一种补骨脂甲素在制备预防或治疗耳蜗毛细胞损伤药物中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种耳穴贴豆，该耳穴贴豆可预防娱乐性噪音所造成的耳损伤。
(二)背景技术
噪声性听力损伤又称噪声性耳聋，是由于长期接触噪声刺激所引起的缓慢的、进行性的感音神经性耳聋。娱乐性噪音损伤指由于不合理的使用手机、MP3等带有耳机的音频设备和身处KTV、酒吧等噪声较大的娱乐场所所致的耳损伤。国内外的研究皆证明，长时间、大音量地接触娱乐性噪音，对耳蜗毛细胞将造成严重损伤。而每个人的耳蜗毛细胞数量都是固定的，其没有再生能力，一旦损失就会对使用者的听力带来不可逆转的伤害。听力损失过大将对我们个人和社会都产生极大的影响，包括身体与功能、社会和情绪及经济等方面影响。
外耳廓上密集地分布着许多穴位，简称“耳穴”。通过耳穴定点的按压，可以刺激穴位，由“经络”把该物理信息传导到相应脏器，调节该脏器的运行机能，并作出功能性的调整来保卫自身，起到防病治病的作用。王不留行籽贴压与磁珠贴压是本发明的原型，主要是把籽粒贴于耳部表皮，相对安全，经过中医几百年的临床实践，对失眠、高血压、冠心病术后心绞痛和耳鸣等各种疾病具有保健和辅助治疗的作用。但关于耳穴贴的剂型改良和深层的保健机理，一直未见较好的研究和开发。现存的耳穴疗法仅通过“压”和“磁”等物理手段刺激穴位，并没有联合有效药物经皮吸收途径进行治疗。
补骨脂(Psoralea corylifolia Linn.)为豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，是临床常用中药，其性温，味苦，归肾、脾经，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的作用。查阅文献发现，补骨脂中鉴定所含有的化合物主要为香豆素类、黄酮类、单萜酚类等。补骨脂中表现出了多样的生物活性。其中，单萜酚类是抗肿瘤及细胞增殖抑制、抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁、肝保护的物质基础。补骨脂甲素(化合物结构如图1所示)作为补骨脂黄酮类中主要成分之一，具有抗肿瘤活性，清除ABTS自由基作用以及较强的α-葡萄糖苷酶抑制作用。本发明首次发现补骨脂甲素具有保护多种原因导致的耳蜗毛细胞损伤的作用。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种补骨脂甲素载药微丸及其制备预防噪音性听力损伤耳穴贴中的应用，采用负载一定浓度补骨脂甲素的麦饭石微丸代替传统的王不留行籽及磁石，结合含药水凝胶层，制备耳穴贴，既能按压刺激耳穴，又能稳定有效的释放具有保护耳蜗毛细胞的补骨脂甲素进入体内，起到共同预防耳蜗毛细胞损伤的作用，从而保护听力。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种补骨脂甲素在制备预防或治疗耳蜗毛细胞损伤药物中的应用。
本发明所述药物为预防噪音性听力损伤耳穴贴豆。
本发明所述的耳穴贴豆为补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆，所述补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆是将补骨脂甲素载药微丸黏贴于补骨脂甲素水凝胶上，室温阴干24h获得的；所述补骨脂甲素水凝胶由如下质量配比原料混合制成：补骨脂甲素0.002-0.005％、聚丙烯酸钠(AH-105X)4.0-7.0％、甘羟铝0.1-0.25％、酒石酸0.1-0.3％、甘油7.2-18.0％、聚乙二醇(PEG 400)2.4-5.0％、羧甲基纤维素钠(CMC-NA)0.1-1％、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2NA)0.1-1％、聚吡咯烷酮(PVP K90)0.6-2.4％、氮酮0.1-1.2％，余量为去离子水，总量为100％；所述补骨脂甲素载药微丸是将载体用载药包衣液包衣后再采用薄膜包衣液包衣制成；所述载体为麦饭石微丸；所述载药包衣液由如下质量配比原料混合制成：补骨脂甲素0.02-0.05％、粘合剂0.2-0.5％、溶剂为体积浓度70％乙醇水溶液；所述粘合剂为羟丙基甲基纤维素(HPMC K15M)或羧甲基纤维素钠(CMC-Na)；所述薄膜包衣液由如下质量配比原料混合制成：欧巴代7.2％、硬脂酸镁1％，溶剂为去离子水。
进一步，所述补骨脂甲素水凝胶由如下质量配比原料混合制成：补骨脂甲素0.003-0.004％、聚丙烯酸钠(AH-105X)5.0-7.0％、甘羟铝0.1-0.2％、酒石酸0.2-0.25％、甘油7.2-12％、聚乙二醇(PEG 400)4.0-5.0％、羧甲基纤维素钠(CMC-NA)0.2-0.4％、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2NA)0.2-0.3％、聚吡咯烷酮(PVP K90)0.6-1.5％、氮酮0.1-1.2％，溶剂为去离子水，总量为100％。
更进一步，所述补骨脂甲素水凝胶由如下质量配比原料混合制成：补骨脂甲素终浓度为0.002％，聚丙烯酸钠(AH-105X)5.4％、甘羟铝0.19％、酒石酸0.23％、甘油15.77％、聚乙二醇(PEG 400)4.5％、羧甲基纤维素钠(CMC-NA)0.33％、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2NA)0.25％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K90)0.62％、氮酮0.6％，余量为去离子水，总量为100％。
进一步，所述载体为直径2mm的多孔麦饭石微丸(食品安全级)。
进一步，所述载药包衣液由如下质量配比原料混合制成：补骨脂甲素0.02-0.04％、羟丙基甲基纤维素(HPMC K15M)0.2-0.4％、溶剂为体积70％乙醇水溶液；最优选为补骨脂甲素0.03％、羟丙基甲基纤维素(HPMC K15M)0.3％、溶剂为体积70％乙醇水溶液。
进一步，所述补骨脂甲素水凝胶按如下方法制备：按配方量，将聚丙烯酸钠、羧甲基纤维素钠、乙二胺四乙酸二钠和甘羟铝混合，用研钵研均后，加入甘油、聚乙二醇，低速搅拌均匀，即为油相；将酒石酸溶解于去离子水中，加入聚乙烯吡咯烷酮搅拌10min，即为水相；将全部水相倒入全部油相中，搅拌15min，加入补骨脂甲素与氮酮，混合均匀，获得补骨脂甲素水凝胶。
进一步，所述补骨脂甲素载药微丸按如下方法制备：(1)按配方量，将补骨脂甲素、粘合剂(优选羟丙基甲基纤维素)与体积浓度70％乙醇水溶液混合，50Hz超声助溶15min后，再低速搅拌45min混合均匀，制成载药包衣液；将载药包衣液采用流化床底喷方式对载体进行包衣，在物料温度33-35℃、风机频率10-15Hz、雾化压力0.1-0.3kPa、蠕动泵转速1.0～2.0ml/min(优选物料温度35℃、风机频率15Hz、雾化压力0.2kPa、蠕动泵转速1.5ml/min)条件下包衣2h，获得载药微丸；(2)按配方量，将欧巴代粉末溶于去离子水中，加入硬脂酸镁，低速搅拌45min，制成薄膜包衣液；(3)将薄膜包衣液采用流化床底喷方式对步骤(1)制备的载药微丸进行包衣，在物料温度33-35℃、风机频率10-15Hz、雾化压力0.1-0.3kPa、蠕动泵1.0～2.0ml/min条件下(优选物料温度35℃、风机频率15Hz、雾化压力0.2kPa、蠕动泵转速1.5ml/min)包衣2h，获得补骨脂甲素载药微丸。
本发明所述的耳穴贴豆是将补骨脂甲素载药微丸通过补骨脂甲素水凝胶固定于内耳穴，每12h更换一次贴剂；采用轻柔的按摩手法，每日自行按压贴豆刺激内耳穴3-4次；每七天为一个疗程。
本发明采用含有效药物的骨架微丸，代替传统王不留行籽、磁石等传统耳穴贴介质；并优化流化床技术参数，制备质量均一的麦饭石载药微丸；采用含药水凝胶层代替传统医用胶布层；通过考察透皮吸收性能，优化凝胶配比，制备具有较好透皮释药功能的医用水凝胶；以抗耳蜗毛细胞氧化损伤为主要药效评价方式，优选预防耳蜗毛细胞损伤的中药单体及其用药浓度范围；最终制备一款集按压刺激耳穴穴位与药物透皮吸收为一体，有明确预防耳损伤效果的含药耳穴贴豆类产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆的有效成分来源于补肾类中药补骨脂，与中医传统的耳穴治疗手段相结合制成耳穴贴豆，经药效学验证，该制剂对多种原因所致的耳蜗细胞损伤进行有针对性的保护作用，既能按压刺激耳穴，又能稳定有效的透皮吸收药物，联合保护听力。
(四)附图说明
图1为补骨脂甲素结构图。
图2为载体照片及耳贴示意图，其中A为直径2mm麦饭石，放大倍数16.9×(蔡司体视显微镜)，B为麦饭石球体表面微孔，放大倍数163×(蔡司体视显微镜)，C为载药微丸，放大倍数16.9×(蔡司体视显微镜)，D为耳贴整体示意图。
图3为补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆整体示意图(A)及使用示意图(B)。
图4为MTT法检测补骨脂甲素对对乙酰氨基酚诱导损伤的HEI-OC1细胞存活率的影响；注:与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
图5为流式凋亡法检测补骨脂甲素对对乙酰氨基酚诱导损伤的HEI-OC1细胞凋亡率的影响。
图6为流式细胞法检测补骨脂甲素干预后对对乙酰氨基酚损伤的小鼠耳蜗毛细胞的ROS活性氧产生的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：补骨脂甲素预防保护耳蜗毛细胞损伤的作用评价
研究表明，高强度噪声暴露或耳毒性药物暴露可引起耳蜗毛细胞的凋亡、变性、坏死以及中枢听觉处理功能障碍，而耳蜗外毛细胞死亡是噪声引起耳蜗毛细胞损伤最早出现和最主要的病理改变。其中活性氧(ROS)的积累是听力受损的原因。故以下将补骨脂甲素预防保护后，对耳毒性药物对乙酰氨基酚刺激后耳蜗毛细胞(HEI-OC1)损伤模型进行MTT细胞活性检测、流式细胞凋亡检测以及细胞内活性氧ROS水平的检测，以此来验证补骨脂甲素的耳损伤预防保护作用。
1、材料：
补骨脂甲素母液的制备：取补骨脂甲素0.0050g，溶解于500μl二甲基亚砜(DMSO)中，制成20mM的补骨脂甲素母液。
对乙酰氨基酚母液的制备：取对乙酰氨基酚0.0378g，溶解于630μl DMSO中，制成20mM的对乙酰氨基酚母液。
MTT染色液，5mg/mL；DMEM培养液(Gibco)；PBS(pH＝7.2～7.4)；胰酶。FBS胎牛血清(杭州四季青)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD)试剂盒；活性氧检测试剂盒(碧云天)。
2、实验细胞株：小鼠耳蜗毛细胞(HEI-OC1)，购自生物风有限公司(原株购自豪斯耳科学院House Ear Institute，编号；CVCL_D899)。
3、细胞株培养条件：33℃，10％CO2。
4、实验方法：
取对数生长期的HEI-OC1细胞，将细胞密度调整至2×104/mL并接种于96孔板上。每孔加入100μL高糖DMEM完全培养基，置于33℃、10％CO2恒温培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，更换为含体积浓度2％FBS的DMEM高糖培养液，继续培养24h后，更换为含体积浓度5％FBS的DMEM高糖培养液(100μL/孔)，将96孔板设置调零孔，并分为空白组、实验组、对照组(即损伤模型组)，其中实验组分为补骨脂甲素高浓度组、补骨脂甲素中浓度组、补骨脂甲素低浓度组，每组设置3个平行孔。
实验组分别加入补骨脂甲素母液，使其终浓度分别为100nM(高)、10nM(中)、1nM(低)。继续培养24h后，在实验组和对照组中分别加入含终浓度400μM对乙酰氨基酚和体积浓度5％FBS的DMEM高糖培养液(100μL/孔)，空白组中加入含体积浓度0.1％DMSO的不含药DMEM高糖培养液并在培养箱中继续培养24h。
5、补骨脂甲素干预后对对乙酰氨基酚损伤的小鼠耳蜗毛细胞的存活率的影响
步骤4每孔加入新鲜配制的MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养4h后，吸去板内上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速震荡10min(60次/min)后，用酶联免疫标定仪测定570nm处吸光度(A)值。根据吸光度计算每组的细胞存活率，每组设三个复孔。
细胞存活率(％)＝[(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)]×100％
采用MTT法初步检测确定补骨脂甲素对对乙酰氨基酚诱导损伤的HEI-OC1细胞具有保护作用，见图4。实验结果表明，对乙酰氨基酚(400μM，24h)诱导损伤的模型中，对乙酰氨基酚损伤模型组(0nM补骨脂甲素)细胞存活率为(87.854±5.2178)％；在补骨脂甲素浓度为100，10，1nM(高、中、低剂量组)的条件下，细胞存活率分别为(94.558±4.253)％、(103.309±6.149)％、(106.922±4.350)％，与损伤模型组比，低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组具有显著差异(P<0.001)。说明1-100nM的补骨脂甲素对对乙酰氨基酚诱导的HEI-OC1细胞损伤具有保护作用。
6、补骨脂甲素干预后对对乙酰氨基酚损伤的小鼠耳蜗毛细胞的凋亡率的影响
步骤4，弃去培养液，PBS清洗一次后，每孔加入300μl胰酶进行消化，根据FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I(BD)试剂盒所示说明，对细胞进行处理后，进行FITC及PI的双色标记，并设立单染组与空白不染组。在冰上避光孵育染色15min后，流式细胞仪检测各组HEI-OC1凋亡。
数据分析：Annexin V FITC/PI流式细胞术将实验样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。以FITC和PI荧光作双参数点图，细胞分为4个区，1区：机械损伤细胞(Annexin VFITC-/PI+)；2区：凋亡晚期或坏死细胞(Annexin V FITC+/PI+)；3区：活细胞(Annexin VFITC-/PI-)；4区：早期凋亡细胞(Annexin V FITC+/PI-)。计数4群细胞比例并分别在不同浓度补骨脂甲素组与损伤模型组进行比较，见图5。
实验结果：补骨脂甲素低剂量组(1nM)及中剂量组(10nM)细胞的活细胞率分别为76.21％及78.33％，与损伤模型组的活细胞率70.10％相比，活细胞率高且凋亡率较损伤模型组少。结果显示补骨脂甲素对对乙酰氨基酚诱导损伤的HEI-OC1细胞具有保护作用。
7、补骨脂甲素干预后对对乙酰氨基酚损伤的小鼠耳蜗毛细胞的ROS活性氧产生的影响
实验原理：活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF(可用FITC通道检测出)。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
实验步骤：步骤4后，收集各组细胞。按照体积比1:1000用无血清DMEM培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106/mL，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清DMEM细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。流式细胞仪FITC通道检测各组HEI-OC1细胞内的ROS产生水平，结果见图6。
数据分析：利用不装荧光探针的对照组(如图6)将细胞划分阴性与阳性细胞群，通过阴性细胞群与阳性细胞群的比例差别，判断ROS产生的水平不同(荧光强度越强、阳性细胞群比例越高即代表ROS产生水平越高)。
实验结果：空白组、模型组阳性细胞群比例分别为5.98％、27.92％，即说对乙酰氨基酚损伤后的模型组HEI-OC1细胞中ROS水平显著升高。在补骨脂甲素高、中、低剂量组的预防条件下，阳性细胞群比例分别为24.83％、18.72％、19.54％，结果均小于模型组细胞的阳性比例，且中剂量组阳性细胞比例最低。结果可表明，补骨脂甲素干预后使对乙酰氨基酚损伤的小鼠耳蜗毛细胞的ROS活性氧产生水平降低，即证明其可有效减少耳蜗毛细胞内活性氧(ROS)的积累，减少细胞的损伤。
实施例2：补骨脂甲素载药微丸的制备
1、材料
载体为直径约2mm的麦饭石微丸，学名石英二长岩(购自河北泓耀矿产品公司)，是一种天然的硅酸盐矿物，对生物无毒、无害，主要化学成分是无机的硅铝酸盐，球体硬度大且表面含有微孔(见图2中A和B所示)，具有较强的吸附作用，为载药微丸理想骨架材料；欧巴代(购自上海卡乐康包衣技术有限公司)是一种常见的药物包衣材料，可以优化外观，改善气味，有效防光、防潮，能够增加药物稳定性。
2、仪器：电子天平、精密增力电动搅拌器、300ml烧杯、流化床(Glatt，德国)。
3、补骨脂甲素载药微丸的制备
(1)流化床液体层积法载药
补骨脂甲素包衣液配方1：补骨脂甲素0.03％、羟丙基甲基纤维素(HPMC K15m)0.3％，溶剂为体积浓度70％乙醇水溶液。
补骨脂甲素包衣液配方2：补骨脂甲素0.03％，溶剂为体积浓度70％乙醇水溶液。
补骨脂甲素包衣液配方3：补骨脂甲素0.03％、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.3％，溶剂为体积浓度70％乙醇水溶液。
分别按上述配方量配置配方1：0.03g补骨脂甲素、0.3g HPMC K15m、99.67g体积浓度70％乙醇水溶液。
配方2：0.03g补骨脂甲素、99.97g体积浓度70％乙醇水溶液。
配方3：0.03g补骨脂甲素、0.3g CMC-Na、99.67g体积浓度70％乙醇水溶液。将各配方分别在50Hz超声助溶15min后，再低速搅拌(不起泡为宜)45min混合均匀，制成不同配方的载药包衣液100g。
取3组麦饭石，每组50粒，组1总重量为0.6225g、组2总重量为0.6345g、组2总重量为0.610g，各组平均粒重如表1所示。将组1-组3麦饭石分别置于流化床包衣机内，将相同编号的配方1、配方2和配方3的100g载药包衣液采用流化床底喷方式对载体进行包衣，在物料温度35℃、风机频率15 Hz、雾化压力0.2 kPa、蠕动泵转速1.5ml/min条件下包衣2h，获得载药麦饭石，分别记为载药麦饭石1、载药麦饭石2和载药麦饭石3，载药前后麦饭石平均载药量根据公式(1)计算，见表1所示。
公式(1)：平均载药量＝(载药后总重-载药前总重)×「药物总量/(辅料总重+药物总重)]/50，其中辅料是指粘合剂，药物是指补骨脂甲素。
由表1可知：各组别的麦饭石平均粒重增量分别为0.45mg、0.05mg、0.3mg，由此可得不同辅料的载药量排序为：HPMC K15m>CMC-Na>无辅料。因此，配方1为最优选择，即最终载药包衣液的配方为补骨脂甲素0.03％、羟丙基甲基纤维素(HPMC K15m)0.3％，溶剂为体积浓度70％乙醇水溶液。每粒麦饭石颗粒平均可载40.9μg补骨脂甲素，载药后的麦饭石见图2中C所示。
表1、载药前后的麦饭石的重量变化及载药量
(2)薄膜包衣
薄膜包衣液质量配方：欧巴代7.2％，硬脂酸镁1％，余量为去离子水，总量为100％。
按配方量，将7.2 g欧巴代粉末溶于91.8g去离子水中，加入1g硬脂酸镁，置搅拌器上低速搅拌45 min，制成薄膜包衣液100g。
将0.645g步骤(1)制备的载药麦饭石1，置于流化床包衣机内，将薄膜包衣液100g采用流化床底喷方式对载药麦饭石进行包衣，在物料温度35℃、风机频率15 Hz、雾化压力0.2 kPa、蠕动泵2.0 ml/min条件下包衣2 h，获得补骨脂甲素载药微丸0.6644g，增重约3％，颗粒直径未明显改变。
实施例3：补骨脂甲素水凝胶的制备
1、补骨脂甲素水凝胶质量组成：
补骨脂甲素水凝胶质量组成：补骨脂甲素终浓度为0.002％，聚丙烯酸钠(AH-105X)5.4％、甘羟铝0.19％、酒石酸0.23％、甘油15.77％、聚乙二醇(PEG 400)4.5％、羧甲基纤维素钠(CMC-NA)0.33％、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2NA)0.25％、聚乙烯吡咯烷酮(PVPK90)0.62％、氮酮0.6％，余量为去离子水，总量为100％。
2、制备工艺：
(1)仪器：电子天平、精密增力电动搅拌器、300ml烧杯、刮勺、研钵。
(2)制备方法：按配方量，将5.4g聚丙烯酸钠、0.33g CMC-NA、0.25g EDTA-2NA和0.19g甘羟铝混合，用研钵研均后，加入15.77g甘油、4.5g PEG400，低速(不起泡为宜)搅拌均匀，即为油相；将0.23g酒石酸溶解于72.108ml去离子水中(测pH＝2.38)，加入0.62g PVP搅拌10min，即为水相；将全部水相倒入全部油相中，搅拌15min，加入补骨脂甲素0.002g与0.6g氮酮，混合均匀，获得补骨脂甲素水凝胶100g(pH＝6-7)，直径约8mm×8mm。
实施例4补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆的制备
将实施例3方法制备的100g补骨脂甲素水凝胶作为黏贴层，室温阴干24h后，盖上无纺布防黏膜，参照图3中A，将实施例2制备的补骨脂甲素载药微丸用补骨脂甲素水凝胶覆盖，获得补骨脂甲素水凝胶耳穴贴豆。
