海洋生物来源天然硫酸多糖在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种海洋生物来源天然硫酸多糖在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用。
背景技术
世界卫生组织将严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的疾病命名为新冠肺炎(COVID-19)，2020年1月30日世界卫生组织宣布其为国际突发公共卫生事件。COVID-19在世界范围内快速蔓延，给人类健康和社会公共卫生安全产生了极大的威胁。但目前尚无针对该病毒的特效药，临床上主要以支持治疗和改善症状的对症治疗为主，抗SARS-CoV-2药物的研发刻不容缓。全球范围内针对新冠病毒已开展了大量的药物筛选实验，但仍未发现具有良好治疗效果的药物。
SARS-CoV-2是一种具有包膜结构的RNA病毒。病毒颗粒脂质膜上的刺突糖蛋白,负责与宿主受体的粘附。脂质膜内的病毒基因组RNA可编码复制酶多聚蛋白，这些多聚蛋白可被类3C蛋白酶(3CLpro，也称主蛋白酶Mpro)和类木瓜蛋白酶(PLpro)切割，产生功能性多肽，如RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和解旋酶(Hel)，参与病毒RNA转录与复制。因此，与SARS-CoV-2侵染宿主细胞相关的刺突糖蛋白、与SARS-CoV-2转录复制相关的主蛋白酶和类木瓜蛋白酶是抗SARS-CoV-2药物研发的重要靶点。
海洋生物资源丰富，来源于海洋生物的天然糖类化合物特别是酸性糖类化合物可以与病毒带有正电荷的蛋白结合从而阻止病毒复制或侵染细胞。此外，其具有毒性低、不易引起病毒产生耐药性等优势，在抗病毒药物开发中具有广阔的前景。文献检索发现，海洋生物来源天然硫酸多糖，如褐藻来源的复杂结构岩藻聚糖硫酸酯具有抗多种流感病毒作用(公开号CN 103880975A；专利号：ZL201410132608.x)，其主链结构是由α-1,2-甘露糖(Man)和β-1,4-葡糖糖醛酸(GlcA)组成，在甘露糖C3位含有支链α-1,3-连接-硫酸化岩藻糖残基(Jiandong Wu，J Carbohy Chem，34:303-317；Wei Wang，Sci.Rep.2017,7:40760)，且最近报道了一种类似结构不同分子量(100kD和12kD)的褐藻糖胶(RPI-27及RPI-128)具有抑制COVID-COV-2冠状病毒Spike蛋白活性，该多糖含有α-1,2-甘露糖(Man)和β-1,4-葡糖糖醛酸(GlcA)主链，在甘露糖C3位含有支链的α-1,2/1,3-连接-硫酸化岩藻糖残基(PaulS.Kwon，Cell Discovery，2020，6:50)；发现裙带菜来源的褐藻糖胶(Hayashi,K.,Int.Immunopharmacol.2008,8,109)具有抗HSV活性。关于其他类型结构的岩藻糖硫酸酯在抗SARS-CoV-2方面的研究尚缺乏报道。红藻来源的卡拉胶具有广泛的抗H1N1、HSV，HPV活性(Cui Hao，Rev Med Virol.2019，29，e2043)，以及iota-卡拉胶还具有抗猪蓝耳病毒(PRRSV)活性(Chunhe Guo，Antivir Ther，2019，24(4):261-270)，但还未发现有抗新冠病毒活性。绿藻来源的硫酸鼠李聚糖具有抗儿童手足口病毒(EV71)活性(Shuyao Wang，Carbohydr Polym，2018，200:43-53)和新城疫病毒(NDV)活性(Aguilar-
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋生物来源天然硫酸多糖在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用，以特定海洋植物、海洋动物为原料，经提取分离，获得系列海洋来源天然硫酸多糖，筛选其在抑制冠状病毒，特别是新型冠状病毒(SARS-COV-2)的活性，提供用于治疗冠状病毒，尤其是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的有效药物及其组合物。
本发明的技术方案是：
一种海洋生物来源天然硫酸多糖在作为抗冠状病毒及所致疾病药物中的应用，海洋生物来源的天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备与刺突蛋白(Spike)结合的药物、制备主蛋白酶(Mpro)的抑制剂、或制备类木瓜蛋白酶(PLpro)抑制剂中的应用，所述海洋生物来源天然硫酸多糖具有如下任一结构特点，其分子量范围为3～600kDa，包括：
(1)岩藻聚糖硫酸酯(又称褐藻糖胶)，具备如下结构特征之一：(a)I型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成；(b)Ⅱ型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成；(c)Ⅲ型结构褐藻糖胶，主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，分支结构是由α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)其他类型褐藻糖胶，主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成；
(2)岩藻糖基化硫酸软骨素，其结构特征如下：主链由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的硫酸软骨素二糖重复单元，GalNAc的C4、C6或C4与C6位羟基含有硫酸酯基，且在GlcA的C3位通过α-1,3糖苷键连接硫酸化岩藻寡糖支链；
(3)硫酸半乳聚糖，其结构特征如下：由β-1,3-连接和α-1,4-连接的半乳糖(Gal)，或由β-1,3-连接与α-1,4-连接-3,6-内醚半乳糖(AnG)组成，且半乳糖的C2、C4或C6位含有不同硫酸酯基；
(4)硫酸鼠李聚糖：其结构特征如下：由鼠李糖(Rha)和葡萄糖醛酸通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由Rha和艾杜糖醛酸通过α-1,4糖苷键交替连接而成；或者由鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由α-1,2和α-1,3-鼠李糖交替连接而成；且上述结构Rha的C2和/或C3位含有硫酸酯基。
所述的I型结构褐藻糖胶中，还具有其它糖残基支链结构；Ⅱ型结构褐藻糖胶中，还具有其它糖残基支链结构。
所述的冠状病毒选自SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之一种或两种以上。
所述的天然硫酸多糖来源于海洋植物或海洋动物。
所述的天然硫酸多糖通过与冠状病毒的刺突蛋白(Spike)结合，作为抑制其侵染细胞的抑制剂，通过抑制冠状病毒主蛋白酶(Mpro)和/或木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)活性，抑制病毒的复制和扩增。
所述的天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备冠状病毒抑制剂中的应用。
所述的天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗冠状病毒感染，或预防和/或治疗与冠状病毒感染相关的疾病或症状的药物中的应用。
所述的天然硫酸多糖、药学上可接受的盐与刺突蛋白(Spike)结合的试剂盒或试剂、制备主蛋白酶(Mpro)抑制剂的试剂盒或试剂、或制备木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)抑制剂的试剂盒或试剂中的应用。
所述的天然硫酸多糖、药学上可接受的盐、和另外的一种或两种以上预防和/或治疗冠状病毒感染的活性剂，混合制成预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物。
本发明的设计思想是：
本发明提供的海洋生物来源的天然硫酸多糖不仅可以抑制冠状病毒表面的刺突蛋白(Spike)与宿主细胞结合，从而有效阻断冠状病毒感染宿主细胞，而且还能抑制冠状病毒主蛋白酶(Mpro)和类木瓜蛋白酶(PLpro)活性，进而抑制病毒的复制和扩增过程。因此，本发明提供的海洋天然硫酸多糖具有开发成抗冠状病毒及所致疾病药物的巨大潜力。
本发明的优点及有益效果是：
(1)本发明提供的海洋生物来源的天然硫酸多糖可以抑制冠状病毒表面的刺突蛋白(Spike)与宿主细胞结合，其抑制活性水平优于临床药物肝素和低分子肝素。
(2)本发明提供的海洋生物来源的天然硫酸多糖具有抑制主蛋白酶(Mpro)和类木瓜蛋白酶(PLpro)的活性，其抑制活性水平优于肝素。
(3)整体来讲，本发明提供的海洋生物来源的天然硫酸多糖的抗冠状病毒活性与优于临床药物肝素和低分子肝素，可以用作抗冠状病毒及所致疾病相关药物的制备和应用领域。
附图说明
图1岩藻聚糖硫酸酯、硫酸半乳聚糖、岩藻糖基化硫酸软骨素、硫酸鼠李聚糖和肝素对SARS-CoV-2刺突蛋白抑制活性。图中，横坐标Log Dose代表化合物浓度的对数(μM)，纵坐标Relative Luminescence代表相对发光强度(％)。
图2硫酸半乳聚糖、岩藻聚糖硫酸酯、岩藻糖基化硫酸软骨素对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制作用曲线。图中，横坐标Time代表时间(s)，纵坐标Intensity代表荧光强度，Blank代表空白对照，Iota-carrageenan代表iota-卡拉胶，FCS代表岩藻糖基化硫酸软骨素，Fucoidan代表岩藻聚糖硫酸酯。
图3岩藻聚糖硫酸酯抑制SARS-CoV-2主蛋白酶IC50测定曲线。图中，横坐标Log浓度代表浓度的对数(nM)，IC50代表半数抑制浓度。
具体实施方式
在具体实施过程中，本发明涉及海洋来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备冠状病毒抑制抑制剂中的应用，所述天然硫酸多糖具有如下任一结构：
(1)岩藻聚糖硫酸酯(又称褐藻糖胶)，包括：(a)I型褐藻糖胶，主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(b)Ⅱ型褐藻糖胶，主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(c)III型褐藻糖胶，主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，分支结构是由α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)其他类型褐藻糖胶，主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成。
(2)岩藻糖基化硫酸软骨素，其结构特征如下：主链由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的硫酸软骨素二糖重复单元，且在GlcA的C3位通过α-1,3糖苷键连接硫酸化岩藻寡糖支链。
(3)硫酸半乳聚糖，其结构特征如下：由β-1,3-连接和α-1,4-连接的半乳糖(Gal)，或由β-1,3-连接与α-1,4-连接-3,6-内醚半乳糖(AnG)组成，且半乳糖的C2、C4或C6位含有不同硫酸酯基。
(4)硫酸鼠李聚糖，其结构特征如下：由鼠李糖(Rha)和葡萄糖醛酸通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由Rha和艾杜糖醛酸通过α-1,4糖苷键交替连接而成；或者由鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由α-1,2和α-1,3-鼠李糖交替连接而成；且上述结构Rha的C2和/或C3位含有硫酸酯基。
本发明还提供了海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备与刺突蛋白(Spike)结合的药物、制备主蛋白酶(Mpro)抑制剂、或制备木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)抑制剂中的应用，所述海洋生物来源硫酸多糖具有如下任一结构：
(1)岩藻聚糖硫酸酯(又称褐藻糖胶)，包括：(a)I型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(b)Ⅱ型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(c)III型结构褐藻糖胶，主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，分支结构是由α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)其他类型褐藻糖胶，主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成。
(2)岩藻糖基化硫酸软骨素，其结构特征如下：主链由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的硫酸软骨素二糖重复单元，且在GlcA的C3位通过α-1,3糖苷键连接硫酸化岩藻糖支链。
(3)硫酸半乳聚糖，其结构特征如下：由β-1,3-连接和α-1,4-连接的半乳糖(Gal)，或由β-1，3-连接与α-1,4-连接-3,6-内醚半乳糖(AnG)组成，且半乳糖的C2、C4或C6位含有不同硫酸酯基。
(4)硫酸鼠李聚糖：其结构特征如下：由鼠李糖(Rha)和葡萄糖醛酸通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由Rha和艾杜糖醛酸(IdoA)通过α-1,4糖苷键交替连接而成；或者由鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由α-1,2和α-1,3-鼠李糖交替连接而成；且上述结构Rha的C2和/或C3位含有硫酸酯基。
如上所述的应用，优选的是冠状病毒中的刺突蛋白(Spike)、主蛋白酶(Mpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)之一种或两种以上；更优选的，所述冠状病毒选自COVID-19(SARS-CoV-2)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV之一种或两种以上。
本发明还提供了如上所述的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备冠状病毒抑制剂中的应用。
本发明还提供了如上所述的一种海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗冠状病毒感染，或预防和/或治疗与冠状病毒感染相关的疾病或症状的药物中的应用。
如上所述的用途，优选的，所述冠状病毒选自COVID-19(SARS-CoV-2)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。
本发明还提供了如上所述的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐在制备与刺突蛋白(Spike)结合的试剂盒或试剂、制备主蛋白酶(Mpro)抑制剂的试剂盒或试剂、或制备木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)抑制剂的试剂盒或试剂中的应用。
本发明还提供了一种预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物，其中包含所述的一种海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐、和另外的一种或两种以上预防和/或治疗冠状病毒感染的活性剂。
优选的，如上所述的海洋生物来源天然硫酸多糖的分子量范围为3～600kDa。
本发明通过实验筛选研究表明，系列海洋生物来源天然硫酸多糖对冠状病毒，尤其是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的刺突蛋白(Spike)、主蛋白酶(Mpro或者3CL pro)以及PLpro均有较好的抑制作用。本发明提供了海洋生物来源天然硫酸多糖在抗冠状病毒，尤其是SARS-CoV-2中的应用潜力，证实其具有很好的临床开发应用前景。
本发明提供的海洋生物来源天然硫酸多糖，优选的，其结构特征如下：
(1)岩藻聚糖硫酸酯(又称褐藻糖胶)，包括：(a)I型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(b)Ⅱ型结构褐藻糖胶，主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成，还可以具有其它糖残基支链结构；(c)III型结构褐藻糖胶，主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，分支结构是由α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)其他类型褐藻糖胶，主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成。
(2)岩藻糖基化硫酸软骨素，其结构特征如下：主链由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的硫酸软骨素二糖重复单元，且在GlcA的C3位通过α-1,3糖苷键连接硫酸化岩藻糖支链。
(3)硫酸半乳聚糖，其结构特征如下：由β-1,3-连接和α-1,4-连接的半乳糖(Gal)，或由β-1，3-连接的半乳糖与α-1,4-连接-3,6-内醚半乳糖(AnG)组成，且半乳糖的C2、C4或C6位含有不同硫酸酯基。
(4)硫酸鼠李聚糖：其结构特征如下：由鼠李糖(Rha)和葡萄糖醛酸通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由Rha和艾杜糖醛酸通过α-1,4糖苷键交替连接而成；或者由鼠李糖(Rha)和木糖(Xyl)通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成；或者由α-1,2和α-1,3-鼠李糖交替连接而成；且上述结构Rha的C2和/或C3位含有硫酸酯基。
本发明的海洋生物来源硫酸多糖均具有抑制冠状病毒，尤其是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的作用。实验结果显示，本发明提供的各种海洋生物来源硫酸多糖均具有显著的抗新型冠状病毒作用，抑制Spike的IC50值在0.01～30μM之间，抑制Mpro的IC50值在1nM～100nM之间，抑制木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)的IC50值在0.001～30μM。如岩藻聚糖硫酸酯抑制Mpro的IC50为5.68nM，抑制Spike蛋白的IC50为0.06μM，抑制木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)的IC50为7.65nM，且效果均明显好于肝素。
作为优选方案，以上所述的应用，所述的冠状病毒包括但不限于新型冠状病毒(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。
本发明提供的海洋生物来源天然硫酸多糖在抗新型冠状病毒中的应用，可以将海洋生物来源天然硫酸多糖制备成喷雾剂、注射剂、胶囊剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、搽剂、涂剂。
优选地将治疗有效量的本发明海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐或立体异构体，根据通常给药途径并且根据本领域已知方法以常规药物组合物(该药物组合物包含有效量的活性成分和合适的药用载体)和剂型配制而施用至需要这样治疗的患者。
所述“治疗有效量”是指当施用时，其足以防止所针对的疾病的一种或两种以上症状的发展，或在某种程度上缓解所述一种或两种以上症状。根据本发明施用的化合物的具体剂量将由围绕该病例的具体情况确定，所述情况包括所施用的化合物、给药途径、治疗的具体病况以及类似的考虑因素。特别地，“治疗有效量的化合物”是指足以防止或在某种程度上缓解一种或两种以上冠状病毒感染的化合物的量。
进一步根据待治疗的冠状病毒感染的类型和严重性以及具体患者对药物治疗的反应，单个剂量以及日剂量不同。因此，将根据在医生的指导下的标准医学原理来确定准确的单个剂量。
用于在治疗冠状病毒所致疾病中使用本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐的人体有效日剂量为，1mg至约500mg、约5mg至约1000mg、或约10mg至约2000mg的注射或其他活性剂的口服剂型。
本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐可以单独使用或组合使用或与其他治疗剂的联合疗法使用。
在本发明的一个实施方案中，海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐用于在预防和/或治疗冠状病毒感染中使用，其中所述预防或治疗包括施用作为唯一活性成分使用。
在本发明的另一个实施方案中，上述海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐用于在预防和/或治疗冠状病毒感染中使用，其中所述预防或治疗包括以与选自其它的治疗剂的联合疗法使用。
如对于本领域技术人员将明显的是，包含本发明海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐与另外的治疗剂的本发明的组合不仅在这些活性成分以单一组合物使用时是有效的，而且在以两个不同组合物(同时、依次或在一段时间之后分开地施用)使用时也是有效的。此外，本领域技术人员将理解，本发明海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐可以开处方为与联合疗法中的其他活性成分一起使用，以预防和/或治疗冠状病毒感染。
在一个特别的实施方案中，联合疗法包括向受试者同时、依次或分开地施用本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐和另外的治疗剂。备选地，联合疗法包括向受试者施用在单一组合物中的本发明海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐或立体异构体和另外的治疗剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐或立体异构体可以方便地施用至患者。因此，用于本发明的用途的化合物可以为包含与药用赋形剂或载体组合的有效量的本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐的药物组合物的形式。这一方面也可以表达为，包含与药用赋形剂或载体组合的有效量的本发明的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐的组合物用于在预防和/或治疗冠状病毒感染。
在本发明的一个实施方案中，使用的化合物可以以包含常规药用载体的剂量单位制剂通过口腔、注射、皮下、呼吸道、透皮、非肠道、直肠、局部外用、静脉、肌肉或通过其它方式来给予。可以将药物组合物配制成任何药用形式，如：片剂、颗粒剂、注射剂、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、植入剂、纳米制剂、粉针剂。诸如片剂和胶囊剂的一些剂型可以再分成包含诸如达到期望目的的有效量的适当量活性组分的适当剂量单位剂型。
在另一个实施方案中，用于本发明的用途的海洋生物来源天然硫酸多糖、药学上可接受的盐为待施用至要治疗的患者的注射制剂，适用于本发明的注射剂是指药物与适宜的溶剂或分散介质制成供注入人体内的灭菌或无菌溶液、乳状液或悬浮液，以及供使用前配制成溶液或悬浮液的粉末无菌制剂。所述注射剂包括注射液(其中供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液)、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。
载体包括赋形剂和稀释剂，并且必须具有足够高的纯度和十分低的毒性以使它们适于被给予待治疗的患者。载体可以是惰性的或其可以本身具有药用益处。
载体的种类包括但不限于：稀释剂如填料和疏松剂、粘合剂、润滑剂、抗结块剂、崩解剂、增甜剂、缓冲剂、防腐剂、增溶剂、等张剂、悬浮剂和分散剂、润湿剂或乳化剂、调味剂和芳香剂、增稠剂和媒介物。
可选的活性剂可以包括在药物组合物中，其基本上不影响本发明的化合物的活性。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。所用海洋生物来源天然硫酸多糖结构如下：
(1)岩藻聚糖硫酸酯：主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成，分子量为600kDa。
(2)ι-卡拉胶：由β-1,3-连接的半乳糖与α-1,4-连接-3,6-内醚半乳糖重复二糖单元组成，半乳糖残基C4位和内醚半乳糖残基C2位被硫酸根取代，分子量为200kDa。
(3)岩藻糖基化硫酸软骨素：主链由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的硫酸软骨素二糖重复单元，且在GlcA的C3位通过α-1,3糖苷键连C2和C3位被硫酸根取代的岩藻糖支链，分子量为3kDa和50kDa。
(4)硫酸鼠李聚糖：由鼠李糖(Rha)和葡萄糖醛酸通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成且上述结构Rha的C2和C3位含有硫酸酯基；分子量为200kDa。
实施例一海洋生物来源天然硫酸多糖对SARS-CoV-2刺突蛋白抑制作用
基于SARS-CoV-2-刺突蛋白类病毒检测体系，评价岩藻聚糖硫酸酯(来源于褐藻)、ι-卡拉胶(来源于红藻)、岩藻糖基化硫酸软骨素(来源于海参)、硫酸鼠李聚糖(来源于绿藻)阻断SARS-CoV-2感染细胞的效果。
本发明采用的硫酸多糖样品可采用本技术领域常规试剂、方法和设备提取。
1)细胞复苏培养：293T/17人胚肾细胞株，按重量百分比计，采用10％胎牛血清、1％双抗和余量的DMEM培养基混合进行培养，细胞复苏后培养两代，备用。
2)类病毒制备：将293T/17人胚肾细胞铺到6孔细胞培养板中，当细胞汇合度达到60％左右时，用转染试剂(Lipofiter 3.0)将3μg质粒进行包装转染，然后将6孔细胞培养板在二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)培养，转染48h后收取类病毒上清溶液，-80℃保存。
3)细胞瞬时转染：将293T/17人胚肾细胞铺到6孔细胞培养板中，当细胞汇合度达到70％左右时，使用转染试剂(Lipofiter 3.0)将3μg质粒(ACE2-pcDNA3.1)转染到293T17细胞，将6孔细胞培养板在二氧化碳培养箱培养48h。
4)细胞消化：用胰酶将瞬时转染的293T/17人胚肾细胞消化，用完全培养基重悬细胞后，利用细胞计数仪进行计数，铺到96孔细胞培养板，每孔12000个细胞，培养6～8h。
5)不同浓度海洋生物来源天然硫酸多糖的制备：待测化合物配成摩尔浓度为1mM的母液，根据在细胞株上检测浓度的不同，在摩尔浓度为0.00015～1.00mM范围内配制成9个不同浓度梯度的稀释液，分别储存于1.5mL的透明EP管中，-20℃保存。将制备好的9个浓度梯度待测化合物，分别用完全培养基稀释10倍，同时采用同等体积的二甲基亚砜(DMSO)溶剂作为对照。
6)铺板：取出培养箱中贴壁6～8h的96孔白色细胞培养板，每孔取出60μL，然后将10μL待测物加入上述含有40μL细胞体积的培养板中，每个浓度梯度2个复孔，在培养箱(37℃、5％CO2)中培养1小时后，每孔再加入50μL收取的类病毒上清溶液，其中待测化合物最终检测浓度为摩尔浓度范围为0.00152～10.00μM的9个浓度梯度；将培养板放置于培养箱中孵育24小时后，更换100μL培养基继续培养48h后检测。
7)读板：将Renilla luciferase检测试剂放置至室温，取出细胞培养板放置10分钟，使其平衡至室温，每孔加入15μL的检测试剂，将培养板在轨道摇床上振摇2分钟，诱导细胞裂解，培养板室温放置10分钟，在MD(Molecular Devices，美谷分子)SpectraMaxParadigm读板器上测定发光信号。
8)数据分析：利用SpectraMax Paradigm读数，得出对应的每孔荧光值RLU。数据采用下列公式来处理：RLU(％)＝(RLUDrug)/(RLUDMSO)*100％。在EXCEL中计算不同浓度化合物对应的细胞活率，然后用GraphPad 7.0Prism软件作曲线图，计算各化合物的IC50值。结果见下表，
如图1所示，系列海洋生物来源天然硫酸多糖均对阻断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染细胞具有明显抑制效果，且化合物岩藻聚糖硫酸酯和卡拉胶、岩藻糖基化硫酸软骨素、硫酸鼠李聚糖等海洋生物来源天然硫酸多糖阻断病毒感染细胞效果强于肝素(Heparin)。
实施例二海洋来源天然硫酸多糖对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制作用
SARS-CoV-2主蛋白酶可以水解荧光多肽底物从而使底物产生荧光。主蛋白酶活性被海洋来源天然硫酸多糖抑制，荧光强度较空白对照降低。其中，主蛋白酶和荧光多肽底物可以采用文献W.Dai et al.,Science 10.1126/science.abb4489(2020)报道方法获得。
(1)TE缓冲溶液配制
将100μL摩尔浓度为0.5M乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)水溶液加入2.5mL摩尔浓度为1M的Tris-HCl缓冲液中，定容至50mL，调节pH至7.3，0.22μm滤膜过滤后，-4℃保存。
(2)海洋生物来源硫酸多糖对主蛋白酶抑制活性的筛选
在96孔细胞培养板中加入87μL TE缓冲溶液，再分别加入1μL摩尔浓度为19.7μM的主蛋白酶，混匀后，将H2O(2μL)、海藻来源岩藻聚糖硫酸酯水溶液(2μL，摩尔浓度15μM；分子量260.1kDa)、麒麟菜来源iota－卡拉胶(2μL，摩尔浓度15μM；分子量200kDa)、鲨鱼骨来源硫酸角质素(2μL，摩尔浓度15μM，分子量45.98kDa)、海参来源岩藻糖基化硫酸软骨素(2μL，摩尔浓度15μM，分子量42kDa)依次分别加入各孔，摇匀，室温反应30min后，每孔均加入10μL摩尔浓度为20μM的底物，迅速采用酶标仪检测荧光强度。本发明采用的硫酸多糖样品可采用本技术领域常规试剂、方法和设备提取。
(3)酶标仪检测条件
在激发波长320nm、发射波长405nm、检测温度为27℃条件下连续检测10min内各孔荧光强度，获得时间－荧光强度动态曲线。
(4)数据处理
基于获得的时间－荧光强度动态曲线进行线性拟合，得到各海洋来源天然硫酸多糖对应曲线的斜率k和空白对照对应曲线斜率k0
天然硫酸多糖(摩尔浓度300nM)对主蛋白酶的抑制率＝(1－k/k0)×100％
如图2所示，褐藻来源岩藻聚糖硫酸酯、红藻来源的卡拉胶、海参来源岩藻糖基化硫酸软骨素对SARS-CoV-2主蛋白酶活性抑制率均超高50％。
实施例三不同浓度的岩藻聚糖硫酸酯对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制作用
(1)岩藻聚糖硫酸酯对主蛋白酶活性抑制实验
在96孔细胞培养板中加入87μL TE缓冲溶液，再分别加入1μL摩尔浓度为19.7μM的主蛋白酶，混匀后，分别将2μLH2O和9个浓度梯度的摩尔浓度范围为0.5nM～45μM的海藻来源的岩藻聚糖硫酸酯水溶液依次分别加入各孔，摇匀，室温反应30min后，每孔均加入10μL摩尔浓度为20μM的底物，迅速采用酶标仪检测荧光强度。本发明采用的硫酸多糖样品可采用本技术领域常规试剂、方法和设备提取。
(2)酶标仪检测条件
在激发波长320nm、发射波长405nm、检测温度为27℃条件下连续检测10min内各孔荧光强度，获得时间－荧光强度动态曲线。
(3)数据处理
基于获得的时间－荧光强度动态曲线进行线性拟合，得到各不同浓度下岩藻聚糖硫酸酯对应曲线的斜率k和空白对照对应曲线斜率k0
不同浓度岩藻聚糖硫酸酯对主蛋白酶抑制率＝(1－k/k0)×100％
(4)IC50计算
采用软件origin 8.1，以浓度的对数对抑制率作图，并采用非线性拟合，获得IC50值。
(5)结果
如图3所示，海洋生物来源的岩藻聚糖硫酸酯对主蛋白酶活性具有良好的抑制作用，其相应的IC50值＝5.68±0.43nM(nmol/L)
实验结果表明，本发明提供的海洋生物来源的天然硫酸多糖具有明显的抑制冠状病毒增殖作用，不仅可以抑制冠状病毒表面的刺突蛋白(Spike)与宿主细胞结合，而且能抑制主蛋白酶(Mpro)和类木瓜蛋白酶(PLpro)活性，从而有效阻断冠状病毒感染宿主细胞。
