一种含芦荟提取物的组合物及其应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种含芦荟提取物的组合物及其应用。
背景技术
癌症是严重威胁我国乃至全世界人民生命的常见疾病，位居死亡原因第一。近年来，尽管肿瘤早期诊断、早期发现技术有了很大进步，标准的化疗和放疗已在临床上应用了几十年，但大多数临床中晚期患者的整体生存率仍无明显改善。正常细胞演变为癌细胞，就会具备癌症细胞的6个基本特征：维持增殖的信号，避免增殖抑制，抵抗细胞死亡，诱导血管生成，无限制的复制，激活侵袭和转移。整个癌变过程可以分为癌症发生阶段、癌症进展阶段和癌症转移阶段。被诊断出的癌症患者大部分已是中期或晚期，癌细胞的大量存在、复制、转移，威胁着患者的生命，但目前仍然没有很好的药物能够有针对性的杀死癌细胞，但对正常细胞损伤较小。
WNT/β-catenin信号通路参与多种发育过程以及许多癌症的发生和发展，特别是结直肠癌和肝癌。经典WNT信号通路中的关键调控步骤包括β-catenin的磷酸化，泛素化和随后的降解过程。该过程涉及一个专门的细胞质破坏复合物，该复合物由支架蛋白Axin和瘤性息肉病(APC)、糖原合成酶激酶-3α/β(GSK-3)、酪蛋白激酶1(CKI)这三个核心成分组成。一旦WNT配体与受体复合物结合形成一种七跨膜结构域的fryzzle蛋白或LDL受体相关蛋白家族的单程跨膜蛋白(特别是LRP5或LRP6)，信息转导后会抑制Axin介导的β-catenin磷酸化，而使未磷酸化的β-catenin积聚并传送至细胞核，从而与TCF/LEF(T细胞因子/淋巴增强因子)家族的DNA结合蛋白形成复合物并激活WNT靶基因表达。而目前针对WNT/β-catenin信号通路的药物少，且未体现出卓越的效果。
因此，亟需提供有一种抑制癌细胞中的WNT/β-catenin通路的组合物。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种含芦荟提取物的组合物，能够抑制癌细胞中的WNT/β-catenin通路。
一种含芦荟提取物的组合物，包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物。
优选的，所述组合物，包括芦荟提取物和喜树碱衍生物；进一步优选的，所述喜树碱衍生物为10-羟基喜树碱(HPT)。
优选的，在所述组合物中，所述芦荟提取物的含量为50-400ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为2.5-50uM；进一步优选的，所述芦荟提取物的含量为50-150ug/ml，所述喜树碱及其衍生物的含量为5-30uM。
优选的，所述含芦荟提取物的组合物，所述芦荟提取物采用水或/和醇浸提得到；进一步优选的，所述芦荟提取物采用水浸提得到。
一种药物，包括所述的含芦荟提取物的组合物和辅料。
所述药物为要学上可接受的任意剂型，如片剂、粉剂或胶囊剂。
所述含芦荟提取物的组合物在制备抗癌的药物中的应用；优选的，所述含芦荟提取物的组合物在制备抗肝癌的药物中的应用。
所述组合物在制备WNT/β-catenin通路抑制剂中的应用。
所述组合物在制备WNT/β-catenin通路信号素失活剂中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明中所述含芦荟提取物的组合物，包括芦荟提取物和喜树碱及其衍生物，芦荟提取物和喜树碱及其衍生物联合使用能够增加对癌细胞中DNA损伤，上调γH2AX蛋白水平，阻滞细胞周期于S期，诱导细胞凋亡和抑制WNT/β-catenin信号通路，两者协同增效，增强癌细胞的细胞毒活性，以达到抗癌的作用。
附图说明
图1为实施例1、实施例2中细胞毒性MTT试验结果图；
图2为实施例1、实施例2中HepG2细胞彗星分析结果图；
图3为实施例1、实施例2中HepG2细胞周期分析图；
图4为实施例1、实施例2中HepG2细胞凋亡分析图；
图5为实施例1、实施例2中HepG2细胞中的WNT/β-catenin通路的蛋白水平图；
其中，**P<0.05，**P<0.01，与对照组相比；P<0.05，##P<0.01，与HPT组相比。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用芦荟提取物购买于一方制药有限公司(中国广州)。其他的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
称量芦荟提取物，在过滤提取物之前，将芦荟提取物在80℃的水中超声提取30分钟。芦荟提取液使用前储被存在-20℃备用。取HPT，与芦荟提取物混合制备成组合物1，其中HPT的浓度为10uM，芦荟提取物的含量为50ug/ml。
实施例2
称量芦荟提取物，在过滤提取物之前，将芦荟提取物在80℃的水中超声提取30分钟。芦荟提取液使用前储被存在-20℃备用。取HPT，与芦荟提取物混合制备成组合物2，其中HPT的浓度为10uM，芦荟提取物的含量为100ug/ml。
产品效果测试
将实施例1和实施例2制得的组合物进行如下试验。
材料和方法
1.药品和试剂
人肝细胞癌HepG2细胞由美国菌种保藏中心(ATCC)(美国马里兰州罗克维尔/Rockville,MD,USA)提供；
DMEM培养基、青链霉素溶液、胎牛血清(FBS)和0.25％胰酶EDTA溶液均购自GIBCOInvitrogen公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德/Carlsbad,CA,USA)；
10-羟基喜树碱(HPT)购自成都曼思特生物科技有限公司(中国成都)；
超纯水自Milli-Q纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德/Bedford,MA,USA，Millipore公司)获得；
质谱级甲醇，乙腈和乙酸购自Anaqua Chemical Supply公司(美国得克萨斯州休斯顿/Houston,TX,USA)；
稳定同位素标记的13C1015N5-三磷酸腺苷(ATP13C15N)、二甲基亚砜(DMSO)，胰酶-EDTA溶液和3-[(4,5)-二甲基-2噻唑]-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)购自SigmaAldrich Chemical公司(美国密西根州圣路易斯/St.Louis,MO,USA)；
30％氢氧化铵水溶液(NH4OH)，乙酸铵(NH4OAc)购自Sigma-Aldrich公司(美国密西根州圣路易斯/St.Louis,MO,USA)。
HPLC质量级甲醇、乙腈和乙酸(AcOH)购自JT Baker Chemical公司(美国新泽西州菲利普斯堡/Phillipsburg,NJ,USA)；
甲酸购自Fisher Scientific公司(美国新泽西州费尔劳恩/Fair Lawn,NJ,USA)；乙醚购自Tedia公司(美国俄亥俄州费尔菲尔德/Fairfield,OH,USA)；
四氟硼酸(HBF4)和三甲基甲硅烷基重氮甲烷(TMSD；在己烷中为2M)由Alfa Aesar公司提供(美国马萨诸塞州沃德希尔/Ward Hill，MA，USA)；
色谱柱Sepax GP-C18(2.1×150mm，1.8μm)从Sepax Technologies获得(美国特拉华州纽瓦克/Newark，DE，USA)。
2.植物原材料
本申请中的库拉索芦荟/Aloe barbadensis miller为干燥的芦荟渗出液，购买于一方制药有限公司(中国广州)。
3.芦荟提取物的LC-MS/MS分析
芦荟素A(≥98％)、芦荟素B(≥98％)、芦荟宁(≥98％)和芦荟苦素(≥98％)的标准物购自宝鸡市辰光生物有限公司(中国宝鸡)；超纯水自Milli-Q纯水系统(美国马萨诸塞州贝德福德/Bedford,MA,USA,Millipore公司)获得；质谱级乙腈购自Anaqua ChemicalSupply公司(美国得克萨斯州休斯顿/Houston,TX,USA)。
芦荟提取物在Thermo Fisher TSQ LC-MS/MS系统上进行，该系统由Accela自动进样器，Accele泵和Quantum Access三重四极杆质谱仪组成(Thermo Fisher Scientific公司，美国加利福尼亚州圣何塞/San Jose,CA,USA)。使用Sepax GP-C18色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm，Thermo Fisher Scientific公司,美国加利福尼亚州圣何塞/San Jose,CA,USA)进行色谱分离。洗脱液为30％的乙腈水，液体流速设定为0.3mL/min，柱温保持在35℃，在350℃的温度和15psi的辅助气压下，将负离子模式下的离子喷雾电压设置为3000V。如表1所示，使用质谱多反应监测(MRM)技术进行定量分析。
表1.质谱多反应监测(MRM)的设置
4.细胞培养
在添加了10％胎牛血清(FBS)，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养HepG2细胞，将其置于37℃、5％CO2条件下的培养箱中孵育。将HepG2细胞接种于100mm×20mm的培养皿中(Corning Inc，美国纽约州康宁/Corning,NY,USA)。过夜培养后，将细胞分为以下几组：对照组(C)，将细胞与单独的培养基一起孵育48小时；10-羟基喜树碱组(HPT)，首先将细胞与培养基一起孵育24小时，然后将其暴露于10.0μM的HPT中培养24小时；芦荟提取物组(Aloe)，将细胞暴露于50.0μg/mL或100.0μg/mL的芦荟提取物中48小时；组合组(包括组合物1和组合物2)，将细胞用组合物1和组合物2分别处理24小时。在细胞收获当天，将额外的细胞培养皿用于细胞计数，以使核苷酸库标准化，并通过台盼蓝拒染实验测定存活率。
5.细胞毒性试验
通过细胞毒性MTT实验测定确定不同组对HepG2细胞的抑制作用。将HepG2细胞以1×104细胞/孔的密度接种在96孔板中(LabServ,Thermo Fisher Scientific Co,中国北京)。孵育后，将它们用一定浓度的HPT，芦荟或组合物((包括组合物1和组合物2))处理24、48和72小时。将MTT溶液(培养基中最终浓度为0.5mg/mL)加入到每个孔中，并进一步温育4小时。移走培养基，向每个孔中加入100μL DMSO以溶解紫色结晶甲臜。使用微孔板UV/VIS分光光度计在570nm处测量吸光度(Infinite M200 PRO,Tecan Austria GmbH 5082,奥地利格勒迪希/
6.结晶紫染色试验
为了直观地观察药物对细胞的功效，通过结晶紫染色法评估细胞存活率。简而言之，用10.0μM HPT培养基、50.0μg/mL芦荟培养基、100.0μg/mL芦荟培养基或组合物培养基(包括组合物1和组合物2)处理6孔板中的HepG2细胞(2.0×105细胞/孔)。随后，将细胞用0.5％结晶紫染色。PBS冲洗后，使用Quantity One软件克隆计数功能对菌落进行计数(LifeScience Research&Clinical Diagnostics,Bio-Rad Ltd，美国加利福尼亚州/California,USA)。
7.免疫荧光试验
HepG2细胞生长在6孔板的玻璃圆形培养片上，加入HPT，芦荟及组合组(包括组合物1和组合物2)，分别孵育48小时。处理结束时，用PBS洗涤细胞并在室温下用4％多聚甲醛固定细胞15分钟。随后，将细胞用PBS洗涤三次，并于室温下在5％(w/v)BSA中孵育30分钟以封闭细胞，然后与相应的一抗gamma H2A.X在4℃下孵育12小时(phospho S139)[9F3](ab26350),稀释比例＝1:100；
8.HPT诱导的DNA损伤和彗星试验
将HepG2细胞以4×105/孔的密度接种在6孔板中，并孵育24小时。将细胞分为以下几组：对照组中仅与培养基一起孵育的细胞，以及在50.0μg/mL或100.0μg/mL芦荟中预处理24h后暴露于40.0μM HPT 1h的细胞。对照组，仅与培养基一起孵育的细胞；伤害组，在50.0μg/mL或100.0μg/mL芦荟中预处理24h后暴露于40.0uM HPT 1h的细胞。HPT处理1小时后，用冷PBS洗涤细胞并收获，根据以前发表的方法通过碱性彗星电泳测试细胞DNA损伤。用荧光显微镜(Leica Microsystems公司，德国韦茨拉尔/Wetzlar,Germany)检测彗星。通过彗星图像分析系统(Globalebio公司，中国北京)分析其图像。总强度(DNA含量)、尾巴长度、尾巴中的DNA百分比和尾矩这几个特征被用于评估DNA损伤的程度。
9.细胞周期分析
将细胞以4.0×105/孔一式两份地接种在6孔培养板中，并与指示浓度的HPT，芦荟或组合物(包括组合物1和组合物2)孵育48小时。然后收获它们，并在4℃下用70％(v/v)的冷乙醇固定过夜。通过离心收集固定的细胞，重新悬浮于PBS中，并与5mg/mL的碘化丙啶(Sigma-Aldrich)和10mg/mL的核糖核酸酶A(Sigma-Aldrich)在室温下黑暗条件中孵育30分钟。然后用流式细胞仪(MuseTM cell analyzer,Merck Millipore，德国达姆施塔特/Darmstadt,Germany)分析细胞。最后，使用Modfit软件(Verity Software House，美国)计算不同阶段(G0/G1、S和G2/M)的细胞百分比。
10.凋亡检测
使用MuseTM Annexin V&Dead Cell Kit(德国达姆施塔特/Darmstadt,Germany)对细胞凋亡进行定量。通过胰蛋白酶消化得到HPT组，芦荟组或组合组(包括组合物1和组合物2)细胞，用冷PBS洗涤两次后重悬于1％FBS中。加入MuseTM Annexin V&Dead Cell对细胞染色，然后通过流式细胞仪(MuseTM cell analyzer,Merck Millipore，德国达姆施塔特/Darmstadt,Germany)进行分析。
11.蛋白质印迹分析
收集每组细胞，并在RIPA缓冲液中进行提取和裂解(Cell SignalingTechnologies公司，美国马萨诸塞州贝弗利/Beverly,MA,USA)。使用Bradford试剂(Bio-Rad Laboratory,加利福尼亚州赫拉克勒斯/Hercules,CA,USA)测定蛋白质浓度。简而言之，将细胞裂解液与5x SDS上样缓冲液(4:1，v/v)混合,并盖紧盖子在100℃下加热5分钟。将这样处理过的裂解物(20μg)进行10％十二烷基磺酸钠道-聚丙烯酰内胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，将来自SDS-PAGE的细胞提取物转移至硝酸纤维素膜(Merck Millipore，美国)，与Wnt/β-Catenin激活靶标抗体样品试剂盒#8655(稀释比＝1：1000；Cell SignalingTechnology)、兔β-Catenin(稀释比＝1:1000；Cell Signaling Technology)、鼠gammaH2A.X(phospho S139)[9F3](稀释比＝1:1000；
结果分析
1.芦荟提物物的LC-MS/MS分析
通过LC-MS/MS分析芦荟水提取物的成分。通过对比参考化合物，根据芦荟素A、芦荟素B、芦荟宁和芦荟苦素的保留时间和裂解方式，对其进行了鉴定。本申请中芦荟提取物中的芦荟A、芦荟B、芦荟宁和芦荟苦素作为标记物被进一步定量，它们的含量分别为1249.0、1080.0、23.8和4.3μg/g。
2.芦荟提取物联合HPT在HepG2细胞中发挥协同作用
通过细胞毒性MTT(3-[4,5-二甲基-2-噻唑]-2,5二苯基四唑溴化物)试验测定芦荟的固有细胞毒性。用不同浓度的芦荟(0-200.0μg/mL)处理HepG2细胞不同的时间(24、48、72h)。
图1中A表示用不同浓度的芦荟提取物(0-200.0μg/mL)处理HepG2细胞24、48和72小时后的细胞存活率，横坐标表示芦荟提取物的浓度，纵坐标表示细胞存活率，由图可知，芦荟提取物的浓度≤100.0μg/mL时对HepG2细胞无明显的毒性作用，即使作用较长时间，也无明显效果，90％以上的细胞能够存活。
图1中B表示采用HPT单独处理或采用组合物1(10uM HPT和50ug/ml芦荟提取物)、组合物2(10uM HPT和100ug/ml芦荟提取物)处理48小时的细胞存活率；由图可知，HPT单独处理或采用组合物1、组合物2处理，会导致HepG2细胞的存活率降低，组合物处理后HepG2细胞的存活率更低，HPT和芦荟提取物具有协同增效的作用。
图1中C表示各处理组细胞形成的菌落，培养皿1表示对照组，不添加芦荟提取物和HPT，培养皿2表示用50ug/ml的芦荟提取物处理，培养皿3表示用100ug/ml的芦荟提取物处理，培养皿4表示用10uM的HPT处理，培养皿5表示用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理，培养皿6表示用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理；由图可知，对照组和芦荟提取物单独处理组，细胞生长良好，用10uM的HPT处理会影响细胞的生长，而组合物处理会明显影响细胞的生长。
由图中D表示菌落形成试验中各组的细胞数形成菌落的细胞计数，横坐标为各处理组，纵坐标为细胞数，由图可知，芦荟-HPT组合显著降低了HepG2细胞的生长。
通过组合指数(CI)方法评估芦荟提取物和HPT之间的相互作用，其中CI<1，CI＝1或CI>1分别表示协同作用，累加作用或拮抗作用。HPT单独处理和组合物处理的IC 50值(最大抑制浓度的一半)和CI值如表1。由表中IC50和组合指数(CI)值可知，芦荟提取物和HPT在HepG2细胞中有明显的协同作用。
表1.芦荟提取物和组合物对HepG2细胞的细胞毒性评估
注：*P<0.05，**P<0.01，表示与HPT组有显著性差异。
3.芦荟-HPT组合增加HepG2细胞的DNA损伤
HPT是一种DNA合成抑制剂，可以抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ，并在DNA复制过程中造成DNA损伤。因此，由DNA链断裂引起的DNA损伤程度可反映HPT在癌细胞中的细胞毒性。为了便于DNA损伤分析，对经过不同处理的HepG2细胞进行彗星试验。
图2中A为各组的彗星分析，通过荧光显微镜(原始放大倍数：200×)获得的彗星试验图像，图中分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用40uM的HPT处理；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。由图可知，与对照组相比，单独采用芦荟提取物处理的组的尾值没有差异；单独40.0μM HPT组孵育1h后，能观察到HepG2细胞中的尾巴；在芦荟+HPT组合中可发现更长的尾巴。
图2中B为尾巴值分析图，横坐标为各处理组，纵坐标为尾巴长度；图2中C为尾矩值分析图，横坐标为各处理组，纵坐标为尾矩值；由图可知，与对照组相比，单独采用芦荟提取物处理的组的尾值没有差异；单独40.0μM HPT组孵育1h后，能观察到HepG2细胞中的尾巴；在芦荟+HPT组合中可发现更长的尾巴长度和更高的尾矩值。
图2中D为DAPI和γH2AX在HepG2细胞中的免疫荧光染色(原始放大倍数：400×)，从左往右依次为DAPI、γH2AX和Merge成像(Merge为DAPI和γH2AX的成像叠加)；免疫荧光染色结果显示，芦荟提取物与HPT组合可在HepG2细胞中以剂量依赖性方式增加γH2AX的水平。
图2中E为γH2AX在蛋白印迹法中的表达，其中横向从左往右依次为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。和单独的HPT组相比，采用HPT和芦荟提取物共同处理组(即组合物组)的γH2AX蛋白水平明显更高。
由图2可知，芦荟提取物与HPT对DNA损伤的协同作用与γH2AX的累积程度有关。
10-羟基喜树碱(HPT)是喜树碱衍生物，是拓扑异构酶I的特异性抑制剂，可在DNA切割后与DNA和核拓扑异构酶I酶之间形成的可裂解复合物结合并使其稳定，从而防止DNA重新密封并使可裂解复合物积聚。因此，可裂解的复合物阻碍了暂时性DNA单链断裂的修复并阻止了DNA复制，导致致命的DNA双链断裂，进而激活了内切核酸酶，引发了进一步的DNA断裂并最终导致了细胞死亡。彗星试验(也称为单细胞凝胶试验(SCG))是一个检测单细胞DNA链断裂的灵敏且快速的方法。彗尾的长度与破坏程度呈正相关，彗星试验的数据证明，尽管芦荟的单独使用对DNA损伤没有影响，但芦荟能够以剂量依赖的方式刺激HPT诱导的DNA损伤。
γH2AX是一个分子量为14kD的基础组蛋白，也是H2组蛋白家族的成员。这种核蛋白是在细胞周期的G1和S期合成的，并对免疫球蛋白转换区域之间的重组有着重要作用。双链DNA断裂后，γH2AX在139号丝氨酸上被磷酸化。采用所述组合物处理后，形成的γH2AX增加，因此进一步说明表明芦荟提取物显著促进了HepG2细胞中HPT诱导的DNA双链断裂。本发明中芦荟提取物和HPT组合物对诱导HepG2细胞中DNA双链断裂具有协同增效的作用。
4.芦荟+HPT对细胞周期阻滞的影响
为了研究HPT对HepG2细胞的抗增殖作用是否由细胞周期阻滞触发，使用碘化丙啶(PI)染色的流式细胞仪分析经芦荟提取物、HPT单独处理以及组合物处理48小时后的细胞周期分布。
图3为不同阶段的HepG2细胞百分比，横坐标为各组(分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用40uM的HPT处理；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理)在不同时期，纵坐标为细胞百分比。
细胞周期进程的失调和细胞凋亡是癌症的常见特征，由图3可知，与对照组相比，HepG2细胞暴露于HPT导致G0/G1期减少，同时G2/M期增加。经芦荟提取物和HPT联合处理的细胞，S期细胞的比例增加，而G2/M期细胞的比例减少。此外，与HPT单独处理组相比，经组合物处理后可引起G0/G1期显著积累和G2/M期显著消耗。结果表明，与对照组相比，芦荟提取物和HPT联合处理显著诱导HepG2细胞S期阻滞。
5.芦荟-HPT诱导半胱氨酸蛋白酶依赖性凋亡
为了鉴定HPT-芦荟的生长抑制作用是否是由凋亡引起的，通过Annexin V&DeadCell双重试剂染色的流式细胞仪证实了凋亡的发生。
图4中A为处理前后凋亡细胞的分布图，图中横坐标分别为各组(分别为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用50ug/ml的芦荟提取物处理组；用100ug/ml的芦荟提取物处理组；用40uM的HPT处理组；用10uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理组；用10uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理组)在早期、中期和晚期，纵坐标为细胞百分比。由图4中A可知，暴露于HPT后(有或没有芦荟提取物)，早期和晚期凋亡细胞的百分比显著增加。因为半胱氨酸蛋白酶激活被认为是肿瘤细胞中常见的凋亡途径。蛋白印迹法被用于评估半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡中的功能作用。
图4中B为通过蛋白印迹法分析评估PARP、caspase-3、caspase-9、Cleaved-caspase-9和Bax的水平，β-肌动蛋白(β-actin)用作负载对照，图中，横向依次表示采用对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理。图4中C表示PARP、Cleaved-PARP、caspase-3、caspase-9、Cleaved-caspase-9和Bax的相对表达水平代表图，横坐标为各组的PARP、Cleaved-PARP、caspase-3、caspase-9、Cleaved-caspase-9和Bax的相对表达，纵坐标为相对表达水平值。
由图4中B和C可知，经芦荟提取物+HPT共同处理细胞中的PARP、caspase-9和Bax明显降低，而Cleaved-PARP、Cleaved-caspase-9和caspase-3被强烈激活。这些结果证实芦荟提取物可以通过半胱氨酸蛋白酶依赖性机制促进HPT诱导的细胞凋亡。
6.芦荟-HPT组合物抑制HepG2细胞中的WNT/β-catenin通路
为了进一步了解芦荟和HPT协同作用的机理，通过蛋白印迹实验研究WNT/β-catenin信号通路蛋白。
图5中A为通过蛋白印迹法评估WNT/β-catenin通路中的蛋白质水平图，将β-actin作为负荷对照，图中横向依次为对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理，纵向为各蛋白；图5中B为WNT/β-catenin通路蛋白的相对表达水平图，横坐标为各组(对照组，不添加芦荟提取物和HPT；用100ug/ml的芦荟提取物处理；用15uM的HPT处理；用15uM的HPT和50ug/ml的芦荟提取物共同处理；用15uM的HPT和100ug/ml的芦荟提取物共同处理)的Met、β-catenin、c-Jun、c-Myc癌基因、MMP7蛋白，纵坐标为相对表达水平值。
典型WNT通路的抑制导致β-catenin向细胞核转运的停止，并抑制了核TCF/LEF转录因子的活性，从而破坏Wnt依赖性信号传导中的靶基因，包括CD44、cyclin D1、c-Jun、LEF1、Met、MMP-7、c-Myc和TCF1/TCF7。由图5中A、B可知，该芦荟提取物和HPT组合物有效诱导了Met、β-catenin和c-Myc表达蛋白水平的下调；同时共同作用后，原癌基因c-Jun蛋白的表达水平呈剂量依赖性上调。该芦荟提取物和HPT组合物的协同增效作用与细胞WNT/β-catenin信号通路的调节有关，该组合物能够抑制HepG2细胞中的WNT/β-catenin通路。
