症性肠病的预防或治疗剂。更具体而言，本发明涉及一种利用miR-29a和/或miR-29b的炎症性肠病的预防或治疗剂。
第二、背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease;IBD)是胃肠道中的慢性炎症性疾病，主要大致分为溃疡性结肠炎和克罗恩病(非专利文献1～3)。特别是，在欧美国家，炎症性肠病的发病率很高(非专利文献2)，炎症性肠病的复发率高成为严峻的问题。目前，对于急性炎症性肠病，基本上进行使用抗炎药、免疫抑制药、糖皮质激素等的治疗(非专利文献4)。另外，作为炎症性肠病的新治疗法，提出了抑制以TNF-α等促炎细胞因子或其细胞表面受体为靶标的粘膜炎症通路的方式(非专利文献5及6)。
但是，目前，即使通过给药药剂来治疗炎症性肠病，仍有约30%的患者因为严重的炎症、肠管狭窄或中毒性巨结肠症而需要外科手术。
虽然炎症性肠病的病因及病理尚不明确，但可以认为其与氧化应激障碍、先天性及适应性免疫障碍、遗传因素、肠内细菌、饮食生活等多种因素复合相关。
另一方面，核酸药物作为多种疾病的新一代治疗法而备受关注。在核酸药物中，微小RNA(miRNA)为较小的非编码RNA，是主要通过与3'-UTR区的互补序列结合来调节多个靶基因的表达的RNA分子。最近的研究表明，存在参与上皮屏障功能(miRs-7,21,150)、自噬(miRs-13A，93,106,142-3p)、NF-kB信号传导通路(miRs-126,146a)、及IL23/Th17炎症轴(miRs-20,23a，29b，155)等的miRNA(非专利文献7)。因此，这些miRNA或抗miRNA有望用作炎症性肠病的治疗工具。但是，目前现状是，在使用miRNA的核酸药物中，确认有效治疗的疾病限于眼病、高脂血症及肌肉退行性疾病。
另外，在使用miRNA的核酸药物中，在体内将miRNA高效地送至靶细胞至关重要。目前，体外的miRNA向细胞内的输送中，广泛使用脂质体，但是在炎症性肠病的治疗中，尚未建立在体内高效地将miRNA输送至炎症患处的技术。
另一方面，有报告称，在敲除miR-29a及miR-29b的小鼠中，使由硫酸葡聚糖(DSS)引发的结肠炎恶化(非专利文献8)，miR-29a及miR-29b有望作为炎症性肠病的治疗药物。但是，如上所述，尚未开发在体内高效地将miRNA输送至炎症性肠疾的患处的技术，在将miR-29a及miR-29b作为症性肠病的治疗药物而实用化方面，确立在体内的输送技术必不可少(非专利文献9)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Nat Rev Immunol 3：521-33,2003
非专利文献2：J Clin Invest 117：514-21,2007
非专利文献3：Gastroenterology 115:182-205,1998
非专利文献4：Drugs 65:2253-86,2005
非专利文献5：Curr Opin Gastroenterol 23:395-9,2007
非专利文献6：Surgery today 45:933-8,2015
非专利文献7：Gut 64(6):1008,2015
非专利文献8：Immunity 39:521-36,2013.
非专利文献9：Int J Nanomedicine 11:5287-5310,2016.
第三、发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于，提供一种利用miR-29a和/或miR-29b并对炎症性肠病显示出优异的预防或治疗效果的炎症性肠病的预防或治疗剂。
用于解决问题的技术方案
已知碳酸磷灰石粒子具有将核酸输送至细胞内的作用(日本特开2007-63194号公报)。由于不知道碳酸磷灰石粒子具有向炎症组织聚集的作用，因此，现有技术中一般认为，即使全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，也不能有效果地向炎症性肠病的患处输送miR-29a和/或miR-29b。因此，本发明人等尝试了将使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子对炎症性肠病的患处进行局部给药，结果几乎未见炎症性肠病的改善(参见下述参考试验例5)。
在这样的状况下，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，如全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，不仅该miRNA的一部分被吸收至炎症性肠病的患处，该miRNA的一部分还会被吸收至定位于患处的粘膜上的树突状细胞，通过患处直接吸收的该miRNA的作用和吸收了该miRNA的树突状细胞的作用能够有效地改善炎症性肠病。即，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，该miRNA不仅作用于炎症性肠病的患处，还能够作用于参与炎症的初期免疫反应的树突状细胞，从而使炎症性肠病的治疗效果大幅提高。本发明是基于这样的知识进一步重复探讨而完成的。
即，本发明提供下述所公开的方式的发明。
项1.一种炎症性肠病的预防或治疗剂，其包含使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸磷灰石粒子而成的复合粒子，
所述预防或治疗剂被全身给药。
项2.根据项1所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，所述预防或治疗剂通过血管内给药或皮下给药而给药。
项3.根据项1或2所述的炎症性肠病的预防或治疗剂，其中，碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
项4.使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子在用于制造全身给药的炎症性肠病的预防或治疗剂中的用途。
项5.根据项4所述的用途，其中，所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
项6.根据项4或5所述的用途，其中，所述碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
项7.一种炎症性肠病的预防或治疗方法，其将使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子向需要预防或治疗炎症性肠病的患者全身给药。
项8.根据项7所述的方法，其中，所述全身给药为血管内给药或皮下给药。
项9.根据项7或8所述的方法，其中，所述碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径为400～3000nm。
发明效果
根据本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，该miRNA不仅吸收至炎症性肠病的患处，还吸收至树突状细胞，由此能够起到更优异的治疗效果。
直接吸收至炎症性肠病的患处的miR-29a和/或miR-29b有助于该患处的症状的缓和或治愈。另外，吸收了miR-29a和/或miR-29b的树突状细胞降低参与幼稚T细胞向Th-17细胞分化的细胞因子(IL-6及TGF-β)和激活Th-17细胞从而导向病原性Th-17细胞(pathogenic Th17 cells)的细胞因子(IL12 p40及IL23 p19)的表达量，从而有助于炎症性肠病的治疗效果。即，在本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂中，通过全身给药使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，不仅能够直接作用于患处，还能够作用于树突状细胞，由此能够起到更加优异的治疗效果。树突状细胞为与炎症性肠炎的初期免疫反应相关的重要的因子，在本发明的炎症性肠病的预防或治疗剂中，能够通过抑制树突状细胞而有效地抑制干扰素信号介导的肠管整体的炎症扩散。
第四、附图说明
图1为表示参考试验例1的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药MIRTX(miR-29b衍生物(人工miRNA))/sCA复合体之后，测定直肠、横结肠、盲肠及回肠中的MIRTX的吸收量而得到的结果的图。b为表示向DSS引发的小鼠肠炎模型静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，对肠进行核染色并通过荧光显微镜观察而得到的结果的图像。
图2为表示试验例1的结果的图。a为表示测定从静脉给药DSS和miR-29b/sCA复合体的小鼠中取出的大肠粘膜中的miR-29b-3p表达量而得到的结果的图。b为表示对从静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠中摘除的直肠进行HE染色并进行显微镜观察而得到的结果的图。c为表示随着时间的经过测定所述小鼠的体重而得到的结果的图。d为表示随着时间的经过测定试验开始7天后的所述小鼠的体重而得到的结果的图。
图3为表示试验例1的结果的图。a为表示针对静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠测定试验开始后7天后的大肠的长度而得到的结果的图。b为表示针对所述小鼠对试验开始7天后的结直肠的炎症的程度进行评分的结果的图。c为表示针对试验开始时的正常组、试验开始4天后及6天后的DSS组测定大肠中的miR-29b的表达量而得到的结果的图。
图4为表示参考试验例2的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，通过抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。b为表示利用共聚焦显微镜观察所述免疫染色后的直肠而得到的结果的图像。
图5为表示在试验例2中，向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体之后，回收大肠，并测定从其的粘膜中所分离的树突状细胞中的各种细胞因子(IL12 p40、IL23p19、IL-6及TGF-β)的信使RNA的表达量而得到的结果的图。
图6为表示在试验例3中，使用从静脉给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠中摘除的大肠，通过IPA进行基因表达量分析而得到的结果的图。
图7为与由Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)产生IFN及炎症性细胞因子相关的细胞内信号通路图。图7中，在带有*的分子中，通过DSS的静脉给药确认到激活。
图8为IFN信号通路。图8中，带有*的分子通过IPA预测到了基因的激活，带有○的分子为通过mRNA阵列确认到了上调的分子。
图9为表示试验例4的结果的图。a为表示随着时间的经过测定皮下给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠的体重而得到的结果的图。b为表示测定所述小鼠的试验结束时的体重而得到的结果的图。c为表示测定所述小鼠的大肠的长度而得到的结果的图。d为表示对所述小鼠的直肠的炎症的程度进行评分而得到的结果的图。e为表示针对DSS+sCA-miR-29b组对摘除的直肠进行HE染色并利用显微镜进行观察而得到的结果的图。
图10为表示试验例5的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miR-29b/sCA复合体之后，利用抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。b为表示针对从所述小鼠的大肠分离出的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞测定miR-29b量而得到的结果的图。c为表示利用抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体及DAPI对所述小鼠的直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图11为表示在试验例5中，向DSS诱导小鼠肠炎模型中皮下给药Alexa647-miR-29b/sCA复合体之后，利用抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图12为表示试验例6的结果的图。a为表示向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药miR-29b/sCA复合体(>50nm)或miR-29b/sCA复合体(≤50nm)之后，对直肠进行HE染色并利用显微镜进行观察而得到的结果的图。b为表示针对所述小鼠的大肠利用组织学方式评价炎症度而得到的结果的图。
图13为表示在参考试验例3中，向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miRNA/sCA复合体之后，利用抗CD11c抗体及DAPI对直肠进行免疫染色并利用荧光显微镜进行观察而得到的结果的图像。
图14为表示在参考试验例4中，向DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药MIRTX/sCA复合体之后，回收大肠，并测定从其的粘膜分离的CD11c阳性细胞(树突状细胞)和CD11c阴性细胞中的MIRTX的吸收量而得到的结果的图。
图15为表示参考试验例5的结果的图。a为表示随时间的经过测定局部给药DSS和各种miRNA/sCA复合体的小鼠的体重而得到的结果的图。b为表示测定所述小鼠的试验结束时的体重而得到的结果的图。c为表示测定所述小鼠的大肠的长度而得到的结果的图。d为表示对所述小鼠的直肠的炎症的程度进行评分而得到的结果的图。e为表示针对DSS+sCA-miR-29b组对摘除的直肠进行HE染色并进行显微镜观察而得到的结果的图。
第五、具体实施方式
本发明的预防或治疗剂，其特征在于，是用于预防或治疗炎症性肠病的药剂，包含使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子而成的复合粒子，且被全身给药。下面，对本发明的预防或治疗剂进行详细叙述。
miRNA
本发明的预防或治疗剂包含miR-29a和/或miR-29b作为miRNA。有报告称，在敲除了miR-29a及miR-29b的小鼠中，会使由硫酸葡聚糖(DSS)诱发的结肠炎恶化(非专利文献8)，但目前并不知道，这些miRNA在树突状细胞中具有降低IL-6、TGF-β、IL12 p40及IL23 p19等细胞因子的表达量的作用。
本发明中所使用的miR-29a可以为成熟型miRNA，另外，也可以为发夹型前体miRNA(pri-miRNA)或pri-miRNA的一部分被切断的pre-miRNA。该pri-miRNA或pre-miRNA在细胞内受到加工而变为成熟型miR-29a。也可以形成与具有互补碱基序列的RNA构成的双链的前体。该双链RNA在细胞内解开双链而使成熟型miR-29a游离出来。另外，关于发夹型前体的miR-29a的碱基序列，设置为在生物体内受到加工而产生成熟型miR-29a即可，这样的碱基序列可以由本领域技术人员适当设置。
关于本发明中所使用的miR-29a的来源，根据作为应用对象的动物的种类适当设置即可。例如，如果用于人的炎症性肠病的治疗，则使用来自人的miR-29a即可。作为本发明中所使用的来自人的miR-29a，具体而言，可举出下面所示的成熟型miR-29a。需要指出，来自小鼠的miR-29a的碱基序列与来自人的miR-29a相同。
成熟型has-miR-29a(sense)：5'-UAG CAC CAU CUG AAA UCG GUU A-3'(序列号1)
成熟型has-miR-29a(antisense)：5'-UAA CCG AUU UCA GAU GGU GCU A-3'(序列号2)
另外，本发明中所使用的miR-29b可以为成熟型miRNA，另外，也可以为发夹型前体miRNA(pri-miRNA)或pri-miRNA的一部分被切断的pre-miRNA。该pri-miRNA或pre-miRNA在细胞内受到加工而形成成熟型miR-29b。可以形成与具有互补碱基序列的RNA构成的双链的前体。该双链RNA在细胞内解开双链从而使成熟型miR-29b游离出来。另外，关于发夹型前体的miR-29b的碱基序列，设置为在生物体内受到加工而产生成熟型miR-29b即可，这样的碱基序列可以由本领域技术人员适当设置。
关于本发明中所使用的miR-29b的来源，根据作为应用对象的动物的种类适当设置即可。例如，如果用于人的炎症性肠病的治疗，则使用来自人的miR-29b即可。作为本发明中所使用的来自人的miR-29b，具体而言，可举出下面所示的成熟型miR-29b。需要指出，来自小鼠的miR-29b的碱基序列与来自人的miR-29b相同。
成熟型has-miR-29b(sense)：5'-UAG CAC CAU UUG AAA UCA GUG UU-3'(序列号3)
成熟型has-miR-29b(antisense)：5'-AAC ACU GAU UUC AAA UGG UGC UA-3'(序列号4)
为了赋予耐受酶降解的性质等，miR-29a和/或miR-29b可以根据需要而被实施通常对核酸施加的各种修饰。作为这样的修饰，例如，可举出：2'-O甲基化等糖链部分的修饰;碱基部分的修饰;氨基化，低级烷基氨基化、乙酰基化等磷酸部分的修饰等。
在本发明的预防或治疗剂中，作为miRNA，可以仅使用miR-29a或miR-29b中的一种，另外，也可以将它们组合使用。
碳酸羟基磷灰石粒子
碳酸羟基磷灰石为具有羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)的羟基的一部分被CO3取代而成的结构并由通式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYn所表示的化合物。在此，X为能够部分取代碳酸羟基磷灰石中的Ca的元素，例如，可举出Sr、Mn、稀土元素等。m通常为0以上且1以下的正数，优选为0以上且0.1以下，更优选为0以上且0.01以下，进一步优选为0以上且0.001以下。Y为能够部分取代碳酸羟基磷灰石中的CO3的基团或元素，可举出OH、F、Cl等。n通常为0以上且0.1以下的正数，优选为0以上且0.01以下，更优选为0以上且0.001以下，进一步优选为0以上且0.0001以下。
关于本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径，只要为能够被给药至生物体内并向细胞内转移程度的大小，则没有特别限制，但在树突状细胞中的吸收主要通过吞噬作用(日语：ファゴトーシス)来进行，因此，与用作血液给药的核酸载体的现有的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径(50nm以下)相比，更优选使用较大的平均粒径。具体而言，作为本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径，可举出：通常为超过50nm(例如，超过50nm且3000nm以下)，优选为100～3000nm，进一步优选为100～2000nm，更优选为200～2000nm或400～3000nm，特别优选为400～2000nm。
需要指出，所述碳酸羟基磷灰石的平均粒径为通过动态光散射法粒子测量(DLS)所测定的值。在存在不适合使用DLS的测定的巨大粒子(例如，粒径5μm以上)的情况下，将它们从待测定范围中除去。另外，在本说明书中，粒径表示在利用扫描型探针显微镜进行测定时，能够作为单独的粒子所识别的独立粒子的粒径。由此，在多个粒子聚集的情况下，将这些集合体判断为一个粒子。
碳酸羟基磷灰石粒子能够根据公知的方法来获得。例如，能够通过在水溶液中使钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子共存来制备得到。关于水溶液中的各种离子的浓度，只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子即可，没有特别限制，能够参考下述适当设置。
作为水溶液中的钙离子浓度，可举出：通常为0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。
作为水溶液中的磷酸根离子浓度，可举出：通常为0.1～1000mM，优选为0.5～100mM，进一步优选为1～10mM。
作为水溶液中的碳酸氢根离子浓度，可举出：通常为1.0～10000mM，优选为5～1000mM，进一步优选为10～100mM。
作为钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子的供应源，只要能够向水溶液中供应这些离子即可，没有特别限制，例如，可举出这些离子的水溶性盐。具体而言，作为钙离子源，能够使用CaCl2，作为磷酸根离子源，能够使用NaH2PO4·2H2O，作为碳酸氢根离子离子源，能够使用NaHCO3。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，则用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液也可以包含除上述各离子供应源及其它物质以外的成分。例如，可以通过在水溶液中向上述组合物中添加氟离子、氯离子、Sr、Mn、聚乙二醇(PEG)等来部分取代或修饰碳酸羟基磷灰石中的Ca或CO3等。其中，氟离子、氯离子、Sr、Mn、PEG等的添加量优选在不会对所形成的复合体粒子的pH溶解性、粒径范围产生明显影响的范围内。另外，用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液使用水作为基剂即可，也可以使用用于细胞培养的各种培养基或缓冲液等。
在制备本发明中所使用的碳酸羟基磷灰石粒子时，向水溶液中混合各离子供应源及其它物质的顺序没有特别限定，只要能够获得所需的碳酸羟基磷灰石粒子，则可以按照任何的混合顺序制备水溶液。例如，能够制备含有钙离子及其它物质的第一溶液，同时，另外制备含有磷酸根离子及碳酸氢根离子的第二溶液，将第一溶液与第二溶液混合，从而制备水溶液。
能够通过将上述含有各离子的水溶液的pH调节在6.0～9.0的范围内并放置一定时间(孵育)而获得碳酸羟基磷灰石粒子。作为形成碳酸羟基磷灰石粒子时的该水溶液的pH，例如，可举出：7.0～8.5，优选为7.1～8.5，进一步优选为7.2～8.5，更进一步优选为7.3～8.5，特别优选为7.4～8.5，最优选为7.5～8.0。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，形成碳酸羟基磷灰石粒子时的该水溶液的温度条件则没有特别限制，可举出：通常为4℃以上，优选为25～80℃，进一步优选为37～70℃以上。
只要能够形成碳酸羟基磷灰石粒子，用于形成碳酸羟基磷灰石粒子的该水溶液的孵育时间则没有特别限制，可举出：通常为1分钟～24小时，优选为5分钟～1小时。有无粒子形成能够通过例如在显微镜下观察而确认。
另外，作为将碳酸羟基磷灰石粒子的平均粒径控制在所述范围的方法，没有特别限制，例如，可举出：对所述水溶液中所形成的碳酸羟基磷灰石粒子进行超声波振动处理的方法。作为超声波振动处理，具体而言，可举出：使超声波破碎机等的超声波振子直接与试样接触从而施加超声波的处理;使用具备超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器，向该水槽中加入液体(例如，水)，并使装有碳酸羟基磷灰石粒子的容器(例如，塑料制造的管子)浮在其中，经由液体向包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液施加超声波的处理等。通过这样的超声波振动处理，能够简便且高效地使碳酸羟基磷灰石粒子的粒径细化至所述范围。而且，超声波处理之后，也可以通过利用规定的孔径的过滤器分离所需粒径的碳酸羟基磷灰石粒子来将碳酸羟基磷灰石粒子的粒径调节至所述范围。
只要能够将粒径控制至规定范围，上述超声波振动处理的条件则没有特别限制。例如，如果使用具备超声波振子及水槽(清洗槽)的超声波清洗器来进行，则示例以下的条件。
水槽的温度：例如5～45℃，优选为10～35℃，进一步优选为20～30℃
高频输出：例如10～500W，优选为20～400W，进一步优选为30～300W，更优选为40～100W。
振荡频率：例如10～60Hz，优选为20～50Hz，进一步优选为30～40Hz。
处理时间：例如，30秒～30分钟，优选为1～20分钟，进一步优选为3～10分钟。
只要能够将粒子细化至规定的粒径范围，则进行超声波振动处理时所使用的包含碳酸羟基磷灰石粒子的容器的种类没有限制，能够根据水溶液的体积及使用目的适当选择。例如，能够使用1～1000ml容量的塑料制造的管子。
另外，超声波振动处理优选在分散剂存在下(即，将分散剂添加在包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中的状态)进行。这是因为，通过在分散剂与碳酸羟基磷灰石粒子共存的环境进行超声波振动处理，能够得到具有更细微的粒径的碳酸羟基磷灰石纳米粒子，也能够抑制粒子的再聚集。关于分散剂的种类，以能够分散碳酸羟基磷灰石粒子为限度，没有特别限制，只要为通常添加于药品的分散剂即可，作为一例，可举出白蛋白。分散剂可以单独使用一种，另外，也可以组合使用两种以上。作为分散剂在包含碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中的浓度，只要能够得到细化和/或抑制再聚集的效果，则没有特别限制，例如，可举出：0.1～500mg/ml，优选为1～100mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml左右;或0.001～10重量%左右。
(miR-29a和/或miR-29b和碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子)
在本发明的预防或治疗剂中，使用使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子并复合化而成的复合粒子。通过这样地使miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子复合化，不仅能够将miR-29a和/或miR-29b输送至炎症性肠病的患处，还能够使其高效地吸收至树突状细胞。另外，该复合粒子被导入细胞内之后，在细胞内miR-29a和/或miR-29b能够从碳酸羟基磷灰石粒子中游离出来，因此，能够使miR-29a和/或miR-29b发挥所需的活性。
在本发明中，使miR-29a和/或miR-29b负载于碳酸羟基磷灰石粒子并复合化而成的复合粒子是指miR-29a和/或miR-29b通过离子键、氢键等吸附而负载于碳酸羟基磷灰石粒子的状态。关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子的形成方法，没有特别限制，例如，可举出如下方法等：通过使miR-29a和/或miR-29b和碳酸羟基磷灰石粒子在水溶液中共存而形成;在制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液中，使miR-29a和/或miR-29b与钙离子、磷酸根离子及碳酸氢根离子共存，从而同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和所述miRNA与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化。
关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子的形成，在同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化的情况下，以达到例如0.1～1000nM，优选为0.5～500nM，进一步优选为1～200nM的方式，向用于制备碳酸羟基磷灰石的水溶液中添加miR-29a和/或miR-29b。通常，水溶液中存在的miR-29a和/或miR-29b的60%左右被内含于碳酸羟基磷灰石粒子从而被复合化。
在miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子中，关于miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的比率，没有特别限制，根据miR-29a和/或miR-29b的给药量等适当设置即可。例如，在使2mg miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子复合化的情况下，向前述用于制备碳酸羟基磷灰石粒子的水溶液2.5L中添加5mg miR-29a和/或miR-29b，并同时进行碳酸羟基磷灰石粒子的形成和miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合化即可。
另外，在本发明中，以分散在适合向生物体给药的溶剂中的状态来使用miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子。如上所述，通过将作为各种离子供应源的物质溶解在水、培养基或缓冲液等溶剂中而得到碳酸羟基磷灰石粒子，但从渗透压、缓冲能力、无菌性等观点出发，这样得到的碳酸羟基磷灰石粒子分散溶液不一定适合向生物体全身给药。为了将供碳酸羟基磷灰石粒子分散的溶剂替换为适合向生物体给药的溶剂(例如，生理盐水等)，通常，需要如下操作：通过离心分离、过滤、重力沉降等从溶剂中分离并回收碳酸羟基磷灰石粒子，从而替换溶剂。将碳酸羟基磷灰石粒子添加在适合向生物体给药的溶剂中之后，进行前述的超声波振动处理，由此能够使miR-29a和/或miR-29b与碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子在适合向生物体给药的溶剂中以所述适度的粒径分散。优选这样使其分散之后，在该复合粒子聚集之前快速向生物体给药。例如，超声波振动处理后1分钟以内，优选为30秒以内给药是合适的。但是，在如上所述地通过添加分散剂来抑制碳酸羟基磷灰石粒子的聚集的情况下，也可以在超声波振动处理后，经过数分钟～数十分钟、或1天至数天后再给药。
用途
负载有miR-29a和/或miR-29b的碳酸羟基磷灰石粒子的复合粒子能够有效地治愈或改善炎症性肠病的症状，因此，本发明的预防或治疗剂能够用于炎症性肠病的治疗用途。另外，炎症性肠病有时也会反复复发和缓解，同时缓慢地发展，因此，本发明的预防或治疗剂也能够用于炎症性肠病的预防及防治复发。
炎症性肠病大致分为溃疡性结肠炎和克罗恩病，本发明的预防或治疗剂能够用于这些中的任意一种。
给药方法
本发明的预防或治疗剂通过全身给药而给药。如果局部给药，则不能将miR-29a和/或miR-29b输送至树突状细胞，但通过全身给药，能够将所述miRNA的一部分直接输送至患处，并将所述miRNA的一部分高效地吸收至树突状细胞。
作为全身给药，具体而言，可举出：血管内(动脉内或静脉内)给药、皮下给药、肌肉内给药、腹膜内给药等。其中，从更进一步提高炎症性肠病的治疗效果的观点出发，优选为血管内给药，皮下给药，进一步优选为静脉内注射。
关于本发明的预防或治疗剂的给药量，根据炎症性肠病的程度、患者的性别、年龄、症状等适当确定，因此不能一概而论，例如，可举出：以miR-29a和/或miR-29b的成熟型miRNA量换算，每天1～100mg/m2(体表面积)左右。
实施例
下面，根据实施例等对本发明进行详细地说明，但本发明不受其限制。需要指出，下面所示的试验全部在大阪大学医学部的动物管理使用委员会及大阪大学动物实验委员会(许可号:260033-006)的许可下进行。
参考例1：miRNA及碳酸羟基磷灰石的复合体的制备
除试验例6以外，使用通过以下的方法所制造的miRNA及碳酸羟基磷灰石的复合体。首先，制备无机水溶液(NaHCO3;44mM,NaH2PO4;0.9mM,CaCl2;1.8mM,pH 7.5)。向该无机水溶液50ml中添加miRNA100μg，在37℃下孵育30分钟。然后，以12,000rpm×3分离心沉降，获得包含60μg miRNA的颗粒(使miRNA内含在碳酸羟基磷灰石粒子中而得到的复合粒子;miRNA/sCA复合体)。以达到200μL的方式向该颗粒中添加生理盐水(含有0.5重量%白蛋白)并使其分散，对其进行超声波振动处理(38kHz,80W)10分钟之后立刻用于试验。需要指出，得到的miRNA/sCA复合体的平均粒径为400～2000nm这一点是利用Zetasizer Nano ZS(马尔文)的动态光散射法粒子测量(DLS)确认的。
在下面的试验例中，使用下面所示的成熟miRAN(双链)。在下面的试验例中，所使用的miRNA的量为正义链和反义链的合计量。下面，有时也将包含miR-29a的碳酸羟基磷灰石粒子记作“miRNA-29a/sCA复合体”。另外，关于包含其它miRNA的碳酸羟基磷灰石粒子，有时也按照相同的记载形式来记录。
[表1]
参考试验例1
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含硫酸葡聚糖(DSS)2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，从而制得DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型尾静脉给药MIRTX/sCA复合体或Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
在给药MIRTX/sCA复合体的组中，给药4小时后处死小鼠，磨碎直肠、横结肠、盲肠及回肠，回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定MIRTX的各肠管中的吸收量(n=3)。需要指出，MIRTX的定量将RNU6B作为内标并作为MIRTX量相对于RNU6B量的相对值而求得。
另外，在给药Alexa647-miRNA/sCA复合体的组中，给药4小时后，从小鼠取下直肠(炎症最严重的直肠部位)并制成冷冻切片，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)进行核染色，并利用荧光显微镜进行观察。
需要指出，为了进行比较，使用未给药DSS的正常小鼠，除此之外，在与所述相同的条件下进行试验。
将给药MIRTX/sCA复合体并测定MIRTX在各肠管中的吸收量而得到的结果示于图1的a。其结果，与未给与DSS的正常小鼠相比，在DSS诱导小鼠肠炎模型中，MIRTX在肠管中的吸收量显著提高，但MIRTX的吸收量自身并不很高。
另外，将给药Alexa647-miRNA后所回收的直肠进行核染色并进行显微镜观察而得到的结果示于图1的b。需要指出，在图1的b中，比例尺为50μm。其结果，在DSS诱导小鼠肠炎模型中，与未给与DSS的正常小鼠相比，直肠中表示吸收了Alexa647-miRNA的红色信号(Alexa647的荧光)稍微增加，但该信号仍较少。从以上的结果可确认到，即使尾静脉给药miRNA/sCA复合体，miRNA向肠管的吸收量也没有达到高水平。
试验例1
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表2所示的六组。向各组小鼠在表2所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体或miRNA。
[表2]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重(n=5)。另外，关于试验开始时的Normal组、试验开始第4天及第6天的DSS组及DSS+sCA-miR-29b组，处死小鼠，回收并磨碎大肠粘膜，回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定miR-29b-3p表达量(n=3)。需要指出，miR-29b-3p表达量的定量将RNU6B用作内标并作为miR-29b的表达量相对于RNU6B量的相对值而求得。
另外，从第9天处死的小鼠中回收大肠。对所回收的大肠测定大肠的长度，并对炎症最严重的直肠部位进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态(n=5)。另外，根据下述的标准对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度就粘膜损伤、粘膜下组织损伤、及肌肉层损伤进行评分，将这些得分的合计值作为组织学炎症评分(Histologicalinflammation score)而算出(n=5)。
<粘膜损伤>
0：正常
1：3-10上皮淋巴细胞(IEL)/高倍视野(HPF)和局灶性损伤
2：10IEL/HPF和罕见的隐窝脓肿
3：10IEL/HPF，多个隐窝脓肿和糜烂/溃疡
<粘膜下组织损伤>
0：正常或广泛分散的白细胞
1：白细胞聚集
2：弥漫性白细胞浸润伴粘膜下层扩张
3：弥漫性白细胞浸润
<肌肉层损伤>
0：正常或广泛分散的白细胞
1：肌肉层之间广泛分散的白细胞聚集体
2：白细胞浸润伴肌肉萎缩
3：广泛的白细胞浸润，肌肉透壁性消失
将针对DSS组及DSS+sCA-miR-29b组，测定大肠粘膜中的miR-29b-3p表达量而得到的结果示于图2的a。其结果，在DSS组中，与Normal组相比，可以确认到miR-29b的表达量降低，而在DSS+sCA-miR-29b组中确认到，与DSS组相比，能够显著抑制miR-29b的表达量的降低。
将对直肠进行HE染色并观察到的结果示于图2的b。其结果，在DSS组、DSS+sCA-NC-miR组及DSS+miR-29b组中确认到，直肠的粘膜结构被破坏，大量炎症细胞浸润至粘膜。而在DSS+sCA-miR-29a组及DSS+sCA-miR-29b组中，结肠的粘膜结构基本保持正常，也几乎未见炎症细胞的浸润。
将随着时间的经过而测得的小鼠的体重的结果示于图2的c，将测定试验开始7天后的小鼠的体重而得到的结果示于图2的d。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图3的a，将组织学炎症评分的结果示于图3的b。其结果，在DSS+sCA-miR-29a组及DSS+sCA-miR-29b组中，与DSS组、DSS+sCA-NC-miR组及DSS+miR-29b组相比，可见抑制小鼠的体重的减少、显著抑制大肠缩短及组织学炎症评分降低均显著。
以上结果表明，当miR-29a/sCA复合体及miR-29b/sCA复合体静脉给药时，虽然miRNA的肠管直接吸收较低(所述参考试验例1的结果)，但能够有效地改善炎症性肠病。
另外，将针对试验开始时的正常组、试验开始4天后及6天后的DSS组，测定大肠中的miR-29b的表达量而得到的结果示于图3的c。其结果表明，在炎症性肠病发病的小鼠中，大肠中的miR-29b的表达量降低。
参考试验例2
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，制得DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型尾静脉给药Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。给药Alexa647-miRNA/sCA复合体4小时后从小鼠中取下大肠，针对炎症最严重的直肠部位制作冷冻切片，使用抗CD11c抗体及DAPI进行免疫染色(CD11c为绿色)，并使用荧光显微镜及共聚焦显微镜进行观察。另外，为了进行比较，使用未给药DSS的正常小鼠，除此之外，在与所述相同的条件下进行试验。
将针对免疫染色后的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图4的a，将在使用DSS诱导小鼠肠炎模型时利用共聚焦显微镜所观察到的结果示于图4的b。需要指出，图4的a中比例尺为50μm，图4的b中的比例尺为5μm。在图4的a中，上方的图像为Alexa647-miRNA所发出的红色信号和DAPI所发出的蓝色信号的观察结果，中部的图像为抗CD11c抗体所发出的绿色信号和DAPI所发出的蓝色信号的观察结果，下方的图像为上方的图像和中部的图像的叠加图像。由抗CD11c抗体所产生的显色表示存在树突状细胞。
由图4的a可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。另外，由图4的b可知，由抗CD11c抗体所产生的绿色信号存在于细胞表面，Alexa647-miRNA所发出的红色信号充满细胞质内。由以上结果表明，若静脉给药siRNA/sCA复合体，则siRNA/sCA复合体被吸收至树突状细胞，该树突状细胞在肠管内活动。
试验例2
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型在第1天、第2天及第3天尾静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到每次60μg/小鼠，第4天从小鼠中取下大肠。从该大肠的粘膜提取粘膜固有层细胞(Laminapropria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离CD11c阳性细胞。从得到的CD11c阳性细胞中提取RNA。接着，通过定量RT-PCR测定各种细胞因子(IL12 p40、IL23p19、IL-6及TGF-β)的表达量(n=3)。需要指出，各细胞因子的表达量的定量将β-肌动蛋白用作内标并作为各细胞因子的表达量相对于β-肌动蛋白量的相对值而求出。
另外，为了进行比较，针对未给药DSS及miRNA/sCA复合体的正常小鼠(Normal)、以及仅给药DSS而未给药miRNA/sCA复合体的DSS诱导小鼠肠炎模型(DSS)，也与所述相同地进行各细胞因子表达量的测定。
得到的结果示于图5。其结果，通过向DSS诱导小鼠肠炎模型静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，确认到IL12 p40、IL23 p19、IL-6及TGF-β的表达量显著降低。我们知道，IL-6及TGF-β是已知参与幼稚T细胞向Th-17细胞的分化的细胞因子，IL12 p40及IL23 p19是激活Th-17细胞并导向病原性Th-17细胞(pathogenic Th17cells)的细胞因子。即推测，通过静脉给药sCA-miR-29a/sCA复合体或sCA-miR-29b/sCA复合体，使miR-29a或miR-29b积蓄于树突状细胞，由此，下调IL-6及TGF-β从而抑制幼稚T细胞向Th-17细胞分化，并下调IL12 p40及IL23 p19从而抑制Th-17细胞激活为病原性Th-17细胞。
试验例3
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表3所示的四组。对各组小鼠在表3所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表3]
从处死的小鼠中回收大肠。从回收的大肠中提取RNA，使用TruSeq stranded mRNAsample prep kit(Illumina,San Diego,CA)，按照生产商的说明书制作mRNA库。基因测序使用Illumina HiSeq 2500 platform(75-base single-end mode)来进行。碱基识别使用Illumina Casava1.8.2软件来进行。确定的序列使用组合有Bowtie2 ver.2.2.3和SAMtools ver.0.1.19TopHat v2.0.13的TopHat v2.0.13映射到小鼠参照基因组序列(mm10)。映射100万个前导序列，使用Cuffnorm version2.2.1来算出将转录产物(片断)的长度为1k base时的归一化的基因表达量。
接着，使用QIAGEN's Ingenuity Pathway Analysis(IPA,QIAGENRedwood City，www.qiagen.com/ingenuity)进行pathway解析(作为截止值，对于各基因设置为P<0.05)。
将通过IPA对基因表达量进行分析而得到的结果示于图6的a。图6中，通过Normal组和sCA-NC-miR组的对比，选取在sCA-NC-miR组中确认到激活的分子，即通过给药DSS而激活的分子。图6中，颜色越浓，表示激活(表达量)的程度越高。另外，图6中显示下划线的分子为多个被鉴定的IFN通路相关分子。其结果确认到，在sCA-miR-29a组及sCA-miR-29b组中，具有使sCA-NC-miR组中确认到激活的分子的Z评分(激活的程度)降低的倾向。
另外，图7中示出了与由Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)产生IFN及炎症性细胞因子相关的细胞内信号通路图。图7中带有*的分子，通过给药DSS而确认到激活。而且，图8中示出了公知的IFN信号通路图。图8中，带有*的分子被预测将激活预测可通过IPA而被激活的基因，带有○的分子是通过mRNA阵列确认到下调的分子。
试验例4
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表4所示的四组(各组n=3)。对各组小鼠在表4所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表4]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重。另外，从小鼠中回收大肠，并测定大肠的长度，同时对炎症最严重的直肠部位进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态。而且，通过与所述试验例1相同的方法对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度进行评分，求得组织学炎症评分(Histological inflammation score)。
将随着时间经过测定小鼠的体重而得到的结果示于图9的a，将测定试验结束时(miRNA/sCA复合体给药开始后的第9天)的小鼠的体重而得到的结果示于图9的b。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图9的c，及将组织学炎症评分的结果示于图9的d。其结果，在DSS+sCA-miR-29b组中，与DSS组及DSS+sCA-NC-miR组相比，确认到抑制小鼠的体重减少、抑制大肠的缩短及组织学炎症评分降低均显著。
另外，将针对DSS+sCA-miR-29b组对直肠进行HE染色并观察到的结果示于图9的e。由图9的e可知，在DSS+sCA-miR-29b组中，结肠的粘膜结构几乎保持正常，也几乎未见炎症细胞的浸润。
由以上结果确认到，即使miR-29b/sCA复合体不是静脉给药而是皮下给药，也能够有效地改善炎症性肠病。即，这些结果明确表明，miR-29a/sCA复合体及miR-29b/sCA复合体通过全身给药能够有效地治疗炎症性肠病。
试验例5
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647conjugated miR-29b/sCA复合体，以使得miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
给药所述复合体4小时后，从小鼠中取下大肠，制作炎症最严重的直肠部位的冷冻切片，使用抗CD11c抗体、抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体、及DAPI进行免疫染色，并利用荧光显微镜进行观察。
将针对利用抗CD11c抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD11c+树突状细胞进行了免疫染色而得到的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图10a。由图10a可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。即，由该结果确认到，在皮下给药Alexa647 conjugated miR-29b/sCA复合体时，miRNA被高效地吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
另外，从所述取下的大肠中提取粘膜固有层细胞(Lamina propria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离出CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞。从得到的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞中分别回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定miR-29b量。需要指出，miR-29b量的定量作为将未给药所述复合体时的miR-29b的表达量设为1时的相对值而求出。将结果示于图10b。其结果，在CD11c阳性细胞中，给药Alexa647-miRNA的组(DSS+sCA-miR-29b)与仅给药DSS的组(DSS alone)相比确认到miR-29b量增大。可以认为，该miR-29b量的增大是由于外来的miR-29b(即，Alexa 647 conjugated miR-29b)被吸收至CD11c阳性细胞而产生的。由以上结果表明，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b与CD11c阳性细胞的定位模式一致，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b被吸收至树突状细胞中，并定位于引起了炎症的肠管。
另外，将通过抗Ly-6G抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和Ly-6G+中性粒细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗F4/80抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和F4/80+巨噬细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗CD4抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD4+辅助T细胞进行免疫染色而得到的结果、通过抗CD45R抗体(绿)及DAPI(蓝)对核和CD45R+B细胞进行免疫染色而得到的结果示于图11。其结果确认到，Alexa 647 conjugated miR-29b所呈现的红色未与所述各免疫细胞所呈现的绿色重叠，皮下给药的Alexa 647 conjugated miR-29b未被吸收至除树突状细胞以外的免疫细胞。
试验例6
(1)miR-29b/sCA复合体的制备
首先，制备无机水溶液(NaHCO3;44mM,NaH2PO4;0.9mM,CaCl2;1.8mM,pH 7.5)。向该无机水溶液50ml中添加miR-29b 100μg，在37℃下孵育30分钟。然后，以12,000rpm×3分钟离心沉降，获得包含60μg miRNA的颗粒(使miRNA内含在碳酸羟基磷灰石粒子中而得到的复合粒子;miRNA/sCA复合体)。以达到200μL的方式向该颗粒中添加生理盐水(含有0.5重量%白蛋白)并使其分散，对其进行超声波振动处理(38kHz,80W)之后，通过薄膜过滤器分离为大于50nm且约3000nm以下的粒子(下面称为miR-29b/sCA复合体(>50nm))和10nm以上且50nm以下的粒子(下面称为miR-29b/sCA复合体(≤50nm))之后，立刻用于试验。
(2)试验方法
将8周龄的BALB/cAJcl小鼠(雌)分为表5所示的三组(每组两只)。对各组小鼠在表5所示的条件下给药DSS和miR-29b/sCA复合体。
[表5]
从处死的小鼠中回收大肠并进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态，通过组织学方式评价炎症度。关于炎症度，针对“粘膜固有层的伤害”，“粘膜下层的伤害”及“肌肉层的伤害”这三项，按照下述判定标准评为0～3分，以总分9分进行评价。另外，作为炎症度的评价，将所回收的大肠的全长10等分，并分别将10个视野的评价结果进行平均，由此进行评分。
<粘膜固有层的伤害的判定标准>
0分：正常所见。
1分：每一高倍视野(high power field;HPF)，存在3～10个无上皮的细胞(intraepithelial lymphocytes;IEL)，可见局部的粘膜损伤。
2分：每一HPF可见10个以上IEL和轻微的隐窝脓肿。
3分：每一HPF可见10个以上IEL和轻微的散在隐窝脓肿及糜烂和溃疡。
<粘膜下层的伤害的判定标准>
0分：正常、或散见少量的中性粒细胞浸润图像。
1分：可见局部的中性粒细胞浸润。
2分：可见弥漫性的中性粒细胞浸润，伴随粘膜下层的扩大。
3分：粘膜下层整体可见中性粒细胞浸润。
<肌肉层的伤害的判定标准>
0分：正常、或好肌肉层的一部分散见中性粒细胞。
1分：肌肉层得以保持，但肌肉层之间可见弥漫性的中性粒细胞浸润。
2分：由于中性粒细胞浸润，可见肌肉层排列杂乱。
3分：由于大范围的中性粒细胞浸润，可见跨壁性的肌肉层的序列杂乱。
(3)试验结果
将进行HE染色并观察到的结果示于图12的a。由图12的a可知，在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组及DSS+sCA(≤50nm)-miR-29b组中，与DSS相比，大肠的粘膜结构的破坏程度降低，特别是在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组中，与DSS+sCA(≤50nm)-miR-29b组相比，大肠的粘膜结构的破坏程度大幅度降低。
另外，将通过组织学方式评价炎症度而得到的结果示于图12的b。从组织学评价结果也确认到，在DSS+sCA(>50nm)-miR-29b组中，与DSS组相比可见显著差异，炎症抑制效果大幅提高。
由以上结果表明，通过使用粒径超过50nm的大粒子作为负载miR-29b的碳酸羟基磷灰石，使炎症性肠病的治疗效果更进一步提高。
参考试验例3
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含DSS 2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下给药Alexa647-miRNA/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。给药Alexa647-miRNA/sCA复合体4小时后，从小鼠中取下大肠，制作炎症最严重的直肠部位的冷冻切片，使用抗CD11c抗体及DAPI进行免疫染色(CD11c为绿色)，并利用荧光显微镜进行观察。
将针对免疫染色后的冷冻切片利用荧光显微镜进行观察而得到的结果示于图13。由图13可知，Alexa647-miRNA所发出的红色信号和由抗CD11c抗体所产生的绿色信号的分布一致。即，即使皮下给药miRNA/sCA复合体，也与静脉给药的情况相同，miRNA被高效地吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
参考试验例4
使7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)饮用包含硫酸葡聚糖(DSS)2重量%的水7天，使炎症性肠炎发病，制作DSS诱导小鼠肠炎模型。向该DSS诱导小鼠肠炎模型皮下脉(日语：皮下脈)给药MIRTX/sCA复合体，以使miRNA的给药量达到60μg/小鼠。
给药MIRTX/sCA复合体4小时后，处死小鼠，取出大肠。从该结肠的粘膜中提取粘膜固有层细胞(Lamina propria cells)，使用抗CD11c抗体和autoMACS Pro Separator，分离出CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞。从得到的CD11c阳性细胞和CD11c阴性细胞中分别回收RNA。接着，通过定量RT-PCR测定MIRTX在各肠管中的吸收量。需要指出，MIRTX的定量将RNU6B用作内标并作为MIRTX量相对于RNU6B量的相对值而求出。
另外，为了进行比较，不给药MIRTX/sCA复合体，在与所述相同的条件下进行MIRTX的定量。
得到的结果示于图14。其结果，在皮下脉给药MIRTX/sCA复合体的情况下，CD11c阳性细胞中确认到了较高的MIRTX量，而在CD11c阴性细胞中，MIRTX量则较少。即，由该结果也确认到，在皮下给药miRNA/sCA复合体时，其高效地被吸收至树突状细胞，并定位于引起了炎症的肠管。
参考试验例5
将7周龄的BALB/c小鼠(日本clea株式会社)分为表6所示的四组(各组n=5)。对各组小鼠在表6所示的条件下给药DSS和miRNA/sCA复合体。
[表6]
从试验开始至结束时为止，测量小鼠的体重。另外，从小鼠中回收大肠，并测定大肠的长度，同时进行苏木精-伊红(HE)染色，利用显微镜观察炎症的状态。而且，通过与所述试验例1相同的方法，对炎症最严重的直肠部位的炎症的程度进行评分，求得组织学炎症评分(Histological inflammation score)。
将随时间经过测定小鼠的体重而得到的结果示于图15的a，将测定试验结束时(miRNA/sCA复合体给药开始后第9天)的小鼠的体重而得到的结果示于图15的b。另外，将测定大肠的长度而得到的结果示于图15的c，及将组织学炎症评分的结果示于图15的d。其结果，与DSS组及DSS+sCA-NC-miR组相同，DSS+sCA-miR-29b组也几乎未见抑制小鼠的体重减少，未见抑制大肠的缩短，及未见组织学炎症评分降低。
另外，将针对DSS+sCA-miR-29b组对直肠进行HE染色并观察而得到的结果示于图15的e。其结果也确认到，DSS+sCA-miR-29b组的结肠的炎症几乎未得到改善。
即，从本结果确认到，miR-29b/sCA复合体即使对于炎症性肠病而局部给药，也几乎未见改善效果。
炎症性肠病专利 4篇：
炎症性肠病的治疗药
第一、技术领域
本申请涉及包含高迁移率族蛋白1(High mobility group box1，HMGB1)的片段肽的用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物。
第二、背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease;IBD)是在肠道的粘膜中发生慢性炎症和/或溃疡的难治性疾病，作为其代表例，可举出溃疡性结肠炎及克隆氏病。炎症性肠病的原因尚未完全阐明，但认为其原因是由于遗传因素和各种环境因素复杂参与而引起免疫系统的异常。但是，对于炎症性肠病，目前尚没有根治性疗法，大多反复发生缓解和复发，因此需要长期的医学管理。
作为炎症性肠病的治疗药，现使用5-氨基水杨酸制剂、皮质类固醇制剂、免疫抑制剂、生物学制剂(例如抗TNF-α抗体、抗α4β7整合素抗体)等，但存在无法获得充分效果的病例。此外，在副作用方面，也有由5-氨基水杨酸制剂引起的恶心、发热、腹痛、贫血、间质性肾炎及肝功能障碍;由皮质类固醇制剂引起的失眠、骨质疏松症、肾上腺皮质功能障碍、葡萄糖耐量异常和血压上升;以及由免疫抑制剂引起的肾功能障碍、肝功能障碍、白细胞减少及血压上升等问题，还存在改善的余地。因此，期望开发出与现有的治疗药不同类型的、更有效且安全性高的炎症性肠病的治疗药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2012/147470
专利文献2：WO2014/065347
专利文献3：WO2014/065348
第三、发明内容
发明所要解决的课题
本申请的目的在于提供一种对炎症性肠病的治疗有效的新药物。
用于解决课题的手段
本发明者们研究了对炎症性肠病的治疗有效的物质，其结果发现，具有特定的氨基酸序列的HMGB1片段肽在炎症性肠病的动物模型中显示出抑制体重减少的效果以及抑制结肠缩短和粘膜损伤的效果。因此，本申请提供一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其含有该特定的HMGB1片段肽。
即，本申请提供以下方案。
〔1〕一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其含有以下的(a)～(c)中任一项所述的物质(以下称为物质A)：
(a)包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽;
(b)包含在序列号1所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的氨基酸序列的肽;以及
(c)包含与序列号1所记载的氨基酸序列具有约80%以上的序列同源性的氨基酸序列的肽。
〔2〕根据〔1〕所述的药物组合物，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔3〕根据〔2〕所述的药物组合物，其中，非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
〔4〕根据〔2〕所述的药物组合物，其中，非特异性炎症性肠病是克隆氏病。
〔5〕一种用于在炎症性肠病的患者中抑制体重减少或肠道粘膜损伤的药物组合物，其含有物质A。
〔6〕根据〔5〕所述的药物组合物，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔A1〕一种预防和/或治疗炎症性肠病的方法，其包含将物质A的有效量给药至对象的工序。
〔A2〕根据〔A1〕所述的方法，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔A3〕根据〔A2〕所述的方法，其中，非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
〔A4〕根据〔A2〕所述的方法，其中，非特异性炎症性肠病是克隆氏病。
〔A5〕一种在炎症性肠病的患者中抑制体重减少或肠道粘膜损伤的方法，其包含将物质A的有效量给药至所述患者的工序。
〔A6〕根据〔A5〕所述的方法，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔B1〕一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的物质A。
〔B2〕根据〔B1〕所述的物质A，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔B3〕根据〔B2〕所述的物质A，其中，非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
〔B4〕根据〔B2〕所述的物质A，其中，非特异性炎症性肠病是克隆氏病。
〔B5〕一种用于在炎症性肠病的患者中抑制体重减少或肠道粘膜损伤的物质A。
〔B6〕根据〔B5〕所述的物质A，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔C1〕物质A在用于制造预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的用途。
〔C2〕根据〔C1〕所述的用途，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
〔C3〕根据〔C2〕所述的用途，其中，非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
〔C4〕根据〔C2〕所述的用途，其中，非特异性炎症性肠病是克隆氏病。
〔C5〕物质A在用于制造在炎症性肠病的患者中抑制体重减少或肠道粘膜损伤的药物中的用途。
〔C6〕根据〔C5〕所述的用途，其中，炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。
第四、附图说明
图1是表示小鼠的体重变化的图表(***p<0.001、****p<0.0001)。图表中，“水”表示正常小鼠，“DSS+生理盐水”表示对照组，“DSS+1-44”表示HMGB1肽(1-44)给药组。横轴中，天数是葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium;DSS)水溶液的饮水开始后的天数，三角标记表示对照组及HMGB1肽(1-44)给药组的给药日。
图2是从DSS水溶液的饮水开始后第9天的小鼠摘出的结肠的照片和表示结肠长度的图表(*p<0.05，**p<0.01)。
图3是表示DSS水溶液的饮水开始后第9天的结肠中的炎症性细胞因子的表达量的图表(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001)。
图4是表示小鼠的体重变化的图表(****p<0.0001)。图表中，“水”表示正常小鼠，“DSS+生理盐水”表示对照组，“DSS+1-44”表示HMGB1肽(1-44)给药组。横轴中，天数表示DSS水溶液的饮水开始后的天数，三角标记表示对照组及HMGB1肽(1-44)给药组的给药日。
图5是从DSS水溶液的饮水开始后第10天的小鼠摘出的结肠的照片和表示结肠长度的图表(*p<0.05、**p<0.01)。
图6是表示DSS水溶液的饮水开始后第10天的结肠组织的HE染色结果的图像。
图7是表示小鼠的体重变化的图表(****p<0.0001)。图表中，“水”表示正常小鼠，“DSS+PI5生理盐水”表示对照组，“DSS+PI5 1-44”表示HMGB1肽(1-44)给药组。横轴中，天数表示DSS水溶液的饮水开始后的天数。
图8是从DSS水溶液的饮水开始后第10天的小鼠摘出的结肠的照片和表示结肠长度的图表(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。
图9是表示小鼠的体重变化的图表(****p<0.0001)。图表中，“水”表示正常小鼠，“DSS+PBS”表示对照组，“DSS+MSCs”表示MSC给药组。横轴中，天数表示DSS水溶液的饮水开始后的天数，三角标记表示对照组及MSC给药组的给药日。
第五、具体实施方式
本申请提供一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物，其含有包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽。
本申请的炎症性肠病(以下也称为IBD)中包括原因不明的疾病(非特异性炎症性肠病)和与原因的关系明确的疾病(特异性炎症性肠病)。作为非特异性炎症性肠病，可举出溃疡性结肠炎、克隆氏病及肠型白塞病(intestinal Behcet disease)，但并不限定于这些。作为特异性炎症性肠病，可举出感染性肠炎、药剂性肠炎、缺血性肠炎、肠结核等，但并不限定于这些。在一个方式中，本申请的炎症性肠病是非特异性炎症性肠病。在进一步的方式中，本申请的非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎或克隆氏病。在另一方式中，本申请的非特异性炎症性肠病是溃疡性结肠炎。在又一方式中，本申请的非特异性炎症性肠病是克隆氏病。
溃疡性结肠炎是指在结肠粘膜上发生糜烂或溃疡的原因不明的炎症性疾病。作为主要症状，呈现出血便、粘血便、腹泻或血性腹泻、腹痛等症状，多伴有发热或体重减少。
克隆氏病是指在消化道发生伴有溃疡或纤维化的肉芽肿性炎症性病变的原因不明的慢性炎症性疾病。作为主要症状，除了呈现腹痛、腹泻、体重减少、发热等之外，有时也会发生瘘、狭窄等肠道并发症、或贫血、关节炎、虹膜炎、结节性红斑、肛门部病变等肠道外并发症。
本申请中，“药物组合物”这一用语与“药物”、“药剂”或“药学组合物”互换使用。
另外，本发明提供一种用于在炎症性肠病的患者中抑制体重减少或肠道粘膜损伤的药物组合物，其含有包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽。在一个方式中，本申请的药物组合物用于在炎症性肠病的患者中抑制结肠的粘膜损伤。
本申请中，包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽是指由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，即是指包含序列号1所记载的氨基酸序列的肽。这样的肽可以通过将编码该肽的DNA整合到适当的表达系统中而作为基因重组体(recombinant)得到，或者也可以人工合成。
本申请中，作为HMGB1蛋白，可例示出包含序列号2所记载的氨基酸序列的蛋白、以及由包含序列号3所记载的碱基序列的DNA编码的蛋白，但并不限定于这些。
作为本申请的包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽，可例示出由序列号1所记载的氨基酸序列构成的HMGB1片段肽，但并不限定于此。
本申请的药物组合物中，代替包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽，还可以使用或与其一起使用包含在序列号1所记载的氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基被改变(替换、缺失、插入或添加)而成的氨基酸序列的肽，即与包含序列号1所记载的氨基酸序列的HMGB1片段肽在功能上同等的肽。作为所述肽的例子，可例示出以下的肽，但并不限定于这些：
i)包含在序列号1所记载的氨基酸序列中1个或多个(例如1个～10个、1个～9个、1个～8个、1个～7个、1个～6个、1个～5个、1个～4个、1个～3个、或者1个或2个)氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的氨基酸序列的肽;
ii)由在序列号1所记载的氨基酸序列中1个或多个(例如1个～10个、1个～9个、1个～8个、1个～7个、1个～6个、1个～5个、1个～4个、1个～3个、或者1个或2个)氨基酸被替换、缺失、插入或添加而成的氨基酸序列构成的肽;
iii)包含与序列号1所记载的氨基酸序列具有约80%以上、例如约85%以上、约90%以上、约91%以上、约92%以上、约93%以上、约94%以上、约95%以上、约96%以上、约97%以上、约98%以上或约99%以上的序列同源性的氨基酸序列的肽;
iv)由与序列号1所记载的氨基酸序列具有约80%以上、例如约85%以上、约90%以上、约91%以上、约92%以上、约93%以上、约94%以上、约95%以上、约96%以上、约97%以上、约98%以上或约99%以上的序列同源性的氨基酸序列构成的肽。
本申请中的肽或含有其的药物组合物(以下称为肽等)的有效量以治疗或预防本说明书中记载的疾病或症状为目的而被给药至对象。
本申请中的有效量是指治疗或预防本说明书中记载的疾病或症状所需的足够的量。本申请中的治疗包括减轻、延迟、阻止、改善、缓解、治愈、根治等，但并不限定于这些。另外，本申请中的预防包括减轻、延迟、阻止等，但并不限定于这些。
作为本申请中的对象，没有特别限制，可举出哺乳类、鸟类、鱼类等。作为哺乳类，可举出人或非人动物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠、马、羊、鲸等，但并不限定于这些。本申请中，“对象”这一用语与“患者”、“个体”以及“动物”互换使用。
本申请的肽等的给药部位没有限制，即使是向出现炎症性肠病的症状的部位或其附近、与这些不同的部位(除这些以外的部位)、与出现炎症性肠病的症状的部位分开的部位、位于出现炎症性肠病的症状的部位的远离处的部位、或相对于出现炎症性肠病的症状的部位为远离处且不同处的部位等任意部位给药，本申请的肽等也能够发挥其效果。
另外，本申请的肽等即使是向与出现炎症性肠病的症状的组织(例如消化道)不同的组织、与出现炎症性肠病的症状的组织分开的组织、位于出现炎症性肠病的症状的组织的远离处的组织、或相对于出现炎症性肠病的症状的组织为远离处且不同处的组织等任意组织给药，也能够发挥其效果。
作为本申请的肽等的给药方法，可举出经口给药或非经口给药，作为非经口给药方法，可举出血管内给药(动脉内给药、静脉内给药等)、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等，但不限定于这些。另外，可以通过将本申请的肽等注射给药、例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等向全身或局部(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或者眼睑结膜、鼻腔粘膜、口腔内以及消化道粘膜、阴道-子宫内粘膜、或损伤部位等)给药。
另外，代替本申请的肽等，还可以使用分泌本申请的肽的细胞、插入有编码该肽的DNA的基因治疗用载体、以及含有它们的药物组合物。
另外，可以根据患者的年龄、症状适当地选择给药方法。在给药本申请的肽的情况下，例如对于一次给药，每1kg体重可以在0.0000001mg至1000mg的范围内选择给药量。或者，例如可以每位患者在0.00001～100000mg/body的范围内选择给药量。在给药分泌本申请的肽的细胞或插入有编码该肽的DNA的基因治疗用载体的情况下，也可以按照该肽的量达到上述范围内的方式进行给药。但是，本申请中的药物组合物并不限定于这些给药量。
本申请的药物组合物可以按照常规方法进行制剂化(例如Remington'sPharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，可以一起含有药物上可容许的载体、添加物。例如表面活性剂、赋形剂、着色剂、着香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限定于这些，其他常用的载体也可以适当使用。具体而言，可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
需要说明的是，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参照引入本说明书中。
本发明通过下述实施例进一步进行例示，但本发明并不限定于这些。
实施例
实施例1
HMGB1片段肽对炎症性肠病的有效性的评价(1)
(1)材料和方法
i)药剂制备
将葡聚糖硫酸钠(DSS)(分子量为5000～6000、Nacalai Tesque公司制、商品目录编号为10930-94)溶解在水中，制备3%(w/v)的DSS水溶液。另外，通过固相法化学合成由来自人的HMGB1蛋白的氨基酸残基1-44(序列号1)构成的肽。以下，将该HMGB1片段肽称为HMGB1肽(1-44)，在与实施例对应的附图中省略地记为“1-44”。
ii)炎症性肠病(IBD)小鼠模型的制作
代替精制水(RO水)，通过使C57BL/6小鼠(8～10周龄、雄性、体重为约20g)自由饮用3%DSS水溶液来诱发结肠炎(DSS水溶液的饮水持续至结肠摘出时为止)。另外，使用自由饮用精制水(RO水)的小鼠(以下称为“正常小鼠”)作为比较对象。
iii)肽的给药
将如上制作的IBD小鼠模型分成HMGB1肽(1-44)给药组(n=3)和对照组(n=3)。受试物质的给药通过如下来进行：在DSS水溶液的饮水开始后第6天和第7天，以200μL/只的量(以肽的给药量计为5mg/kg)向静脉注入以生理盐水为溶剂调整为0.5mg/mL的浓度的HMGB1肽(1-44)溶液。对照组在DSS水溶液的饮水开始后第6天和第7天，以200μL/只的量向静脉注入生理盐水。不对正常小鼠(n=3)进行物质的给药。另外，下文中，将“DSS水溶液的饮水开始后第X天”省略地记为“DSS饮水第X天”。
iv)肽给药带来的效果的评价
从DSS水溶液的饮水开始至结肠摘出时为止，每天测定小鼠的体重。在DSS饮水第9天从小鼠摘出结肠，测定结肠长度。从摘出的结肠中靠近肛门的末端部分提取mRNA，通过定量PCR分析炎症性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达量。
(2)结果
i)体重变化
将试验期间中的小鼠的体重变化示于图1(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。对照组的IBD小鼠模型的体重随着天数的经过而减少，DSS饮水第9天时与正常小鼠相比显著地变小。与此相对，在HMGB1肽(1-44)给药组中，暂时减少的体重在肽给药后恢复，在DSS饮水第9天时与对照组相比显著地变大。
ii)结肠长度
如图2所示，在对照组的IBD小鼠模型的结肠长度与正常小鼠相比显著性地变短的条件下，HMGB1肽(1-44)给药组的结肠长度与对照组相比显著性地长(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。该结果表明，作为IBD模型的DSS诱发肠炎中的结肠的缩短通过给药HMGB1肽(1-44)而被抑制。
iii)炎症性细胞因子
将DSS饮水第9天的结肠中的炎症性细胞因子的表达量示于图3(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。在对照组的IBD小鼠模型中，TNF-α、IL-1β和IL-6与正常小鼠相比显著地高。另一方面，HMGB1肽(1-44)给药组中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达与对照组相比显著性地低。该结果表明，作为IBD模型的DSS诱发肠炎中的炎症性细胞因子的表达通过给药HMGB1肽(1-44)而被抑制。
实施例2
HMGB1片段肽对炎症性肠病的有效性的评价(2)
(1)材料和方法
i)药剂及小鼠
DSS水溶液和HMGB1肽(1-44)的制备以及炎症性肠病小鼠模型的制作与实施例1相同。
ii)肽的给药
将如实施例1中记载那样制成的IBD小鼠模型分成HMGB1肽(1-44)给药组(n=3)和对照组(n=3)。受试物质的给药通过如下来进行：在DSS饮水第1、3、5和7天，以200μL/只的量(以肽的给药量计为5mg/kg)向静脉注入以生理盐水为溶剂调整为0.5mg/mL的浓度的HMGB1肽(1-44)溶液。对照组在DSS饮水第1、3、5和7天、以200μL/只的量向静脉注入生理盐水。不对正常小鼠(n=3)进行物质的给药。
iii)肽给药带来的效果的评价
从DSS水溶液的饮水开始至结肠摘出时为止，每天测定小鼠的体重。在DSS饮水第10天从小鼠摘出结肠，测定结肠长度。使用摘出的结肠中靠近肛门的末端部分制作肠道截面的组织切片，进行苏木精-伊红(HE)染色。
(2)结果
i)体重变化
将试验期间中的小鼠的体重变化示于图4(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。IBD小鼠模型(对照组和HMGB1肽(1-44)给药组)的体重随着天数的经过而减少，DSS饮水第10天时与正常小鼠相比显著地变小。在HMGB1肽(1-44)给药组中，与对照组相比，体重减少得到抑制，DSS饮水第10天的体重与对照组相比显著地大。
ii)结肠长度
如图5所示，在对照组的IBD小鼠模型的结肠长度与正常小鼠相比显著性地变短的条件下，HMGB1肽(1-44)给药组的结肠长度与对照组相比显著性地长(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。该结果表明，作为IBD模型的DSS诱发肠炎中的结肠的缩短通过给药HMGB1肽(1-44)而被抑制。
iii)粘膜组织
将DSS饮水第10天的结肠组织的HE染色图像示于图6(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+1-44”)。对照组的IBD小鼠模型中粘膜组织损伤，而HMGB1肽(1-44)给药组中粘膜组织的损伤被抑制。该结果表明，作为IBD模型的DSS诱发肠炎中的结肠粘膜组织的损伤通过给药HMGB1肽(1-44)而被抑制。
实施例3
HMGB1片段肽对炎症性肠病的有效性的评价(3)
(1)材料和方法
i)药剂及小鼠
DSS水溶液和HMGB1肽(1-44)的制备以及炎症性肠病小鼠模型的制作与实施例1相同。
ii)含肽水凝胶的制备
向切成约5mm×5mm大小的生物体吸收性水凝胶(MedGel(注册商标)PI5、株式会社MedGEL制)中滴加20μL以生理盐水为溶剂调整为5μg/μL的浓度的HMGB1肽(1-44)溶液而使其含有，将冰冷下静置30分钟后的水凝胶用于对HMGB1肽(1-44)给药组的小鼠的埋入。另外，按照与此相同的步骤，将含有生理盐水以代替HMGB1肽(1-44)溶液的水凝胶用于对对照组的小鼠的埋入。
iii)肽的给药
将如实施例1中记载那样制成的IBD小鼠模型分成HMGB1肽(1-44)给药组(n=3)和对照组(n=3)。受试物质的给药通过如下来进行：在DSS水溶液的饮水开始的1天前，将如上制备的含有HMGB1肽(1-44)溶液的水凝胶埋入到小鼠的背部。在对照组的小鼠的背部在DSS水溶液的饮水开始的1日前，埋入如上制备的含有生理盐水的水凝胶。不对正常小鼠(n=3)进行物质的给药。
iv)肽给药带来的效果的评价
从DSS水溶液的饮水开始至结肠摘出时为止，每天测定小鼠的体重。在DSS饮水第10天从小鼠摘出结肠，测定结肠长度。
(2)结果
i)体重变化
将试验期间中的小鼠的体重变化示于图7(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+PI5生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+PI5 1-44”)。IBD小鼠模型(对照组和HMGB1肽(1-44)给药组)的体重随着天数的经过而减少，DSS饮水第10天时与正常小鼠相比变小。在HMGB1肽(1-44)给药组中，与对照组相比，体重减少得到抑制，DSS饮水第10天的体重与对照组相比较大。
ii)结肠长度
如图8所示，在对照组的IBD小鼠模型的结肠长度与正常小鼠相比变短的条件下，HMGB1肽(1-44)给药组的结肠长度与对照组相比较长(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+PI5生理盐水”，HMGB1肽(1-44)给药组参照“DSS+PI5 1-44”)。该结果表明，作为IBD模型的DSS诱发肠炎中的结肠的缩短通过给药HMGB1肽(1-44)而被抑制。
比较例1
炎症性肠病模型中间充质干细胞(MSCs)的给药
近年来，尝试了将从生物体取出的间充质干细胞用于炎症性肠病的治疗。另一方面，本发明者们到目前为止，发现HMGB1肽(1-44)具有将骨髓内的间充质干细胞动员到末梢血中的作用。因此，为了比较给药间充质干细胞与给药HMGB1肽(1-44)的效果，进行了以下的实验。
(1)材料和方法
i)药剂及小鼠
DSS水溶液和HMGB1肽(1-44)的制备以及炎症性肠病小鼠模型的制作与实施例1相同。
ii)间充质干细胞的给药
将如实施例1中记载那样制成的IBD小鼠模型分成间充质干细胞(MSC)给药组(n=3)和对照组(n=3)。从C57BL/6小鼠(6～8周龄、雄性)的大腿骨采集骨髓，作为培养基使用MesenCult(商标)MSC Basal Medium(Mouse)(STEMCELL Technologies公司制、包含10nM Rockinhibitor和MesenPure)，在塑料板上进行培养，由此得到作为附着性菌落的间充质干细胞。在DSS饮水第5天，将传代3次后的上述间充质干细胞悬浮在PBS中并调整为1×106个/mL，向MSC给药组的小鼠的腹腔内给药100μL。对照组的小鼠在DSS饮水第5天，向腹腔内给药100μL的PBS。不对正常小鼠(n=3)进行物质的给药。
iii)间充质干细胞给药带来的效果的评价
至DSS水溶液的饮水开始后第9天为止，每天测定小鼠的体重。
(2)结果
将试验期间中的小鼠的体重变化示于图9(正常小鼠参照“水”，对照组参照“DSS+PBS”，MSC给药组参照“DSS+MSCs”)。IBD小鼠模型(对照组和MSC给药组)的体重随着天数的经过而减少。在MSC给药组与对照组之间，体重变化没有差异，未观察到由MSC给药带来的改善效果。
在本比较例的条件下，给药间充质干细胞并没有抑制炎症性肠病小鼠模型的体重减少，但HMGB1肽(1-44)对于在与此相同的条件下制作的炎症性肠病小鼠模型显示出改善体重减少等症状的效果。由此可期待，对于通过给药间充质干细胞无法获得效果的炎症性肠病的患者，本申请的肽也有效。
产业上的可利用性
可期待含有本申请的肽的药物组合物会对通过现有的治疗药无法获得充分的效果的炎症性肠病的患者带来巨大的好处。
炎症性肠病专利 5篇：
脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用
第一、技术领域
本发明涉及药物领域，具体是脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
第二、背景技术
他汀类药为羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl CoA，HMG-CoA)还原酶的特异竞争性抑制剂，可减少胆固醇的生物合成，具有显著的降脂疗效，为降脂药物中的首选药物。并通过改善内皮功能、抗血小板聚集、抑制动脉粥样硬化等作用降低心血管病的发病率和病死率。近年来的研究发现他汀类药尚具有抗炎和免疫调节作用，在许多风湿、类风湿性疾病及自身免疫性疾病中发挥一定疗效。
脱氢洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)为近年获得的他汀类家族的新成员，是洛伐他汀的脱氢衍生物，已获得国家发明专利授权。两药的结构式如下所示。我们前期对DLVT的急性毒性实验研究表明，其小鼠灌胃给药最大耐受量为2000mg·kg-1，相当于洛伐他汀临床上成人一天最大剂量的128倍，表明其毒性较低。前期研究表明DLVT除了具有和LVT一样的的降脂作用外还对非特异性炎症及佐剂性关节炎有作用。
洛伐他汀立体化学结构式如(1)所示：
脱氢洛伐他汀立体化学结构式如(2)所示：
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因和发病机制都尚未完全明确的非特异炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，是一种遗传因素、环境因素和免疫因素共同参与的肠道持续性炎症疾病。近年来，在世界范围内，IBD的发病率和死亡率逐年上升。该病病理变化复杂，临床症状多样，若未及时得到缓解及治愈，引发为癌变的可能性极大。因此，被世界卫生组织列为现代难治疾病之一。常用的治疗药物有氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和一些中药，但至今尚无理想的药物，开发标本兼治、安全有效的药物有着重要的实际价值。
IBD病因尚未完全阐明，主要是侵及肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，以连续方式逐渐进展可能与免疫异常、肠道菌群失调、遗传及精神状态等多种因素有关。目前认为肠黏膜免疫功能失调，促炎性细胞因子分泌增多，导致炎症级联放大反应是其主要的发病机制。
第三、发明内容
本发明的目的在于提供脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
作为本发明进一步的方案：脱氢洛伐他汀的立体化学结构式如下所示：
作为本发明进一步的方案：脱氢洛伐他汀用于4%DSS诱导小鼠炎症性肠病的有效剂量为33.6mg·kg-1·d-1。
作为本发明进一步的方案：所述抗炎症性肠病中促炎因子包括TNF-α、IL-6与IL-17，抗炎因子为IL-10。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过建立小鼠急性炎症性肠病模型、观察脱氢洛伐他汀对抗炎症性肠病的治疗作用等试验，探讨脱氢洛伐他汀对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠抗炎症性肠病的防治作用及作用机制，首次揭示脱氢洛伐他汀对IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α及NF-κB的影响。脱氢洛伐他汀通过抑制NF-κB信号通路，对TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而可以提高抗炎因子IL-10的水平而发挥抗炎症性肠病的作用，脱氢洛伐他汀治疗炎症性肠病具有标本兼治、安全有效的功效。
第四、附图说明
图1模型组和空白组小鼠体重的变化;
图2 4%DSS诱导小鼠炎症性肠病活动指数;
图3 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠疾病活动指数的影响。
图4 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织病理学影响(HE×100)图，(a)正常对照，(b)模型对照，(c)SASP，(d)DLVT，(e)LVT;
图5 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织NF-κB表达的影响(SP×200)图，(a)空白对照组，(b)模型对照，(c)SASP，(d)DLVT，(e)LVT。
第五、具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、实验性抗炎症性肠病动物模型的建立
1材料和方法
1.1实验动物：
清洁级昆明小鼠(雄性)，体重22-25克，由重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂和药品：
葡聚糖硫酸钠盐(Dextran sulfate sodium salt，DSS，MW：36000-50000)(美国MP Biomedicals)
大便隐血试剂盒(南京建成生物工程研究所)
1.3主要仪器：
电子天平
A2000S型电子分析天平(德国Sartorius)
Sigma-3k低温离心机(美国Sigma)
-80℃超低温冰箱(德国)
UV-225紫外-可见分光光度计(日本)
BH-2型光学显微镜(日本Olympus)
1.4溶液的配制：
0.5%的羧甲基纤维素钠：
4%DSS水溶液的配制：称取40gDSS溶解于双蒸水，并定容到1000ml。
4%的中性甲醛(10%中性福尔马林)溶液的配制：甲醛(40%)100ml，无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠4.0g，蒸馏水900ml。
2方法
2.1小鼠炎症性肠病动物模型的建立：
小鼠随机分组，适应性喂养7天，第8天自由饮用4%DSS水溶液，连续7d。在这期间，每天定时称量小鼠体重，进行隐血试验和观察粪便性状。结肠组织取样：第8天，颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹腔，清理出结肠，剪下距离肛门处1cm剪下结肠2cm(直肠至升结肠)，测量长度。冰冷生理盐水反复冲洗干净，用清洁滤纸吸干水分。然后将结肠样本剪为两段：直肠端段(约1cm)置入4℃4%甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，切片，切片厚约6μm，HE染色。余下部分编号，称重，用铝箔包好，立即放入液氮(-196℃)中速冻，转入低温冰箱(-80℃)存放。
2.2观察指标:
2.2.1临床症状观察评分/疾病活动指数，评分标准(表1)。
表1DAI评分标准
2.2.2形态学观测
光镜下观察各组标本切片，每组15个视野(×100，×200)进行组织学损伤评分，求其平均值，评分标准见表2。
表2组织学损伤评分标准
光镜下结肠黏膜特征评分正常0隐窝腺体丢失1/31隐窝腺体丢失2/32隐窝腺体全部丢失，上皮存在，伴有炎性细胞浸润。3黏膜上皮糜烂，破坏，伴有明显炎性细胞浸润。4
2.2.3结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
取结肠组织块在冰冷生理盐水中漂洗干净，干净滤纸吸干，准确称重后，立即用眼科剪子剪碎，置于冰浴的玻璃匀浆器中，加入0.86%生理盐水后匀浆，按重量体积比为1：9加匀浆介质制备成10%的组织匀浆。参照试剂盒方法测定结肠组织匀浆中MPO的活性。
3统计学处理
实验数据用SPSS12.0统计软件处理，各组资料用((x±s)表示，采用单因素方差分析和非参数Wilcox on秩和检验，比较各组资料间的差异，P<0.05为差异有显著性。
4结果
4.1小鼠体重变化
模型组和空白组小鼠体重的变化见图1模型组和空白组小鼠体重的变化。可看出空白对照组小鼠体重增加比较平稳，而模型组小鼠从造模后第三天开始，小鼠体重不仅不增加反而呈下降趋势。
4.24%DSS诱导小鼠炎症性肠病的临床症状
小鼠临床症状观察发现：正常对照组小鼠活动、毛色、大小便、生长均正常。模型组小鼠，在饮用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳性，6-7d呈强阳性，甚至血便;同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发生，与人类IBD临床症状表现相似，表明4%DSS诱导小鼠炎症性肠病模型成功。如图2所示，4%DSS模型组小鼠，3d后DAI开始出现持续显著增高。模型小鼠明显瘦弱，肛门周围毛色散乱，有血样大便的痕迹。
4.34%DSS诱导的小鼠炎症性肠病病理形态学改变
如附图3(b)所示，光镜下观察DSS模型组小鼠结肠上皮黏膜损伤明显：黏膜上皮糜烂，腺体隐窝结构破坏;杯状细胞丢失，伴有中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等大量炎性细胞浸润。正常对照组黏膜上皮完整，隐窝结构、杯状细胞正常，见图3(a)所示。
4.44%DSS诱导的小鼠结肠组织中MPO活性
模型组的MPO明显升高，与正常组相比有显著差异，见表3：4%DSS诱导的炎症性肠病小鼠MPO的活性。
表34%DSS诱导的炎症性肠病小鼠MPO的活性
GroupnMPO(U/g)normal100.92±0.22model102.19±0.42**
**P<0.01是与normal组比较。
5讨论
据已有文献报道，DSS可诱导炎症性肠病。一种为急性期炎症性肠病模型，方法为5%DSS水溶液给小鼠自由饮用，连续7天，国内外也有文献报道用3-5%DSS诱导结肠炎的;我们在预实验的时候，曾尝试对该造模方式加以改进：采用给小鼠5%DSS溶液灌胃(0.8ml/只，bid×4d)，但实验动物并没有出现任何临床症状，提示出现这种情况有两种可能：一是DSS摄入的量不够，二是这种造模给药方式，不能在肠腔内维持一定的浓度，产生对上皮组织的毒性作用。所以，我们基于对预实验的观察，以及相关文献的报道，认为采用灌胃这种方式给予小鼠DSS溶液诱导肠炎是不太可能的，因为即使增加DSS溶液的浓度，采取0.8ml/只，每天3次的给药方式，每天摄入的溶液体积也只有2.4ml，而正常小鼠一般饮水3-6ml/天。因此，我们根据预实验的情况和相关的文献报道，让小鼠自由饮用4%DSS溶液，连续7d造模，诱导实验性肠炎;通过观察小鼠临床症状，肠黏膜损伤以及炎性细胞浸润情况，以疾病活动指数(disease activity index,DAI)，结肠组织病理学评分和MPO活性评估4%DSS诱导的小鼠IBD模型是否成功。MPO是主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的一种酶，其活性反映了中性粒细胞的浸润数目和活性，已被公认为评价组织炎症严重程度的一个指标。
预实验让小鼠自由饮用5%DSS溶液，第3天临床症状开始出现，如稀便、血便，第4天开始陆续有小鼠死亡，说明5%DSS浓度太高。前期研究用3.5%DSS溶液效果不明显。
实验结果显示，模型组小鼠饮用4%DSS溶液3d，开始有粪便出现隐血阳性;4-5d，小鼠出现活动度明显减少、体毛凌乱;大便松软、稠状;体重减轻，粪便隐血阳性程度增强;6-7d，可见肉眼血便，有腹泻发生，小鼠活动、进食及体重明显减少。光镜下观察结肠病理切片显示，结肠黏膜上皮糜烂，几乎全部隐窝结构被破坏，杯状细胞丢失，部分病灶表面仅少许上皮残留。炎症主要累及黏膜和黏膜下层，少数可达浆膜层;模型组小鼠结肠组织MPO活性较正常小鼠显著增高，浸润的炎性细胞以中性粒细胞为主，伴有单核巨噬细胞，少量淋巴细胞，单核细胞。在一些病变较轻的部位，可见到部分隐窝破坏、变形，排列紊乱，杯状细胞减少。模型组MPO的活性明显增加。
以上提示我们用4%DSS诱导小鼠结肠炎是可靠的，模型是成功的。
二、脱氢洛伐他汀对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠实验性炎性肠病的防治作用研究
1实验材料
1.1实验动物：
雄性昆明小鼠，体重22-25克，由重庆医科大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂和药品：
葡聚糖硫酸钠(美国MP公司)
柳氮磺吡啶肠溶片(上海福达制药有限公司批准文号:国药准字H31020840)
大便隐血试剂盒(南京建成生物工程研究所)
髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)
脱氢洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)，由重庆大新药业股份有限公司提供，外观呈乳白色蓬松状粗粉末，微溶于水。批号：201401001。洛伐他汀(lovastatin，LVT)，由重庆大新药业股份提供。批号：201401001。
IL-6、IL-10、IL-17、TNF-αELISA试剂盒R&D公司
1.3主要仪器：
电子天平
A2000S型电子分析天平
XiangYiH165-W离心机
-80℃超低温冰箱(德国)
Rayto RT-6500酶标分析仪
BH-2型光学显微镜(日本Olympus)
2方法
2.1实验动物分组：
将50只昆明小鼠，雄性，随机分为5组，即正常对照组(normal)、炎症性肠病模型组(model)、阳性药物(SASP，250mg·kg-1·d-1)、脱氢洛伐他汀(DLVT，33.6mg·kg-1·d-1)和洛伐他汀(LVT，33.6mg·kg-1·d-1)，每组各10只。各药物处理组小鼠灌胃相应药物，正常组和模型组给予等体积0.5%的羧甲基纤维素钠，每日1次，连续给药10d，第三天开始，除正常对照组以外，其余各组自由饮用4%DSS水溶液，每天更换一次，直到实验结束，见表4动物分组及给药方案。
表4动物分组及给药方案
2.2小鼠炎症性肠病的评价
小鼠临床症状观察发现：正常对照组小鼠活动、毛色、大小便、生长均正常。模型组小鼠，在饮用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳性，6-7d呈强阳性，甚至血便;同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发生，与人类IBD临床症状表现相似，表明4%DSS诱导小鼠IBD模型成功。4%DSS模型组小鼠，3d后DAI开始出现持续显著增高。模型小鼠明显瘦弱，肛门周围毛色散乱，有血样大便的痕迹。
2.3小鼠血清中细胞因子的检测
给药第10天，摘除眼球取血。离心取血清，按照ELISA(双抗体两步夹心酶联免疫吸附法)试剂盒说明书操作，分别检测小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α水平。
具体操作如下：
(1)准备：标准品稀释和配制生物素抗体工作液和酶结合物工作液。将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1：20)，加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中(浓度为10ng/ml)，再配成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml浓度。
(2)取出冷冻血清解冻，12000×g，3min。从IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α试剂盒取出所需板条，除空白孔外，分别将标本和不同浓度标准品(100μl/孔)加入相应孔中，用封板封住反应孔，37℃孵育90min。
(3)洗板：甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μl，静置30sec，在厚迭吸水纸上拍干，洗板5次。
(4)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵育60min。
(5)洗板4次。
(6)除空白孔外，加入酶结合工作液(100μl/孔)，用封板胶封住反应孔，37℃孵育30min。
(7)洗板4次。
(8)加入显色剂100μl/孔，避光37℃孵育10-20min。
(9)加入终止液100μl/孔，混匀后在450nm波长处测量OD值。
2.4小鼠结肠组织病理形态学观察及小鼠结肠组织MPO活性检测
结肠组织块在冰冷生理盐水中漂洗干净，干净滤纸吸干，准确称重后，立即用眼科剪子剪碎，置于冰浴的玻璃匀浆器中，加入0.86%生理盐水后匀浆，按重量体积比为1：9加匀浆介质制备成10%的组织匀浆。参照试剂盒方法测定结肠组织匀浆中MPO的活性。
2.5小鼠结肠组织病理检查
结肠组织10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋切片制作的标本，苏木精—伊红(HE)染色，光镜下观察组织病理学变化。
2.6NF-κB免疫组化染色
将石蜡标本作结肠横截面连续切片，贴附于经多聚氨酸处理过的载玻片上，置入60℃烘箱过夜。待样品收齐后，采用免疫组化SP法染色。具体操作步骤下：
(1)石蜡切片常规脱蜡至水：50℃左右二甲苯Ⅰ30min，二甲苯Ⅱ30min，100%、95%、85%、70%酒精、蒸馏水各5min，再在蒸馏水中浸泡5min。
(2)3%H2O2室温孵育10min。(以消除内源性过氧化物酶的活性，3%H2O2临时配制。)
(3)蒸馏水洗2min×3，PBS浸泡5min。
(4)抗原修复：采用热修复法。将切片置于盛有抗原修复液(0.01M枸橼酸缓冲液pH6.0)的玻璃容器中，放在电炉上加热，控制溶液温度维持在92℃-98℃之间，持续10-15min。停止加热后，自然冷却至室温(约需20-30min，勿将切片从缓冲液中取出)，PBS洗5min×3。
(5)滴加正常小鼠封闭血清工作液(试剂1)，室温孵育20min，倾去，勿洗。
(6)分别滴加一抗NF-κB(1：100稀释)，4℃过夜。阴性对照组加PBS缓冲液作阴性对照。
(7)PBS冲洗5min×3。
(8)滴加生物素化二抗工作液：生物素标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min。
(9)PBS冲洗5min×3。
(10)滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液(试剂3)，37℃孵育20min。
(11)PBS冲洗5min×3。
(12)DAB显色剂显色(用法：取1ml双蒸水，试剂盒中A、B、C试剂各加1滴，混均后滴加至切片。显色剂应避光保存，即用即配)，自来水洗3min。
(13)苏木素复染30秒(复染时间根据染色情况而定)，自来水洗3min。
(14)浸入分化液3-4秒，自来水充分冲洗，60℃烘箱烤干。
(15)中性树胶封片。
2.7免疫组化染色切片NF-κB蛋白表达的半定量分析
显微镜下观察结肠组织各层的表达情况并摄影记录。阳性标准：NF-κB以胞质或胞核部分被染成棕黄(褐)色为阳性;阴性对照：采用PBS缓冲液代替一抗，其余步骤完全相同。采用GD-8型病理影像多媒体分析系统对各组免疫组化的切片随机采集，每组至少有3个以上的动物组织切片，选取10个高倍视野(200×10)，测定面积积分光密度值(Area integral optical density，AIOD)显示被检测指标的染色强度，即表达量。
3统计学处理
实验数据用SPSS12.0在统计软件处理，各组资料用(x±s)表示，采用单因素方差分析，比较各组资料间的差异，P<0.05为差异有显著性。
4结果
4.1DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠体重的变化
模型组小鼠从饮用4%DSS第3天起，与空白组小鼠相比，体重明显下降;其余各给药组小鼠体重的下降趋势均不及模型组。
4.2DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠临床症状的影响
小鼠临床症状观察发现：正常对照组小鼠行为活跃，生长正常。模型组小鼠，在饮用4%DSS溶液2d后，部分小鼠粪便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳性，6-7d呈强阳性，甚至血便;同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发生，与人类IBD临床症状表现相似，表明4%DSS诱导小鼠IBD模型成功。如图3所示，DSS模型组小鼠，3d后DAI开始出现持续显著增高;SASP阻遏DAI增高，DLVT和LVT有相似的明显改善DSS诱导的IBD小鼠临床症状的作用。
4.3DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织病理形态学的影响
光镜下观察DSS模型组小鼠结肠上皮黏膜损伤明显，黏膜上皮糜烂，腺体隐窝结构破坏;杯状细胞丢失，伴有中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等大量炎性细胞浸润，见图4(b)。SASP、DLVT和LVT组结肠黏膜损伤明显减轻，上皮结构较完整，腺体隐窝排列较整齐，炎性细胞浸润减少，分别见图4(c)、图4(d)、图4(e)。光镜下观察各组标本切片，每组15个视野(×100，×200)按照“表2组织学损伤评分标准”，进行组织学损伤评分，求其平均值，评分结果见表5：DLVT和LVT对4%DSS诱导小鼠结肠组织病理形态学的影响。
表5DLVT和LVT对4%DSS诱导小鼠结肠组织病理形态学的影响
**P<0.01是与normal组比较;##P<0.01是与model组比较。
4.4DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α等细胞因子影响
如表6所示，模型组小鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α含量均显著高于正常对照组(p<0.01)，其余各给药组小鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α含量均显著低于模型组。模型组小鼠血清IL-10的含量显著低于正常对照组，其余各给药组IL-10的含量显著高于模型组。
表6DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-α的含量的影响(n=10)
**p<0.01是与Normal组比较;##p<0.01是与model组比较。
DLVT和LVT对TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而可以提高抗炎因子IL-10的水平。
4.5DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织中MPO的活性
小鼠结肠组织MPO活性检测结果见表7。可见DSS诱导小鼠结肠组织上皮和固有层中中性粒细胞浸润显著增多，MPO活性2.19±0.42U/g，较正常对照组0.92±0.22U/g明显增高。SASP明显抑制中性粒细胞的浸润和MPO增高(P<0.01)。DLVT(33.6mg/kg)和LVT(33.6mg/kg)亦明显抑制MPO活性(P<0.01)。
表7DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织MPO活性的影响
**P<0.01与normal组比较;##P<0.01与model组比较。
4.6NF-κB免疫组化染色
小鼠结肠组织免疫组化染色显示，正常对照组结肠组织中NF-κB几乎没有表达，见图5(a)，而DSS诱导模型组小鼠结肠组织中表达NF-κB的阳性细胞数明显增多，见图5(b)，呈棕黄色。SASP组、DLVT组、LVT组小鼠结肠组织中NF-κB阳性细胞不仅数量和模型组相比明显减少，分别见图5(c)、图5(d)、图5(e)。
4.7免疫组化染色切片NF-κB蛋白表达的半定量分析
显微镜下观察结肠组织各层的表达情况并摄影记录。采用GD-8型病理影像多媒体分析系统对各组免疫组化的切片随机采集，每组至少有3个以上的动物组织切片，选取10个高倍视野(200×10)，测定面积积分光密度值(Area integral optical density，AIOD)显示被检测指标的染色强度，即表达量。分析结果见表8DLVT和SASP对4%DSS诱导小鼠结肠组织NF-κB表达的影响。
表8DLVT和LVT对4%DSS诱导小鼠结肠组织NF-κB表达的影响
GroupNF-κB(AIOD)nromal0.000±0.000model0.282±0.061**SASP(250mg/kg)0.181±0.026##DLVT(33.6mg/kg)0.187±0.028#LVT(33.6mg/kg)0.185±0.022##
**P<0.01是与normal组比较;##P<0.01与#P<0.05是与model组比较。
综上所述，4%的DSS诱导的急性结肠炎小鼠DAI显著增加、结肠组织出现明显的炎症损伤且组织中MPO活力显著增加，血清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-17的浓度显著增加而抗炎因子IL-10的浓度显著降低，结肠组织中NF-κB表达也显著增加。经脱氢洛伐他汀和洛伐他汀治疗后可显著缓解DSS炎症性肠病小鼠的DAI、改善结肠的组织学损伤、降低结肠组织中MPO活性，对TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而可以提高抗炎因子IL-10的水平，还NF-κB信号通路发挥抗炎症性肠病的作用。
三、讨论
近年的基础和临床研究发现，他汀类药物抑制类异戊二烯(isoprenoid)中间体如异戊二烯焦磷酸法尼酯(farnesylpyrophosphate，FPP)和类异戊二烯四异戊二烯焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate，GGPP)合成，进而抑制细胞内类异戊二烯依赖的蛋白，发挥抗心血管重构、抗肿瘤、预防痴呆、抗炎和免疫调节等多种作用，因而对身患代谢性疾病兼有风湿、类风湿性关节炎和炎症性肠病具有良好临床疗效。
在炎症性肠病整个病理过程中都有细胞因子参与，它们构成了一个细胞因子网络，可以互相调控其产生，其中TNF-α、IL-6、IL-17等为促炎因子，而IL-10则为抗炎因子。NF-κB是一类具有多向活性的转录调控因子，参与多种基因的表达和调控，在炎症及免疫反应、细胞增殖、凋亡和感染等方面起着重要的作用。NF-κB/IκB复合物可被细胞因子(TNF-α，IL-1β)、氧化剂、病毒抗原等多种因素激活，NF-κB移位进入胞核，启动相关基因转录。
本发明中涉及到的英文缩写的具体名称如表9所示。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
