高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用。
背景技术
手足口病(HFMD)是儿童常见传染病，是由多种病毒引起的丙类传染病，柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)是引起的手足口病的病原体之一，主要感染5岁以下的儿童。柯萨奇病毒A组10型为我国近几年手足空病的主要病原体之一。CA10能够引起疱疹性咽峡炎，CA10能够引起疱疹性咽峡炎，CA10能够引起疱疹性咽峡炎，少数患者表现为神经系统的症状甚至出现惊厥或心肺功能的并发症。
2008年开始，柯萨奇病毒A10在中国部分地区开始不断流行,2010年法国就爆发CA10引起的手足口病，随后中国许多地方也出现CA10优势菌株的手足口病流行。目前尚未有预防CA10的疫苗，因此，开发疫苗对于预防手足口病具有重要意义。
目前，国内外还未有针对CA10的疫苗上市销售，多数疫苗处于临床前研究，主要以灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗(Virus Like Particle，VLP)的研究为主。灭活疫苗存在灭活不完全或毒力回复的风险，且灭活疫苗在灭活时抗原表位易被破坏，灭活疫苗空心、实心病毒颗粒比例难于控制，导致批间差异大，且批产量低等问题。因此，研制更加廉价、安全、有效的针对CA10的预防性疫苗对控制婴幼儿手足口病的流行具有十分重大的意义。
CA10病毒属于单股正链RNA病毒，病毒基因组约为7.4kb核苷酸；病毒颗粒为二十面球形结构，立体对称，无包膜，直径约为28～32nm。病毒蛋白外壳由4个多肽链组成，即为VP1、VP2、VP3和VP4。这4个蛋白组成一个亚单位，再由60个亚单位构成病毒的衣壳蛋白。研究表明，病毒的衣壳蛋白在细胞内可自行组装成VLP，该病毒颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化。
VLP疫苗为研发新型、安全有效的疫苗提供了一个新的契机。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白具有天然的自组装配能力，可形成与天然病毒颗粒相似的空间构型和抗原表位但无病毒核酸，免疫原性强，又没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫体统产生免疫保护反应。这方面它还优于灭活过程中可能破坏一些重要的抗原决定簇。此外，另一大优点是可根据需要任意改造，使之能更好地刺激机体产生保护性免疫反应。
VLP预防性疫苗研发的关键问题是能够制备大量、高效、高纯度的VLP样品，因此高效表达系统的选择以及获得高纯度产品的纯化工艺至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用。
本发明构思如下：一方面，本发明利用多形汉逊酵母表达系统构建获得CA10病毒样颗粒高效表达菌株。多形汉逊酵母表达系统具遗传性质稳定、操作简单、易于高密度培养、外源蛋白产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势，同时避免了其他酵母表达菌株不稳定、质粒易丢失、过度糖基化等缺点。多形汉逊酵母表达系统是一种优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为先进的VLP疫苗表达系统。
另一方面，本发明通过精心设计的纯化工艺可获得高纯度、高产量的VLP样品。本发明采用超滤，三步层析工艺进行VLP疫苗的纯化，工艺操作简单，可控性强，抗原回收率高，不使用离心机等大型设备，更易于大规模生产。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌，所述工程菌包含携带有CA10病毒P1和3CD基因的重组载体；
其中，所述重组载体的出发载体为PMV-05(载体PMV-05的构建方法参见ZL201210592813.5)；所述工程菌的出发菌株为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌AU-0501(菌株参见ZL201210592813.5，保藏编号CGMCC No.7013)；
CA10病毒P1和3CD基因为按照汉逊酵母最偏爱密码子进行序列优化后的基因。
优化后的CA10病毒P1和3CD基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
本发明提供的编码P1及3CD蛋白的核苷酸序列使用了汉逊酵母最偏爱的密码子进行序列优化，为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高，mRNA的二级结构影响翻译效率，本发明对相应的氨基酸使用次偏爱密码子，前提是该次偏爱密码子与最偏爱密码子的使用频率非常接近，氨基酸序列保持不变，同时在某些特殊情况下，为了减少或增加酶切位点，对部分序列进行了适当调整。
可选地，所述工程菌是将CA10病毒P1、3CD基因经EcoRI、BamHI双酶切，然后分别与经EcoRI、BamHI双酶切的载体PMV-05进行构建，分别获得PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体，再将PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体分别进行SacI和XhoI、SacI和SalI酶切构建获得PMV-05-P1-3CD共表达载体，最后将共表达载体导入汉逊酵母菌AU-0501中构建得到的。
优选地，所述工程菌为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)CA10-W，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.19850，保藏日期2020年5月20日。
第二方面，本发明提供所述工程菌在发酵制备CA10病毒样颗粒中的应用。
第三方面，本发明提供CA10病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)培养上述工程菌，从而在工程菌细胞内表达CA10病毒P1蛋白和3CD蛋白，并自组装成具有免疫原性的病毒样颗粒；
2)分离纯化所述病毒样颗粒(VLP蛋白)。
步骤2)采用超滤、三步层析工艺进行病毒样颗粒的分离纯化，包括：
A、离心收集菌体，破碎菌体，目的产物澄清后进行超滤，收集超滤液；
B、离子交换层析；
C、羟基磷灰石层析；
D、分子筛层析。
可选地，步骤A中破碎菌体的方法包括：将工程菌采用细胞裂解缓冲液重悬，在压力1100～1400bar的条件下破碎细胞2-4次；所述细胞裂解缓冲液为20～100mM Tris，1～5mM EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)，200～1000mM NaCl，1～5mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，0.01％～1.0％吐温-80，pH7.5～8.5。
优选地，将工程菌在压力1300bar的条件下破碎细胞2次。
经大量实验发现，本发明中细胞经过1300Bar破碎一次，破碎率可达50～70％；破碎两次，破碎率可达85％～95％，破碎三次后破碎率可达95％～98％以上，综合破碎时间成本和破碎后VLP蛋白与杂蛋白比例组成，破碎两次破碎率大于85％优选。
目的产物澄清的方法包括：破碎后的细胞破碎液通过深层滤器过滤，过滤流速为900～1850ml/min/m2，采用洗液洗滤膜包，收集澄清液；所述洗液为20～100mM Tris，1～5mM EDTA-Na2，200～1000mM NaCl，0.01％～1.0％吐温-80，pH7.5～8.5；或者
将破碎后的细胞破碎液以6000～8000rpm离心40～60min，收集澄清液；或者
破碎后的细胞破碎液通过0.65μm膜包进行微滤，收集澄清液。
优选地，采用深层滤器收集澄清液，洗液为50mM Tris，2mM EDTA-Na2，250mMNaCl，0.01％吐温-80，pH8.0，流速为1200ml/min/m2。
研究发现，本发明中细胞破碎液采用深层滤器流速为1200ml/min/m2，采用高于此流速，细胞碎片去除效果不理想，低于此流速处理时间延长，因此采用1200ml/min/m2可达到除去碎片效果。超滤的方法包括：收集的澄清液以100～500KD的膜包采用pH7.0～8.5的缓冲液进行超滤，收集超滤液；所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷20～100mM，NaCl 150～300mM和重量百分比为0～10％的甘油水溶液。
超滤的方法包括：收集的澄清液以100～500KD的膜包采用pH7.0～8.5的缓冲液进行超滤，收集超滤液；所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷20～100mM，NaCl 150～300mM和重量百分比为0～10％的甘油水溶液。
优选地，缓冲液pH为8.0，三羟甲基氨基甲烷为50mM和NaCl为250mM，缓冲液中还包含质量分数为5％的甘油水溶液。
研究发现，三羟甲基氨基甲烷缓冲液缓冲范围为7.1～8.9，pH值8.0时VLP蛋白纯化回收率高、杂蛋白除去效果好。研究表明在低含量甘油溶液中蛋白会形成肉眼可见的聚集性沉淀而不稳定，但是高浓度甘油增加溶液的粘度引起超滤和层析压力增高，不利于纯化，综合考虑采用5％的甘油水溶液。
步骤B离子交换层析包括：采用缓冲液平衡5～10个柱体积后上样(超滤液)，收集穿透液UV280nm紫外吸收峰，即为一步层析蛋白液；所述缓冲液为20～100mM三羟甲基氨基甲烷，NaCl 150～300mM和重量百分比为0～10％的甘油水溶液，pH7.5～8.5。
优选地，采用50mM三羟甲基氨基甲烷、250mM NaCl和重量百分比为5％的甘油水溶液形成pH8.0的缓冲液进行平衡洗脱。
进一步地，可以采用阴离子交换层析柱进行离子交换层析，介质为Capto Q。
步骤C羟基磷灰石层析包括：向一步层析蛋白液中加入500mM PB溶液至终浓度为10～120mM PB；以10～120mM PBS和重量百分比为0～10％的甘油水溶液形成pH6.8～8.5的缓冲液平衡，平衡5～10个柱体积后上样(一步层析蛋白液)，再用150-400mM PBS和重量百分比为0～10％的甘油水溶液形成pH6.8～8.5的缓冲液洗脱，收集洗脱液UV280nm紫外吸收峰，即为二步层析蛋白液。
优选地，采用60mM PBS和重量百分比为5％的甘油缓冲液平衡除去杂蛋白，采用200mM PBS和重量百分比为5％的甘油缓冲液洗脱得到洗脱蛋白液。
研究表明本发明中采用低浓度PB平衡液(小于10mM)不能有效去除杂蛋白，使后续纯化压力增大；采用高浓度PB平衡液(大于120mM)使得大量杂蛋白和目的蛋白一起穿透，从而降低目的蛋白回收率，采用60mM可使杂蛋白去除达到50％以上。
本发明中采用低浓度PB洗脱液(小于150mM)不能有效洗脱目的蛋白，使得大量目的蛋白吸附于层析介质上无法回收造成损失；采用高浓度PB平衡液(大于400mM)使得大量杂蛋白和目的蛋白一起洗脱，从而降低纯化效果，因此采用200mM PB可是目的蛋白回收率达到80％以上。低甘油含量蛋白会形成聚集而不稳定，高浓度甘油又会增加溶液粘度引起超滤和层析压力增高，不利于纯化，因此采用5％的甘油溶液。
步骤D分子筛层析包括：将二步层析蛋白液上样至分子筛层析柱，以含有100～300mM NaCl和0.05‰～3‰w/v的吐温-80的10～50mM pH6.8～7.4的PBS缓冲液进行洗脱，收集UV280nm紫外吸收峰即为目的蛋白液。
优选地，采用20mM PBS、150mM NaCl和0.1‰w/v的吐温-80溶液制得pH7.2的缓冲液进行洗脱。
步骤D分子筛层析所用介质为丙烯葡聚糖凝胶S-300HR。
研究表明，本发明中吐温-80含量低于0.05‰蛋白会形成聚集而不稳定，高含量吐温-80会存在干扰蛋白含量检测，同时高含量吐温-80作为注射剂添加剂会引起副反应，因此在满足工艺要求前提下吐温-80含量越低越好。
在本发明的一个具体实施方式中，CA10病毒样颗粒的制备方法如下：
细胞经高压匀浆1300bar破碎两次，通过深层过滤或者7000rpm，40min离心收获澄清液；将澄清液采用50mm Tirs和250mM NaCl形成的缓冲液以及300KD膜包超滤，收获回流液。回流液经过离子交换层析，收集洗脱液即为一步层析蛋白液；再采用500mM PB稀释一步层析蛋白液PB浓度至60mM，经过羟基磷灰石层析，采用200mM PB的缓冲液洗脱，收集洗脱液即为二步层析蛋白液，经二步层析蛋白液采用10～50mM pH6.8～7.4的PB缓冲液、100～300mM NaCl溶液和0.05‰～3‰w/v的吐温-80缓冲液纯化，收集UV280nm吸收值，即为目的蛋白(VLP蛋白)纯化液。
第四方面，本发明提供按照上述方法制得的CA10病毒样颗粒在制备手足口疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供一种手足口病疫苗，按照上述方法制得的CA10病毒样颗粒经氢氧化铝佐剂吸附制成疫苗，VLP蛋白含量为5～40μg/ml，氢氧化铝佐剂含量0.30～0.60mg/ml，pH值为6.0～7.4。
优选地，每剂(0.5ml)人用疫苗中含有：
CA10病毒样颗粒(按蛋白质计算)2.5-20μg
铝佐剂(按铝离子计算)0.15～0.30mg
该疫苗具有良好的免疫原性、安全性、免疫特性和生物学活性，不会引起逆毒和潜在的RNA致癌风险。工艺简单，不使用超速离心机大型设备，更易于大规模制备和纯化。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)易于获得高效表达菌株。本发明将CA10的P1及3CD蛋白基因序列进行了优化设计，构建了高效表达CA10病毒样颗粒的重组表达载体，通过汉逊酵母表达系统实现了病毒样颗粒(VLP或VLPS)的高效表达。
(二)表达菌株稳定性好。所述重组表达载体能与酵母宿主细胞的染色体基因组DNA发生同源重组，载体稳定性好，不易丢失；所述发酵表达产物贮存于过氧化物酶体中，使其免受蛋白酶的降解。
(三)本发明的CA10病毒样颗粒适于制备疫苗。本发明所述蛋白质在汉逊酵母体内能够正确进行加工修饰和折叠，无过度糖基化现象。发酵表达产物经过纯化后，经电镜观察纯化样品呈现病毒样颗粒，颗粒直径在30nm左右，颗粒完整、规则。本发明提供CA10病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，能够用于制备VLP疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。
(四)本发明通过精心设计的纯化工艺可获得高纯度、高产量的VLP样品。本发明通过将重组表达的工程菌高密度发酵培养和甲醇诱导表达CA10病毒样颗粒蛋白，离心收集菌体进行高压均浆破碎，上清液经超滤、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析等纯化后获得。本发明采用超滤，三步层析，操作简单，工艺可控性强，抗原回收率高，不使用超速离心机大型设备，更易于大规模制备和纯化。
附图说明
图1为本发明实施例1中重组汉逊酵母工程菌株筛选部分菌株诱导表达蛋白质的Western blot检测结果。
图2为本发明实施例2中工程菌CA10-W在诱导后不同时间(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44h)的样品进行蛋白质Western blot检测，M为低分子量蛋白标准(北京全式金生物技术有限公司)。
图3为本发明实施例3中HPLC纯度检测结果。
图4为本发明实施例3中纯化的CA10病毒样颗粒动态光散射图谱。
图5为本发明实施例3中纯化的CA10病毒样颗粒透射电镜照片(放大倍数：120000)。
图6为本发明实施例7中CA10病毒样颗粒疫苗免疫血清保护效果。
具体实施方式
本发明提供CA10病毒样颗粒的制备及纯化方法、在疫苗领域中的应用。通过将重组表达的汉逊酵母工程菌高密度发酵培养和甲醇诱导表达CA10病毒样颗粒蛋白，离心收集菌体进行高压均浆破碎，上清液经超滤、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析等纯化后获得。本发明提供的CA10病毒样颗粒及其制备的疫苗具有良好的免疫原性、安全性、免疫特性和生物学活性，工艺简单，纯化采用层析方法，相比密度梯度离心，更利于线性放大，并可以大规模制备和纯化，并可得到高纯度(大于99％)的VLP蛋白原液，可用于制备预防CA10感染的疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。
本发明首先提供一种从汉逊酵母表达系统获得表达A10病毒样颗粒的高效菌株，包括以下步骤：
(1)基因序列优化合成：将编码CA10病毒的P1及3CD蛋白的核苷酸序列去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。应用汉逊酵母偏爱密码子进行序列优化合成。优化后的CA10病毒P1和3CD基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
(2)重组表达载体构建：将优化合成的P1及3CD基因经EcoRI、BamHI双酶切分别与经EcoRI/BamHI双酶切的表达载体PMV-05(载体PMV-05的构建方法参见ZL201210592813.5)进行构建分别获得PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体，之后再将PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体分别进行SacI/XhoI、SacI/SalI酶切构建获得PMV-05-P1-3CD共表达载体。
(3)CA10重组汉逊酵母工程菌株获得：将重组共表达载体PMV-05-P1-3CD经电穿孔转化至汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞AU-0501(菌株参见ZL201210592813.5，保藏编号CGMCC No.7013)，经稳定化培养、筛选获得CA10重组汉逊酵母工程菌株。
本发明还提供一种从汉逊酵母表达系统中表达的CA10病毒样颗粒的纯化方法，更利于线性放大，并可以大规模制备和纯化，并可得到高纯度(大于99％)的VLP蛋白(病毒样颗粒疫苗)原液，可用于制备预防CA10感染的疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。
CA10病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将含CA10外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵；
(2)破碎工程菌，目的产物澄清、超滤；
(3)离子交换层析；
(4)羟基磷灰石层析；
(5)分子筛层析。
采用上述方法可获得高纯度(大于99％)的VLP原液，用于人用疫苗制备。本发明采用三步层析，工艺简单，抗原回收率高达40％以上，生产工艺可控性强，可规模化生产，具有很高的社会价值和经济价值。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。“‰”，是指1000mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1 CA10重组汉逊酵母工程菌的获得
根据近期流行的柯萨奇病毒A10型毒株的P1及3CD蛋白的核苷酸序列，应用Vector软件对P1及3CD基因序列按照汉逊酵母偏爱密码子进行优化设计，以提高其表达量。
优化过程中去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。为避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率，加上酶切位点的考虑，在保证氨基酸不变，某些位置的基因序列做了适当调整。优化后的CA10病毒P1和3CD基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
本发明利用表达载体PMV-05进行CA10重组表达载体构建，具体的将优化合成的P1及3CD基因经EcoRI、BamHI双酶切分别与经EcoRI/BamHI双酶切的表达载体PMV-05进行构建分别获得PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体，之后再将PMV-05-P1、PMV-05-3CD重组表达载体分别进行SacI/XhoI、SacI/SalI酶切构建获得PMV-05-P1-3CD共表达载体。
本发明应用已有专利技术的汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501进行CA10重组汉逊酵母工程菌株的筛选，具体的为将重组共表达载体PMV-05-P1-3CD经电穿孔转化至汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞AU-0501，经稳定化培养，应用PCR技术、SDS-PAGE及WB等方法筛选获得CA10重组汉逊酵母工程菌株。
CA10重组汉逊酵母工程菌株筛选部分菌株诱导表达Western blot检测结果见图1。其中，1：阴性对照；2-5：PMV-05-P1转化菌株；6-14：PMV-05-P1-3CD转化菌株。需要说明的是，3CD是个蛋白酶，可以将P1蛋白切割后组装成VLP，3CD蛋白酶在后续纯化中被去除。并不是所有转化子中的P1蛋白都可以被3CD蛋白酶有效切割并组装成VLP。
Western blot结果显示：PMV-05-P1-3CD转化菌株的表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在33KD处有较为明显的反应条带，说明筛选获得CA10重组汉逊酵母表达菌株(高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌)。
从中选出一株可稳定表达目的蛋白，且蛋白表达量最高的工程菌--多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)CA10-W，送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号CGMCC No.19850，保藏日期2020年5月20日。
实施例2重组CA10酵母表达菌株在30L发酵罐中发酵培养
将菌株CA10-W接种到100ml一级种子培养基(0.67％酵母氮源培养基，0.5％硫酸铵，2％葡萄糖)中，在33℃，200rpm摇床振荡培养18～22h。取一级种子培养液接种于1000ml二级种子培养基中，在33℃，200rpm摇床振荡培养21～23h。将二级种子培养液接种至30L发酵罐中，氨水调节发酵液pH值维持在5.0+0.5，发酵温度为30±1℃，转速控制在350-750rpm，空气流速0.5-1.0m3/h，高密度发酵需要纯氧补充，溶氧控制在20-60％，16～18h时发酵培养基中碳源耗尽，补加甘油共计2.0L，菌体生长共计26～28h左右，湿菌重可达0.3-0.4g/ml左右；去阻遏阶段：设置搅拌转速750rpm，空气流速1.0m3/h，溶氧控制在20-60％，加入1L去阻遏液(去阻遏液为甲醇与甘油的混合液，甘油与甲醇的体积比为1:4)进行去阻遏培养，时间在发酵36-41h(共计11-13h)之间；诱导阶段：时间在发酵41-86h(40-44h)之间进行甲醇诱导，溶氧维持在20～40％左右。发酵结束：82-86h时，待甲醇消耗完全，溶氧上升至80％以上，发酵结束，降温至2～8℃后下罐，湿菌重维持在0.26-0.30g/ml。
汉逊酵母表达的CA10病毒样颗粒的鉴定：取上述诱导后不同时间(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44h)的样品进行蛋白质免疫印迹(Western blot)检测，用兔抗CA10-VP1多克隆抗体(所述多克隆抗体的制备方法如下：采用大肠杆菌表达CA10-VP1蛋白经纯化后，加入弗氏佐剂经四次免疫兔子，分离血清，用ProteinA进行纯化获得)作为一抗，使用HRP-羊抗兔-IgG(Sigma公司)作为二抗，DAB显色，结果如图2所示。
Western blot结果显示：表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在33KD处有较为明显的反应条带，说明在酵母细胞内能够很好地表达外源蛋白。
重组CA10病毒样颗粒发酵表达量测定：将兔多抗稀释1000倍，取100μl加样于96孔酶标板孔内，4℃包被过夜。除净包被液，加满洗涤液PBST洗涤酶标板。用封闭液(1％BSA的PBST液)加满酶标板37℃孵育2h。将破碎后离心收集的上清液和参考品进行梯度系列稀释，除净封闭液每孔加入100μl待检样品和参考品(参考品起始浓度为100ng/ml)，37℃孵育1h。加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl HRP标记的鼠单抗(1:5000稀释)37℃孵育1h。除净酶标液，加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl TMB显色液，37℃避光作用15分钟。每孔加入50μl 2mol/L H2SO4终止。用酶标仪测定OD450nm值，并采用双平行线法计算抗原含量。测定结果如表1所示。
表1发酵破碎液抗原含量(ELISA法)检测结果
ELISA测定结果显示：发酵细胞破碎液中CA10病毒样颗粒的抗原含量225μg/ml。汉逊酵母细胞表达的CA10病毒样颗粒具有较高的表达量。
实施例3 CA10病毒样颗粒的分离纯化
细胞收集：收集菌株CA10-W发酵液，6500rpm离心收集沉淀，采用细胞洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
破碎：将收集得到的汉逊酵母细胞，重悬于细胞裂解缓冲液中(50mM Tris，2mMEDTA-Na2，500mM NaCl，2mM PMSF，0.05％吐温-80，pH8.0)，使用高压匀浆机在压力1300bar的条件下破碎细胞2次，细胞破碎率达85％以上。
澄清：将破碎后的细胞液深层过滤，经采用洗液50mM Tris，2mM EDTA-Na2，500mMNaCl，0.05％吐温-80，pH8.0洗滤膜包，过滤流速为1200ml/min/m2，收集澄清液。
超滤：将收集的澄清液以300KD的膜包采用50mM Tris+250mM NaCl+5％甘油(pH8.0)进行超滤以除掉小分子物质，收集超滤液，即为粗纯产物。
离子交换层析：以Capto Q层析介质为例，采用50mM Tris+250mM NaCl+5％甘油(pH8.0)平衡5个柱体积后上样，收集穿透液UV280nm紫外吸收峰，即为一步层析蛋白液。采用1mol/L NaOH再生层析介质。
羟基磷灰石层析：一步层析蛋白液中加入500mM PB溶液至终浓度为60mmol/L PB。以60mM PBS+5％甘油溶液平衡(pH8.0)平衡5个柱体积后上样，继续平衡2个柱体积，采用200mM PBS+5％甘油溶液洗脱(pH8.0)，收集洗脱液UV280nm紫外吸收峰，即为二步层析蛋白液。
分子筛层析：采用Sephacryl S-300HR填料，以20mM PB(pH6.8)和150mM NaCl溶液和0.1‰吐温-80缓冲液进行纯化二步层析蛋白液，收集UV280nm紫外吸收峰即为目的蛋白液，采用HPLC检测蛋白液纯度为100％，检测结果如图3所示，保留时间为7.242min对应的峰为VLP，保留时间为9.621min、10.183min对应的峰为溶剂峰。
目的蛋白浓度检测(Lowry法)：精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液(200μg/ml)0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，同时量取2倍稀释纯化蛋白液1ml于试管中，分别加5ml碱性铜液，0.5ml酚试剂，于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，计算待检测蛋白液浓度。检测结果如表2所示。
表2纯化蛋白浓度(Lowry法)检测结果
Lowry法检测结果获得纯化蛋白终浓度为315.2μg/ml。
目的蛋白液动态光散射分析：取经纯化的CA10蛋白液适量加入样品池中，设置温度25℃，平衡时间90s，设置为自动循环次数，开始测量，对结果分析。结果表明，重组CA10病毒样颗粒完整，颗粒直径在24～30nm分布大于99％，PDI为0.08，动态光散射图谱如图4所示。
目的蛋白液电镜分析：取经纯化的CA10蛋白液适量滴加于铜网上，避光保存5min，除净多余液体，用1％磷钨酸染色2min，通过透射电镜(TEM)对CA10VLPs进行分析。结果表明CA10蛋白呈现病毒样颗粒，具有天然病毒的正二十面体结构，病毒颗粒直径在30nm左右，颗粒完整规则(图5)。
目的蛋白液抗原含量测定(双抗夹心ELISA)：将兔多抗稀释1000倍，取100μl加样于96孔酶标板孔内，4℃包被过夜。除净包被液，加满洗涤液PBST洗涤酶标板。用封闭液(1％BSA的PBST液)加满酶标板37℃孵育2h。除净封闭液每孔加入100μl待检样品和参考品(初始浓度为100ng/ml)，37℃孵育1h。加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl HRP标记的鼠单抗(1:5000稀释)37℃孵育1h。除净酶标液，加满洗涤液PBST洗涤酶标板3次。每孔加入100μl TMB显色液，37℃避光作用15分钟。每孔加入50μl 2mol/L H2SO4终止。用酶标仪测定OD450nm值，并采用双平行线法计算抗原含量。双抗夹心ELISA检测结果如表3所示。
表3双抗夹心ELISA检测结果
实施例4重组CA10病毒样颗粒疫苗的制备
主要指标控制：抗原(CA10病毒样颗粒)含量为20μg/ml；铝含量控制在0.40-0.60mg/ml；pH值控制在6.6-7.4。
制备方法：将自制的氢氧化铝佐剂，采用无菌的0.9％氯化钠溶液，稀释至0.50mg/ml。向佐剂中加入缓慢滴加纯化CA10原液，使之充分吸附，疫苗制备完成。制备疫苗检测标准及检测结果如表4所示。
表4重组CA10病毒样颗粒疫苗的检测结果
表4结果显示，重组CA10病毒样颗粒疫苗检测指标均符合检测标准。
实施例5重组CA10病毒样颗粒疫苗的免疫原性(ED50)试验
试验疫苗：实施例3制备的含有氢氧化铝佐剂的重组CA10类病毒颗粒疫苗。
试验动物：挑选18-22g的SPF级NIH小鼠50只，购自中国食品药品研究研究。
动物免疫：将倍比稀释好的2、0.5、0.125、0.03125μg/0.5ml的疫苗、氢氧化铝佐剂，分别注射10只小鼠，每只腹腔注射0.5ml，免疫28天后摘眼球取血。将采集的血液置37℃放置1h，4℃静置3-4h，4000rpm离心10min，吸取上清待检。
中和抗体检测：将血清样本采用2％新生牛血清的MEM培养液以1：8比例稀释，56℃水浴锅灭能30分钟。采用96孔细胞培养板，每孔加入50μl稀释液。每孔加入相应样品50μl，排枪由A行混匀后吸50μl至B行混匀，依次混匀稀释至D行弃取50μl(将CA10病毒攻击毒种系列稀释至100CCID50/0.05ml，取50μl垂直悬滴入每孔，将细胞培养板轻拍混匀，至37℃中和2h。用消化液消化RD细胞(细胞提前复苏扩增)，制备浓度为2×105个/ml的细胞悬液，每孔(包括病毒回滴孔)分别加入0.1ml细胞悬液，混匀，放入35℃CO2孵箱中孵育培养。使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以抑制50％细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。6～7天判定最终结果。根据检测结果，抗体阳转率如表5所示。
表5抗体阳转率计算结果
根据Reed-Muench法计算：ED50＝0.28(μg)
由小鼠ED50实验结果可知，本发明制备的CA10病毒样颗粒疫苗仅0.28μg免疫小鼠后即可使抗体阳转率达到50％，因此本发明的CA10病毒样颗粒具有较强的免疫原性。
实施例6重组CA10病毒样颗粒疫苗异常毒性试验
疫苗样品：实施例3制备的重组CA10病毒样颗粒疫苗。
实验动物：18-22g的SPF级KM小鼠10只，250-350g的SPF级Hartley豚鼠4只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：注射前称量每只实验动物体重，小鼠为18-22g，豚鼠为250-350g。疫苗注射5只小鼠和2只豚鼠，小鼠腹腔注射0.5ml/只，豚鼠腹腔注射5.0ml/只，观察7天。同时设同批动物空白对照。合格标准：观察期内空白对照和实验组动物健存，无异常反应，到期每只动物体重增加。动物试验情况如表6所示。
表6动物实验情况
结果表明，观察期内空白对照和实验组动物健存，无异常反应，第8天每只动物体重均增加。证明重组CA10病毒样颗粒疫苗无异常毒性，试验动物安全性较好。
实施例7 CA10病毒样颗粒疫苗免疫血清保护效果研究
试验血清：实施例3制备的CA10病毒样颗粒疫苗小鼠获得的免疫血清。
实验动物：1日龄的Blab/c乳鼠5窝，SPF级，购自中国食品药品检定研究院。
实验方法：分别腹腔攻击50μl病毒(CA10病毒，毒株来源：FZ-2014KY012321，病毒滴度：8.5lgCCID50/ml)，同时在1小时内分别腹腔免疫50μl中和抗体效价为341.33U、56.89U、9.48U、1.58U的CA10病毒样颗粒疫苗小鼠免疫血清以及阴性对照(病毒培养液)，各1窝乳鼠，每天记录乳鼠发病及死亡情况，连续观察21天，计数观察期末各组乳鼠的发病及死亡情况。
试验结果如图6所示，对照组乳鼠全部死亡，试验成立。疫苗组均表现出不同的保护效果，按照免疫血清效价为341.33U、56.89U、9.48U、1.58U，重组CA10病毒样颗粒疫苗的保护率分别为100％、100％、100％、50％，按Reed-Muench法计算平均半数动物保护中和抗体效价(ED50)小于1.58U。重组CA10病毒样颗粒疫苗在1日龄乳鼠中具有较好的免疫保护效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京民海生物科技有限公司
<120> 高效表达CA10病毒样颗粒的汉逊酵母工程菌及其应用
<130> KHP201110019.5
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2616
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggtgccc aggtgtctac cgagaagtct ggttctcacg agaccaagaa cgtggccacc 60
gagggttcta ccatcaactt caccaacatc aactactaca aggactctta cgccgcctct 120
gcctctagac aggacttcgc ccaggaccca gccaagttca ccagaccagt gctggacacc 180
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<211> 1944
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ggttactcta acgaggccgt gtctctgatc gagggtatca accacaccca ccacgtgtac 1380
agaaacaaga cctactgcgt gctgggtggt atgccatctg gttgctctgg tacctctatc 1440
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